Name: Avaliação da Resposta Imune de uma Vacina Adjuvante em Nanoemulsão Contra a Infecção por Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (MRSA) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-01T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprenda a preparar uma vacina nanoemulsão adjuvante contra MRSA e avaliar sua resposta imune e efeitos protetores in vivo. Este método demonstra estabilidade e imunogenicidade para desenvolvimento vacinal.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo No. 2021YFC2302603 do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China, No. 32070924 e 32000651 do NSFC, e No. 2019jcyjA-msxmx0159 do Programa de Projeto da Fundação de Ciências Naturais de Chongqing.

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse neste trabalho.

A IsdB, uma proteína de superfície bacteriana ancorada na parede celular e regulada pelo ferro, desempenha um papel importante no processo de obtenção do ferro heme15. A Hla, toxina alfa, está entre as toxinas bacterianas mais eficazes conhecidas em MRSA, podendo formar poros em células eucarióticas e interferir na adesão e nas células epiteliais16. Em nosso estudo, uma nova proteína antigênica (HI) de MRSA de recombinação foi construída e expressa com tec...

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é um patógeno oportunista com uma das mais altas taxas de infecção em enfermarias de unidade de terapia intensiva (UTI)1, departamentos de cardiologia e departamentos de queimados em todo o mundo. MRSA apresenta altas taxas de infecção, mortalidade e ampla resistência a drogas, apresentando grandes dificuldades no tratamento clínico2. Na Lista Global Prioritária de Bactérias Resistentes a Antibióticos divulgada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) em 2017, o MRSA foi listado na categoria3 mais crítica. Uma vacina contra a infecção por MRSA é, portanto, urgentemente necessária.
O adjuvante de alumínio é utilizado há muito tempo, e o mecanismo auxiliar do adjuvante é relativamente claro, seguro, eficaz e bem tolerado4. Os adjuvantes de alumínio são atualmente um tipo de adjuvante amplamente utilizado. Acredita-se que antígenos adsorvidos em partículas de sal de alumínio possam melhorar a estabilidade e aumentar a capacidade do local de injeção de captar antígenos, proporcionando boa absorção e liberação lenta5. Atualmente, a principal desvantagem dos adjuvantes de alumínio é que eles não têm efeito adjuvante ou exibem apenas um fraco efeito adjuvante sobre alguns antígenos candidatos à vacina6. Além disso, adjuvantes de alumínio induzem reações de hipersensibilidade mediadas por IgE5. Portanto, é necessário desenvolver novos adjuvantes para estimular uma resposta imune mais forte.
Os adjuvantes em nanoemulsão são sistemas de dispersão coloidal compostos por óleo, água, surfactantes e cosurfactantes7. Além disso, os adjuvantes são termodinamicamente estáveis e isotrópicos, podem ser autoclavados ou estabilizados por centrifugação de alta velocidade e podem ser formados espontaneamente sob condições leves de preparação. Vários adjuvantes de emulsão (como MF59, NB001-002 series, AS01-04 series, etc.) estão atualmente no mercado ou em fase de pesquisa clínica, mas seus tamanhos de partículas são superiores a 160 nm8. Portanto, as vantagens das preparações medicinais em nanoescala (1-100 nm) (ou seja, grande área de superfície específica, tamanho de partícula pequeno, efeito de superfície, alta energia de superfície, efeito de tamanho pequeno e efeito de tunelamento macroquântico) não podem ser totalmente exploradas. No presente protocolo, um novo adjuvante baseado na tecnologia de nanoemulsão com um tamanho de diâmetro de 1-100 nm foi relatado como exibindo boa atividade adjuvante9. Testamos a proteína de antígeno vacinal de subunidade de recombinação HI (α-hemolisina mutante [Hla] e fator determinante de superfície do íon Fe B [IsdB] subunidade N2 proteína de fusão de fragmento ativo); Uma série de procedimentos foi estabelecida para examinar as propriedades físicas e a estabilidade, avaliar sua resposta específica de anticorpos após administração intramuscular e testar o efeito protetor da vacina usando um modelo de infecção sistêmica em camundongos.

<table><tbody><tr><td>5424-Centrífuga pequena de alta velocidadeFA-45-24-11</td><td>Eppendorf, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>5424000495</tr><tr><td>placas de 96 poços</td><td>Corning Incorporated, EUA</td><td>CLS3922</td><td></td></tr><tr><td>AFM Dimension FastScan</td><td>BRUKER, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>null</tr><tr><td>Lâmpada de álcool</td><td>Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China</td><td>YBS-AA-11408</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos Balb/c&nbsp;</td><td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCIP / NBT</td><td>Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company, China</td> Leitor de microplacas <td>BCIP / NBT</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad 6.0</td><td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, EUA</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Célula competente</td><td>Merck millipore, Alemanha</td><td>70232-3CN</td><td></td></tr><tr><td>BSA-100G</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>B2064-100G</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5810 R</td><td>Eppendorf, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>5811000398</tr><tr><td>Coomassie azul brilhante G-250 solução de coloração</td><td>MIKX, China</td><td>DB236</td><td></td></tr><tr><td>Solução de descoloração</td><td>BOSTER, China</td><td>AR0163-2</td><td></td></tr><tr><td>Eletro-aquecimento cultivador de temperatura permanente HH-B11-420</td><td>Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de eletroforese</td><td>Beijing Liuyi Instrument Factory, China</td><td>Imagem Tanon,</td><td></td></tr><tr>gel <td>nulo</td><td></td><td></td><td>GST</td></tr><tr><td>Mei5bio da resina GST Mei5bio</td><td>da glutationa-sepharose</td> dos EUA, <td>resina</td><td></td></tr> H<tr><td>2SO4</td><td>Chengdu KESHI Chemical Co., LTD, China</td><td>7664-93-9</td><td></td></tr><tr><td>Proteína recombinante HI</td><td>Terceira Universidade Médica Militar, China</td><td>110-27-0</td><td></td></tr><tr><td>HRP - Cabra Anti-rato IgG</td><td>Biodragon, China</td><td>BF03001</td><td></td></tr><tr><td>HRP- Cabra anti-rato IgG1</td><td>Biodragon, China</td><td>BF03002R</td><td></td></tr><tr><td>HRP- Cabra anti-rato IgG2a</td><td>Biodragon, China</td><td>BF03003R</td><td></td></tr><tr><td>HRP- Cabra anti-rato IgG2b</td><td>Biodragon, China</td><td>BF03004R</td><td></td></tr><tr><td>Inoculação loop</td><td>Haimen Feiyue Co., LTD, China</td><td>YR-JZH-1UL</td><td></td></tr><tr>Biotecnologia <td>Co. de Shanghai Jereh de</td> <td>IsdB e de Hla</td>, noz-moscada <td>isopropílica nula</td><td></td></tr><tr><td>de China (adjuvante farmacêutico)</td> <td>SEPPIC, France</td><td>isopropil nulo</td><td></td></tr><tr><td>- &beta;-D-1-mercaptogalactopyranoside</td><td>fdbio, biotecnologia</td> Co. de Beijing AOBOX do caldo de China <td>FD3278-1</td><td></td></tr> LB, <tr><td></td><td>LTD, China</td><td>02-136</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada de fisioterapia refrigerada</td><td>Guangzhou Runman Medical Equipment Co., China</td><td>7600</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada de baixa temperatura</td><td>Eppendorf, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>null</tr><tr><td>Malvern NANO ZS</td><td>Malvern Instruments Ltd., UK</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>MH(A) medium</td><td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td><td>02-051</td><td></td></tr><tr><td>MH(B) medium</td><td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td><td>02-052</td><td></td></tr><tr><td>Micro máquina de lavar chapas 405 LSRS</td><td>Bio Tek Instruments,Inc Highland&nbsp; Parque, EUA</td><td>nulo</td><td></td></tr><tr><td>Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument</td><td>BeiJingDongFangRuiLi Co., LTD, China</td><td>1658030</td><td></td></tr><tr><td></td><td>embalagem</td><td>MMC TOSOH (SHANGHAI) CO., LTD</td><td></td></tr> 0022818 <tr><td>MRSA252</td><td>EUA, ATCC</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop espectrofotômetro ultravioleta</td><td>Thermo Scientific, EUA</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>New FlashTM Protein qualquer KD PAGE Jogo DAKEWE do gel da eletroforese da proteína</td><td>, China</td><td>8012011</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>biosharp, PCR</td><td>nulo</td><td></td>de China</tr><tr>, ciclador térmico<td>do amplificador</td>, <td></td> plasmídeo recombinante nulo <td></td><td>do</td></tr><tr><td>gene do pGEX-alvo</td> dos EUA <td>Biotecnologia Co de Shanghai Jereh, G-CLONE</td> do ácido fosfotúngstico de China <td>B3528G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>,</td> pipeta <td>de China CS1231-25g</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>3120000844</tr><tr><td>óleo de rícino polioxietilado (adjuvante farmacêutico)</td><td>Aladdin, China</td><td>K400327-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo primário</td><td>Caseiro em laboratório:de camundongos imunizados com soro positivo</td><td>nulo</td><td>Consulte a Referência 11 para obter detalhes</td></tr><tr><td>propilenoglicol (adjuvante farmacêutico)</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>Marcador de proteína P4347-500ML</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientufuc, EUA</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>MEMBRANA DE TRANSFERÊNCIA DE PVDF</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Eletrônico de Varredura</td><td>JEOL, Japão</td><td>JSM-IT800</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital de sódio</td><td>Merck, Alemanha</td><td>Tc-P8411</td><td></td></tr><tr><td>Talos L120C TEM</td><td>Thermo Fisher, EUA</td><td>solução de cor TMB NULA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>TIAN GEN, China</td><td>PA107-01</td><td></td></tr><tr><td>Kits de tartaruga</td><td>Xiamen Bioendo Technology Co., LTD</td><td>ES80545</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Macklin, China</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação da resposta imune de uma vacina adjuvante em nanoemulsão contra a infecção por staphylococcus aureus resistente à meticilina (mrsa)

Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Infection

As vacinas adjuvantes em nanoemulsão têm atraído grande atenção devido ao seu pequeno tamanho de partículas, alta estabilidade térmica e capacidade de induzir respostas validamente imunes. No entanto, o estabelecimento de uma série de protocolos abrangentes para avaliar a resposta imune de uma nova vacina adjuvante em nanoemulsão é vital. Portanto, este artigo apresenta um procedimento rigoroso para determinar as características físico-químicas de uma vacina (por microscopia eletrônica de transmissão [MET], microscopia de força atômica [AFM] e espalhamento dinâmico de luz [DLS]), a estabilidade do antígeno e do sistema vacinal (por um teste de centrífuga de alta velocidade, um teste de estabilidade termodinâmica, SDS-PAGE e western blot) e a resposta imune específica (IgG1, IgG2a e IgG2b). Usando essa abordagem, os pesquisadores podem avaliar com precisão o efeito protetor de uma nova vacina adjuvante de nanoemulsão em um modelo de camundongo MRSA252 letal. Com esses protocolos, pode-se identificar o adjuvante vacinal em nanoemulsão mais promissor em termos de potencial adjuvante efetivo. Além disso, os métodos podem ajudar a otimizar novas vacinas para desenvolvimento futuro.

Avaliou-se o protocolo de preparação da vacina adjuvante em nanoemulsão e os testes in vitro e in vivo desta vacina. MET, AFM e DLS foram usados para determinar as características importantes do potencial zeta e do tamanho de partícula na superfície desta amostra (Figura 1). SDS-PAGE e western blotting mostraram que a quantidade de antígeno no precipitado e sobrenadante não se degradou significativamente após a centrifugação, o que indicou que a vacina estava estruturalment...

O presente protocolo prepara e avalia as propriedades físicas, a resposta imune e o efeito protetor in vivo de uma nova vacina adjuvante em nanoemulsão.

Avaliação da Resposta Imune de uma Vacina Adjuvante em Nanoemulsão Contra a Infecção por Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (MRSA)

Nanoemulsion adjuvant vaccines have attracted extensive attention because of their small particle size, high thermal stability, and ability to induce ...

O protocolo demonstrado sublinhou a abordagem experimental direta e eficaz e os passos detalhados para os efeitos da resposta imune de novos adjuvantes virais. Esse protocolo fornece à pesquisa não apenas um método basicamente de avaliação imunológica para a vacina adjuvante, mas também pode determinar sua estabilidade de massa. Para começar, pegue a solução de trabalho de 10 miligramas por mililitro da proteína do antígeno MRSA HI e, a ela, adicione sequencialmente os três excipientes, miristato de isopropilo, óleo de rícino de polioxietileno e propilenoglicol, mantendo uma relação de massa de um é para seis é para três.Mexa bem a mistura e, aos poucos, adicione água pura esterilizada até atingir um volume de 10 mililitros. Para preparar a vacina de nanoemulsão pelo método de emulsificação de baixa energia, agite-a a 500 rotações por minuto e 25 graus Celsius por aproximadamente 20 minutos. Posteriormente, a vacina de nanoemulsão contendo um miligrama por mililitro de proteína é obtida como um líquido transparente claro.Para o revestimento antigênico do ensaio imunoenzimático ou placa ELISA, dilua o antígeno da proteína HI para 10 microgramas por mililitro com solução de revestimento e adicione 100 microlitros do antígeno diluído por poço na placa de ELISA. Incube a placa a quatro graus Celsius durante a noite. Após a incubação, lavar a placa com 300 microlitros de PBST por poço.Selar os poços com 300 microlitros da solução de vedação por poço por duas horas a 37 graus Celsius, diluir três microlitros do soro de camundongos de cada grupo experimental 100 vezes adicionando 297 microlitros de PBST e vortexar o soro diluído. Adicionar 100 microlitros de soro diluído por poço na placa ELISA revestida para cada amostra de soro. Da mesma forma, diluir os soros controle positivo e negativo 100 vezes com PBST adicionando quatro microlitros de soro controle positivo ou negativo a 396 microlitros de PBST, seguido de mistura de vórtices.Para realizar a diluição de dupla proporção, adicionar 200 microlitros do soro experimental previamente diluído à primeira fileira da placa ELISA revestida e, em seguida, adicionar 100 microlitros de PBST a todos os poços, exceto aqueles nas fileiras um e 12. Em seguida, ajuste a pistola de pipeta para 100 microlitros e transfira 100 microlitros de soro da primeira fileira para a segunda fileira contendo PBST. Misture o conteúdo na segunda fileira 10 vezes usando a pistola de pipeta.Da mesma forma, realizar uma diluição do soro até a linha 11. Feito isso, descarte 100 microlitros de líquido da linha 11. Adicionar 100 microlitros de soro negativo e positivo diluído a cada poço correspondente na linha 12 após o modelo de amostra.Sele a placa ELISA com filme plástico e incube a 37 graus Celsius por uma hora. Enquanto isso, diluir o anticorpo secundário anti-IgG de camundongo HRP 10.000 vezes adicionando PBST. Após a incubação de uma hora, lave a placa de ELISA com 300 microlitros de PBST por poço para limpar os anticorpos não ligados, adicione 100 microlitros do anticorpo secundário diluído a cada poço e incube a placa a 37 graus Celsius por 40 minutos.Lave a placa com 300 microlitros de PBST por poço e, em seguida, adicione 100 microlitros de solução de desenvolvimento de cor TMB a cada poço. Coloque as placas a 37 graus Celsius e longe da luz por 10 minutos. Depois disso, terminar a reação imediatamente com 50 microlitros de ácido sulfúrico de dois molares.Detectar a densidade óptica ou valores OD em 415 nanômetros usando um marcador enzimático dentro de 15 minutos após o término. As características físicas da nova vacina em nanoemulsão foram analisadas usando microscopia eletrônica de transmissão e microscopia de força atômica. O espalhamento dinâmico de luz foi utilizado para determinar a distribuição granulométrica e o potencial zeta da amostra.SDS-PAGE e western blotting mostraram que a quantidade de antígeno no precipitado e sobrenadante não diferiu significativamente após a centrifugação, indicando que a vacina estava estruturalmente intacta, específica e imunogênica. A vacina adjuvante em nanoemulsão aumentou significativamente os títulos totais de anticorpos IgG, IgG1 e IgG2a dos camundongos. A imunogenicidade da vacina proteica melhorou significativamente.Os valores séricos de IgG2b OD a 450 nanômetros foram mais altos quando PBS foi usado em uma diluição de um é a 5.000. O modelo letal de camundongos MRSA 252 refletiu que a vacina em nanoemulsão mostrou um bom efeito protetor e inibiu efetivamente a infecção bacteriana por MRS A 252, melhorando a taxa de sobrevivência dos camundongos infectados. A preparação de nanoemulsão e a adição de soro à planta são as mais importantes.Além disso, quando detectada o título de anticorpos, deve-se prestar atenção para corrigir para uma saída mais ampla e baseada em líquido. Além de adjuvantes, esse método também pode ser usado para a evolução imunológica de outras matrizes matemáticas, como plásticos ou sistemas de entrega.

evaluating-immune-response-nanoemulsion-adjuvant-vaccine-against

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra uma técnica de homogeneização eficiente para gerar uma emulsão antigénio-adjuvante para induzir encefalomielite autoimune experimental (EAE) num modelo murino. A emulsão contém um autoantígeno - glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG) - na fase aquosa, cercada por uma fase oleosa contínua composta por uma bactéria patogênica inativada. A emulsão garante uma liberação sustentada de antígenos para uma resposta imune prolongada.

Preparando uma emulsão adjuvante de antígeno para induzir encefalomielite autoimune

Este vídeo demonstra um método para avaliar a resposta imune de anticorpos a uma nova vacina adjuvante de nanoemulsão em camundongos pré-imunizados. A imunização aumenta a resposta de anticorpos, conforme confirmado pela determinação dos títulos de anticorpos IgG.

Medindo os níveis de imunoglobulina G contra uma vacina de teste em um soro de camundongo

Este vídeo demonstra a produção de vacinas tumorais em nanoemulsão. Os depósitos estáveis de reservatórios de petróleo que transportam peptídeos sintéticos e adjuvantes são produzidos por nanoemulsão de baixa energia, oferecendo uma promessa significativa para a imunoterapia tumoral.

Preparação de uma vacina adjuvante de nanoemulsão

Descrevemos técnicas baseadas em imagens de animais inteiros e citometria de fluxo para monitorar a expansão de células T CD8+ específicas do antígeno em resposta à imunização com nanopartículas em um modelo murino de vacinação.

Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação

O protocolo apresenta métodos detalhados para avaliar se o adjuvante da nanoemulsão ofiopogonina D promove respostas imunes celulares eficazes.

In vitro Avaliação da Atividade Celular da Vacina de Nanoemulsão Adjuvante Ofiopogonina D

Aqui, apresentamos métodos detalhados para a preparação e avaliação da vacina tumoral em nanoemulsão auto-montada nasal in vitro e in vivo.

Preparação, características, toxicidade e avaliação da eficácia da vacina contra tumores em nanoemulsão automontada nasal in vitro e in vivo

Para induzir encefalomielite autoimune experimental, um modelo animal de esclerose múltipla, os ratos são imunizados com uma emulsão de água em óleo contendo um autoantígeno e adjuvante completo de Freund. Embora existam vários protocolos para a preparação dessas emulsões, um protocolo de homogeneização rápido, simples e padronizado para a preparação de emulsões é apresentado aqui.

Um método de homogeneização rápido, simples e padronizado para preparar emulsões de antígenos/adjuvantes para induzir encefalomielite autoimune experimental

Apresentamos quatro métodos para avaliar a atividade antimicrobiana de nanopartículas e superfícies nanoestruturadas usando técnicas in vitro . Estes métodos podem ser adaptados para estudar as interações de diferentes nanopartículas e superfícies nanoestruturadas com uma ampla gama de espécies microbianas.

Avaliação da atividade antimicrobiana de nanopartículas e superfícies nanoestruturadas in vitro

Neste protocolo, desenvolvemos um ácido retinóico (AR) encapsulado em nanoemulsão catiônica para ser usado como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do antígeno. Ao adicionar o RA aprovado pela FDA à nanoemulsão, a sIgA específica do antígeno foi promovida na vagina e no intestino delgado após a injeção intramuscular da nanoemulsão.

Ácido retinóico encapsulado em nanoemulsão catiônica como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do OVA

Protocolos para a utilização de biofilmes fluxo de abrir o sistema com reatores de fluxo de gotejamento e girando reatores disco são apresentadas em detalhe.

O uso do fluxo de gotejamento e Reatores de disco rotativo para Staphylococcus aureus Análise de biofilme

Aprenda a preparar uma vacina nanoemulsão adjuvante contra MRSA e avaliar sua resposta imune e efeitos protetores in vivo. Este método demonstra estabilidade e imunogenicidade para desenvolvimento vacinal.

Avaliação da Resposta Imune de uma Vacina Adjuvante em Nanoemulsão Contra a Infecção por Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (MRSA) (Vídeo) | JoVE Journal

Avaliação da Resposta Imune de uma Vacina Adjuvante em Nanoemulsão Contra a Infecção por Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (MRSA)

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