Name: Instilação não invasiva de lipopolissacarídeo intratraqueal em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-31T13:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 10 s
Description: Aprenda a instilação não invasiva de lipopolissacarídeo intratraqueal em camundongos usando intubação orofaríngea. Este método minimiza trauma cirúrgico e permite avaliar respostas inflamatórias pulmonares com precisão.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No.: 81903902), pela China Postdoctoral Science Foundation (No.: 2019M663457), pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan (No.: 2020YJ0172) e pelo Xinglin Scholar Research Premotion Project da Universidade de Chengdu da TCM (No.: QJRC2022053).

O protocolo de experimentação animal foi revisado e aprovado pelo Comitê de Gestão da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Registro No. 2021-11). Camundongos C57/BL machos (20-25 g, 6-8 semanas de idade) foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram mantidos em uma câmara de animais e foram livres para beber e comer durante o experimento.
1. Preparo
<ol><li>Certifique-se de que a plataforma de intubação seja composta por uma base, um riser, um clipe de papel, dois elásticos e algumas cordas. Pegue uma corda, passe a corda através dos dois orifícios no topo do riser e amarre as duas extremidades da corda, respectivamente, às pequenas saliências no topo do riser. NOTA: Deixe espaço para a cabeça do rato passar entre a corda e os dois orifícios.</li>
	<li>Amarre dois elásticos em cada extremidade do clipe de papel e tape o clipe de papel com os elásticos na parte de trás do riser. Por fim, fixe o riser na base a 90° (Figura 1).</li>
	<li>Selecione uma cânula do tamanho e comprimento apropriados. Para um camundongo de 20−30 g, pode-se utilizar um cateter de 22 G (2,5−3,8 cm de comprimento)11. Monte a cânula em uma caneta de cânula e acenda a luz da caneta (Figura 2).</li>
	<li>Prepare pequenas pinças cirúrgicas e uma pipeta de Pasteur desinfetando-as com álcool a 70%.</li>
</ol>2. Preparação do composto de ensaio
<ol><li>Pesar e dissolver 3 mg de LPS em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,2) para formar uma solução de LPS com concentração de 3 mg/mL.</li>
	<li>Pesar e dissolver 10 mg de pentobarbital sódico em 1 ml de solução salina normal para formar uma solução de pentobarbital sódico a 1%. Filtrar-esterilizar a solução usando um filtro de seringa de 0,45 μm.</li>
</ol>3. Instilação orofaríngea não invasiva
<ol><li>Anestesiar os camundongos com injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 1% na dose de 50 mg/kg12,13. Determinar a profundidade da anestesia pela falta de resposta ao reflexo de retificação.</li>
	<li>Coloque o mouse anestesiado na plataforma de intubação. Fixar os dentes anteriores superiores com o fio e os dois antepés com os elásticos (Figura 3).</li>
	<li>Puxe a língua para fora com uma pinça e segure-a com a mão esquerda. Empurre a cânula lentamente, ao longo da boca, com a mão direita para cima, até a epiglote mandibular. Use a luz da caneta de cânula para encontrar a traqueia e insira-a lentamente na traqueia (Figura 4).</li>
	<li>Depois que a cânula tiver sido inserida na traqueia, retire a caneta de intubação lentamente e deixe a cânula dentro. Insira a pipeta de Pasteur na junta da cânula e pressione a cabeça (Figura 5). NOTA: Se o tórax do mouse protuberância, a intubação é bem-sucedida (Figura 6).</li>
	<li>Após intubação endotraqueal bem-sucedida, instilar os camundongos com 3 mg/mL de LPS a 3 mg/kg através da cânula usando uma microseringa de cabeça plana14,15 (Figura 7).</li>
	<li>Feito isso, retire a cânula e a microseringa. Retire o mouse do andaime e coloque-o em uma gaiola separadamente para recuperar. Observe o estado respiratório do camundongo até que ele tenha se recuperado e recuperado a consciência. OBS: Após 12 h após a instilação traqueal do LPS, eutanasiar os camundongos seguindo o procedimento aprovado pelo comitê de ética animal. Dosagens séricas de TNF-α e medidas de peso pulmonar seco-úmido foram realizadas usando procedimentos padrão.</li>
</ol>

<ol><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+human+amnion+epithelial+cells+through+endotracheal+instillation+against+lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Xi+Bao+Yu+Fen+Zi+Mian+Yi+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Protective effect of human amnion epithelial cells through endotracheal instillation against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice.</a> Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 33 (1), 7-11 (2017).</li>
<li>Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+lung+injury%3A+A+clinical+and+molecular+review%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+and+Lab+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute lung injury: A clinical and molecular review.</a> Archives of Pathology and Lab Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).</li>
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<li>Aramaki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+operational+tolerance+and+generation+of+regulatory+cells+after+intratracheal+delivery+of+alloantigen+combined+with+nondepleting+anti-CD4+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Induction of operational tolerance and generation of regulatory cells after intratracheal delivery of alloantigen combined with nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody.</a> Transplantation. 76 (9), 1305-1314 (2003).</li>
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<li>Yang, H., Lv, H., Li, H., Ci, X., Peng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oridonin+protects+LPS-induced+acute+lung+injury+by+modulating+Nrf2-mediated+oxidative+stress+and+Nrf2-independent+NLRP3+and+NF-%CE%BAB+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Oridonin protects LPS-induced acute lung injury by modulating Nrf2-mediated oxidative stress and Nrf2-independent NLRP3 and NF-κB pathways.</a> Cell Communication and Signaling. 17 (1), 62(2019).</li>
<li>Im, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+orthotopic+lung+cancer+mouse+model+via+thoracotomy+and+orotracheal+intubation+enabling+in+vivo+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies.</a> Laboratory Animals. 48 (2), 124-131 (2014).</li>
<li>Hamacher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+wire+guide-based+orotracheal+mouse+intubation%3A+description%2C+evaluation+and+comparison+with+transillumination%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination.</a> Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).</li>
<li>Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+orotracheal+intubation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Repeated orotracheal intubation in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), e60844(2020).</li>
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<li>Feng, Z. Comparative study of different intratracheal instillation in acute lung injury model of mice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Jilin+University%22">Jilin University</a>. , Master's Thesis (2010).</li>
<li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+acute+lung+injury+mice+model+established+by+intranasal+and+intratracheal+instillation+of+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Clinics+of+Chinese+Materia+Medica%22%5BJournal%5D)">Comparison of acute lung injury mice model established by intranasal and intratracheal instillation of lipopolysaccharide.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (02), 222-227 (2022).</li>
<li>Luckow, B., Lehmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+bronchoalveolar+lavage+in+mice+by+orotracheal+intubation+avoiding+tracheotomy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A simplified method for bronchoalveolar lavage in mice by orotracheal intubation avoiding tracheotomy.</a> BioTechniques. 71 (4), 534-537 (2021).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Inicialmente, foi realizada uma busca no interior da cavidade oral para encontrar a localização datraqueia19. No entanto, durante esse processo, descobrimos que a traqueia de camundongos C57/BL é estreita, o que dificulta encontrar a localização correta por esse método sem o auxílio de equipamentos como um endoscópio20. Após uma exploração mais aprofundada, verificou-se que a luz da lâmpada do intubador poderia penetrar na superfície do corpo, permitindo ao operador determi...

A lesão pulmonar aguda (LPA) é uma síndrome clínica comum. Sob uma variedade de fatores patogênicos, a ruptura da barreira fisiológica das células epiteliais pulmonares e das células endoteliais vasculares leva ao aumento da permeabilidade alveolar, causando diminuição da complacência pulmonar, edema pulmonar e hipoxemia grave1. A síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) é a forma mais grave de LPA. A inflamação não controlada e os danos causados pelo estresse oxidativo são considerados as principais causas de LPA e de SDRA mais grave2. Quando as células epiteliais alveolares são diretamente lesadas devido ao trauma, a cadeia de resposta inflamatória dos macrófagos alveolares é ativada, levando à inflamação nopulmão3. Globalmente, há mais de 3 milhões de pacientes com SDRA aguda por ano, e eles respondem por aproximadamente 10% das admissões em unidades de terapia intensiva; Além disso, a taxa de mortalidade nos casos graves chega a 46%4,5,6. Portanto, há necessidade de se estabelecer um modelo animal adequado de LPA para estudar sua patogênese. O camundongo é o animal experimental mais comumente usado no estudo da LPA, uma vez que seu trato respiratório pode simular bem o trato respiratório humano para estudos de LPA. Além disso, a LPA manifesta-se como infiltrado maciço de células inflamatórias, aumento da permeabilidade vascular pulmonar e edema pulmonar. As alterações nas citocinas inflamatórias no soro e na relação peso seco-úmido do pulmão refletem o grau de LPA7.
Atualmente, os principais métodos para modelagem da LPA induzida por LPS em camundongos incluem a intubação traqueal intranasal e cirúrgica 8,9. Aqui, propomos um novo método para liberar LPS na traqueia via intubação orofaríngea não invasiva. Este método usa um intubador iluminado para encontrar a traqueia do rato e, em seguida, entrega LPS na traqueia e pulmão. Este método entrega LPS aos pulmões com mais precisão do que o método intranasal de entrega. Comparado à intubação traqueal cirúrgica, esse método não requer cirurgia, evita ferimentos e reduz a dor em camundongos10. Portanto, esse método pode ser usado para estabelecer um modelo de LPA em camundongos mais convincente.

<table><tbody>Seringas de microlitro <tr><td>de Lipopolysaccharide</td><td>MERK</td><td>L4130</td><td>LPS</td></tr> SHANGHAI <tr><td></td><td>GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD</td><td></td> 10028505008124 <td>Para entregar LPS</td></tr><tr><td>Cânula de rato</td><td>RWD Life Science</td><td>803-03008-00</td><td>Cânula de rato</td></tr><tr><td>Kit de intubação de rato</td><td>RWD Life Science</td><td>903-03027-00</td><td>Incluindo uma base, um montante, um intubador, um fórceps cirúrgico e alguns pipeta de Pasteur de cordas</td></tr><tr><td></td><td>Biosharp ciências da vida</td><td>BS-XG-03</td><td>Para verificar o sucesso da intubação</td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Beijing Chemical Co., China</td><td>20220918</td><td>Para anestesiar camundongos</td></tr></tbody></table>

instilação não invasiva de lipopolissacarídeo intratraqueal em camundongos

Noninvasive Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation in Mice

O modelo de lesão pulmonar aguda (LPA) em camundongos induzida por lipopolissacarídeo (LPS) ou endotoxina ainda está entre os modelos mais comumente utilizados em estudos animais de lesão pulmonar aguda ou inflamação aguda. Os métodos atualmente mais utilizados em modelos de lesão pulmonar aguda em camundongos são a injeção intraperitoneal de LPS e a traqueostomia para a infusão traqueal de LPS. No entanto, o primeiro método não tem como alvo o pulmão e danifica outros órgãos, e o segundo método induz trauma operatório, risco de infecção e baixa taxa de sobrevida. Aqui, recomendamos um método não invasivo de intubação orofaríngea endotraqueal para instilação de LPS em camundongos. Nesse método, o LPS é introduzido de forma não invasiva na traqueia através da cavidade orofaríngea para ser instilado no pulmão com o auxílio de um aparelho para intubação endotraqueal. Este método não só garante a segmentação pulmonar, mas também evita danos e o risco de morte nos animais. Esperamos que essa abordagem se torne amplamente utilizada no campo da lesão pulmonar aguda.

O método proposto para instilação de LPS em camundongos foi verificado avaliando-se a expressão da citocina inflamatória TNF-α e a relação peso seco-úmido pulmonar 12 h após a instilação de LPS. Foram quatro grupos no experimento: controle em branco (sem tratamento), intubação cirúrgica16, intranasal17,18 e intubação orofaríngea não invasiva (n = 6). Em comparação com o grupo controle branco, os níveis séri...

Neste trabalho, propomos um protocolo para a administração intratraqueal de lipopolissacarídeo (LPS) via intubação endotraqueal orofaríngea não invasiva. Este método minimiza o trauma do procedimento cirúrgico para o animal e entrega com precisão LPS para a traqueia e, em seguida, para os pulmões.

Instilação não invasiva de lipopolissacarídeo intratraqueal em camundongos

The acute lung injury (ALI) mouse model induced by lipopolysaccharide (LPS) or endotoxin is still among the most commonly used models in animal studies of ...

Nosso protocolo propõe um novo método de liberação não invasiva de LPS da traqueia para o pulmão, com maior precisão. As pessoas que estão tentando este método pela primeira vez devem colocar muito esforço em encontrar a posição da traqueia. Para preparar a plataforma de intubação, passe a corda pelos dois orifícios e amarre suas extremidades às pequenas saliências no topo do riser.Em seguida, prenda dois elásticos em cada extremidade do clipe de papel e tape-os nas costas do riser. Finalmente, fixe o riser na base em um ângulo de 90 graus. Monte a cânula em uma caneta de cânula e acenda a luz da caneta.Em seguida, desinfete a pinça cirúrgica pequena e a pipeta de Pasteur com álcool a 70%. Para preparar a solução do composto de teste, adicione três miligramas de lipopolissacarídeo, ou LPS, em um mililitro de pH 7,2 PBS. Em seguida, dissolva 10 miligramas de pentobarbital sódico em um mililitro de soro fisiológico normal e filtre a solução usando um filtro de seringa de 0,45 micrômetro.Coloque o mouse anestesiado na plataforma de intubação. Em seguida, fixe os dentes dianteiros superiores com a barbante e os dois antepés com os elásticos. Usando uma pinça, puxe a língua para fora e segure-a.Empurre a cânula lentamente ao longo da boca até a epiglote mandibular. Localize a traqueia com a luz da caneta da cânula e insira lentamente a cânula nela. Em seguida, retire a caneta de intubação, deixando a cânula dentro.Insira a pipeta Pasteur na junta da cânula e pressione o cabeçote. Após a intubação endotraqueal bem-sucedida, usando uma microseringa de cabeça plana, instilar a solução de LPS preparada a três miligramas por quilograma de dose através da cânula. Depois de terminar, retire a microseringa e a cânula.Remova o mouse da plataforma de intubação e coloque-o em uma gaiola separada para recuperar. Observe o estado respiratório do camundongo até que ele se recupere e recupere a consciência. 12 horas após a instilação traqueal do LPS, a expressão de uma citocina inflamatória, TNF-alfa, e a relação peso seco-úmido do pulmão foram avaliadas e comparadas com outros métodos de instilação.Os níveis séricos de TNF-alfa no grupo intubação orofaríngea não invasiva estavam significativamente aumentados em comparação com o grupo controle branco. A relação peso seco/úmido do pulmão também foi aumentada, atingindo o mesmo nível do grupo intubação traqueal cirúrgica. É importante não coçar a traqueia no processo de encontrar a localização da traqueia.A técnica também pode ser usada para liberar outras drogas que precisam chegar ao pulmão de forma não invasiva.

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Biology

Biologia

Injeções intratraqueais solutos entregar diretamente para os pulmões. Este procedimento visa a entrega do instillate nas regiões distais do pulmão, e é, portanto, muitas vezes incorporadas em estudos que visam estudar alvéolos. Nós fornecemos um protocolo de sobrevivência detalhadas para a realização de injeções intratraqueais em camundongos.

Instilação traqueal direta de Solutos em pulmão de rato

Nós ilustramos não-cirúrgico de entrega de materiais de teste para os pulmões de ratos anestesiados através da traquéia. Este método permite a exposição de pulmão a patógenos virais e bacterianas, citocinas, anticorpos, miçangas, químicos ou corantes. Iremos descrever colheita e processamento dos pulmões e dos gânglios linfáticos de drenagem de pulmão (LDLNs) para citometria de fluxo.

Não-cirúrgico instilação endotraqueal de camundongos com Análise de Pulmões e Drenagem Linfática Nodes Lung por citometria de fluxo

Fonte: Radulovic, K., et al. Injeções de lipopolissacarídeo em camundongos para imitar a entrada de produtos derivados de microbianos após ruptura da barreira intestinal. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra um procedimento passo a passo para injetar lipopolissacarídeo (LPS) em camundongos intraperitonealmente para induzir inflamação sistêmica.

Injeção intraperitoneal de lipopolissacarídeo bacteriano em camundongos para estudar respostas imunes sistêmicas

A utilização de um modelo que simula a condição de doenças pulmonares em humanos é fundamental para o estudo da fisiopatologia e / ou etiologia de uma doença em particular e para o desenvolvimento da intervenção terapêutica. Aqui um método de intubação orotraqueal não invasivo que pode entregar diretamente materiais exógenos aos pulmões do rato é apresentado.

Não invasiva Intratraqueal intubação para estudar a Patologia e Fisiologia do Rato Lung

A resposta imune do hospedeiro à infecção do agente patogénico é um processo fortemente regulado. Utilizando um modelo de exposição do pulmão lipopolissacarídeo em ratos, é possível realizar avaliações de alta resolução dos complexos mecanismos associados à patogênese da doença.

A utilização de orofaringe Intratraqueal Administração PAMP e Lavagem Broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro em camundongos

A instilação intratraqueal mediada por intubação (IMIT) de reagentes é um método excelente e não invasivo para estudar doenças respiratórias, bem como um método para instilar reagentes terapêuticos diretamente no pulmão. É um método rápido e altamente reprodutível, adequado para testes pré-clínicos.

Intratraqueal (IMIT) instilação mediada por intubação: A não-invasiva, sistema de entrega Lung-specific

Este artigo apresenta um método rápido e simples para a administração de bleomicina diretamente na traquéia do mouse através de intubação. As principais vantagens deste método é que ele é altamente reprodutível, fácil de dominar, e não requer equipamento especializado ou tempos de recuperação longos.

Um método melhorado para rápida de intubação da traqueia em Ratos

Demonstramos o procedimento para inoculação intratraqueal de Haemophilus influenzae no trato respiratório inferior de camundongos. Esta é uma ferramenta muito útil para estudar as vias de sinalização que regulam a inflamação das vias aéreas em modelos de camundongos.

Administração intra-traqueal de<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; No mouse modelos para o Estudo de inflamação das vias aéreas

É apresentado aqui um procedimento passo a passo para induzir ferimento de pulmão agudo nos ratos pela instilação intratraqueal direta do lipopolissacarídeo e para executar a análise de FACS de amostras de sangue, de líquido broncoalveolar do lavagem, e de tecido do pulmão. A invasividade mínima, o manuseio simples, a boa reprodutibilidade e a titulação da severidade da doença são vantagens dessa abordagem.

Induzindo lesão pulmonar aguda em camundongos por instilação de lipopolissacárido intratraqueal direto

Formulações de pó seco para inalação têm grande potencial no tratamento de doenças respiratórias. Antes de entrar em estudos humanos, é necessário avaliar a eficácia da formulação de pó seco em estudos pré-clínicos. É apresentado um método simples e não invasivo de administração de pó seco em camundongos através da rota intratraqueal.

Administração Intratraqueal de Formulação de Pó Seco em Camundongos

Neste estudo, uma técnica não invasiva de instilação endotraqueal demonstrou desenvolver ALI em ratos usando um laringoscópio básico para garantir a entrega precisa de LPS aos pulmões. O LPS é injetado por meio de um tubo endotraqueal usando um laringoscópio. A magnitude da lesão pulmonar é avaliada em vários momentos.

Administração endotraqueal não invasiva de lipopolissacarídeo para induzir lesão pulmonar aguda em roedores

Aprenda a instilação não invasiva de lipopolissacarídeo intratraqueal em camundongos usando intubação orofaríngea. Este método minimiza trauma cirúrgico e permite avaliar respostas inflamatórias pulmonares com precisão.

Instilação não invasiva de lipopolissacarídeo intratraqueal em camundongos

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