Explantes Cocleares Neonatais Totais como Modelo In vitro
28 de julho de 2023
O protocolo atual atualiza protocolos anteriores e incorpora abordagens relativamente simples para a cultura de explantes cocleares de alta qualidade. Isso fornece aquisição de dados confiável e imagens de alta resolução em células vivas e fixas. Este protocolo apoia a tendência contínua de estudar as células da orelha interna.
Este protocolo incorpora uma abordagem simples para agilizar as etapas de cultivo, obtendo explantes de alta qualidade e contribuirá para explorar e desvendar mecanismos moleculares das células cocleares. A principal vantagem dessa técnica é o manuseio direto mínimo dos órgãos, coordenando as etapas de dissecção, o revestimento adequado da superfície do polímero, o volume médio otimizado e o tempo de fixação dos explantes. Esta técnica representa uma abordagem popular in vitro para o estudo da perda auditiva neurossensorial.
Isso pode ser usado para estabelecer modelos ototóxicos, realizar análises estruturais, avaliar vias de sinalização e realizar estudos de triagem de drogas. Em princípio, este método pode aplicar-se a diferentes explantes de tecidos. Ele também pode ser empregado em pesquisas do ouvido interno para obter informações sobre os estágios de desenvolvimento embrionário.
Para começar, coloque a cabeça do rato decapitado sobre a almofada estéril. Use tesoura e pinça para remover a mandíbula, depois levante a pele e descasque-a de volta do crânio. Coloque a pinça nas cavidades orbitárias para segurar o crânio.
Com uma lâmina afiada de bisturi, corte cuidadosamente o crânio ao longo da sutura sagital e, em seguida, a área de sutura coronal sem danificar a cóclea. Agora, remova o cérebro das duas metades do crânio. Sob o microscópio, localize a cóclea no osso temporal e solte o tecido circundante entre a cóclea e o osso temporal.
Em seguida, coloque a pinça no canal semicircular superior. Puxar suavemente o osso temporal para longe da cóclea e segurar a cóclea presa ao vestíbulo com o osso temporal. Insira as pontas da pinça na região do ápice, que é visível como uma linha branca, e remova a cápsula cartilaginosa da cóclea peça por peça para expor o ducto coclear.
Coloque as pinças sob a cóclea e as desprenda do órgão vestibular e do osso temporal. Transfira a cóclea para um novo prato de 60 milímetros contendo PBS gelado. Para isolar os órgãos do explante de Corti, segure o órgão na base e o ducto coclear na região do gancho basal e desanuvie suavemente o ducto coclear do modíolo sem rasgá-lo.
Em seguida, segure o ducto coclear na base e puxe o ligamento espiral e a estria vascular. Para o isolamento dos explantes cocleares, utilizar pinça para desprender o gânglio espiral da lâmina espiral óssea e desenrolar o modíolo durante o descolamento. Com pinças, segure a região do gancho e remova o ligamento espiral com a estria vascular.
Além disso, retire a membrana de Reissner peça por peça. Para transferir os explantes cocleares, mergulhe uma espátula de laboratório na placa que contém o explante. Levante o explante com as células ciliadas viradas para cima junto com alguns microlitros de PBS agitando uma espátula.
Coloque o explante em uma lâmina de câmara de oito poços, agitando suavemente a espátula no meio. Deixe o explante deslizar para dentro da câmara. Usando uma pipeta de 100 microlitros, retire 80 microlitros do meio e descarte-o.
Verifique a visibilidade das células ciliadas e das células neurais do gânglio espiral ao microscópio. Se necessário, use fórceps para afastar o tecido sobreposto. Retire o meio restante do poço.
O explante ficará agora mais plano na superfície da câmara. Após 10 segundos, pipetar de volta uma ou duas gotas do meio ao lado do explante, e o meio restante a alguma distância para evitar o desprendimento do explante. Certifique-se de que os explantes não se movam ao adicionar o meio.
Incubar a câmara por duas horas para fixar os órgãos firmemente ao fundo da câmara. Após a incubação, aspirar o meio. E usando uma pipeta de 100 ou 200 microlitros, adicione cuidadosamente 300 microlitros de meio completo fresco e pré-aquecido.
As imagens microscópicas confocais do disco giratório mostraram que os explantes do Órgão de Corti de ratos mantiveram sua estrutura e comprimento total em condições normais e estressadas. Além disso, um microscópio confocal de varredura demonstrou células ciliadas sobreviventes de explantes dos órgãos de camundongos, juntamente com células ciliadas em apoptose. O protocolo possibilitou o monitoramento de processadores biológicos em células cocleares vivas utilizando sondas permeáveis celulares apropriadas e microscópio confocal de disco giratório.
A cultura desses explantes cocleares favorece a análise da interação entre as células ciliadas e as células do gânglio espiral. As células ciliadas dos implantes cocleares foram detectadas com o marcador de células ciliadas, MYO7A. Da mesma forma, corpos celulares ganglionares espirais saudáveis e danificados e neuritos foram identificados usando o marcador neuronal, Tuj 1.
Na visão ampliada, os corpos celulares das células ciliadas marcadas com o anticorpo MYO7A eram visíveis. Estereocílios de células ciliadas externas e imagens descontorcidas de estereocílios de células ciliadas internas individuais marcados com faloidina foram identificados. Cuidados devem ser tomados durante os procedimentos sob o microscópio, especialmente ao separar o gânglio espiral da lâmina espiral óssea.
Os explantes intactos devem ser transferidos e alinhados com cuidado. Este protocolo otimizou estudos in vitro de explantes da orelha interna. Os resultados desses estudos, como vias de sinalização e toxicidade de drogas, podem guiar o desenho de estudos in vivo mais distantes.
Visão Geral
Este protocolo apresenta uma abordagem aperfeiçoada para o cultivo de explantes cocleares destinado ao estudo de células da orelha interna. A metodologia melhora a qualidade dos explantes, contribuindo para a compreensão dos mecanismos celulares da cóclea e de possíveis respostas ototóxicas. Técnicas de imagem em tempo real fornecem informações sobre as interações e viabilidade das células cocleares.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia celular coclear
- Pesquisa sobre perda auditiva
Antecedentes
- Este protocolo atualiza métodos anteriores para cultura de explantes cocleares.
- As células da orelha interna são fundamentais para o estudo da perda auditiva sensorioneural.
- A microscopia de alta resolução é essencial para avaliar a saúde celular e a sinalização.
- Avanços nas técnicas de cultivo minimizam danos durante a dissecação.
Objetivo do Estudo
- Otimizar o cultivo de explantes cocleares para a aquisição confiável de dados.
- Facilitar a exploração dos mecanismos moleculares em células cocleares.
- Apoiar a análise estrutural e o triagem de fármacos em modelos de perda auditiva.
Métodos Utilizados
- Este estudo utiliza uma plataforma padronizada de cultivo de órgãos.
- Explantes cocleares de ratos foram cuidadosamente isolados e cultivados em um ambiente controlado.
- Os passos incluem dissecção, transferência para placas de cultivo e fixação em condições de meio baixo.
- Os tempos de incubação são críticos para a viabilidade e estabilidade dos explantes durante a observação.
- Técnicas de imagem de alta resolução, como microscopia confocal com disco giratório, foram utilizadas.
Resultados Principais
- Os explantes mantiveram sua estrutura tanto em condições normais quanto sob estresse.
- Células ciliadas sobreviventes foram identificadas ao lado daquelas em processo de apoptose.
- Foram observadas interações significativas entre células ciliadas e células do gânglio espiral.
- Marcadores como MYO7A e Tuj 1 foram utilizados para avaliar a viabilidade celular e a diferenciação.
Conclusões
- Este protocolo aperfeiçoado permite um estudo aprimorado das interações celulares e mecanismos no interior da cóclea.
- As metodologias empregadas enfatizam a importância de uma dissecação cuidadosa e de condições de cultura adequadas.
- Os conhecimentos obtidos a partir desses estudos podem orientar pesquisas futuras in vivo sobre perda auditiva e mecanismos regenerativos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Explantes cocleares neonatais inteiros fornecem um modelo robusto in vitro para investigar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à perda auditiva sensorioneural. Esta plataforma permite análise de alto conteúdo da viabilidade de células ciliadas e neurônios, oferecendo confiança preditiva na validação precoce de alvos e na redução de riscos mecanicistas. O fluxo de trabalho simplificado e a reprodutibilidade do método o posicionam como um ativo valioso para triagem de portfólios e pesquisas translacionais em terapêuticas para perda auditiva.
Aplicações Estratégicas na P&D de Biotecnologia e Farmácia
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação direta das interações entre células ciliadas e neurônios do gânglio espiral em um sistema controlado.
- Apoia a desmistificação mecanicista ao permitir estudos de vias e toxicidade relevantes para a perda auditiva.
- Facilita a validação funcional de alvos por meio de análise quantitativa por imagem e marcadores moleculares.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Oferece uma plataforma padronizada de explante para estudos reprodutíveis de triagem de ototoxicidade e fármacos.
- Fornece resultados quantitativos por meio de imagem confocal e marcadores específicos de células (por exemplo, MYO7A, Tuj 1).
- Permite escalabilidade do ensaio e reutilização da plataforma em múltiplas condições experimentais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para a perda auditiva sensorioneural e avaliação de ototoxicidade.
- Apoia a continuidade de estudos mecanicistas in vitro para a validação in vivo de hipóteses terapêuticas.
- Facilita decisões de avanço com ajuste de risco ao fornecer dados preditivos sobre respostas celulares.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo de explante integra a descoberta inicial e a pesquisa pré-clínica, permitindo testes de hipóteses, análise de vias e avaliação de compostos dentro de um fluxo de trabalho unificado.
- Biologia da Descoberta: Apoia estudos baseados em hipóteses sobre a sobrevivência celular coclear e mecanismos de sinalização.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis para triagem de compostos e toxicidade.
- Análises: Permite imagens de alta resolução e quantificação baseada em marcadores da viabilidade celular e apoptose.
- Pesquisa Translacional: Oferece um sistema relevante para doenças, garantindo continuidade pré-clínica na pesquisa sobre perda auditiva.
- Reutilização Empresarial: Adaptável a diversos desenhos experimentais e tipos de tecidos na pesquisa auditiva.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Agiliza o preparo de explantes, padroniza as condições de cultura e melhora a reprodutibilidade.
- Valor Estratégico: Aprimora a tomada de decisões de avanço ou interrupção e a eficiência do capital em programas precoces de perda auditiva.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos terapêuticos direcionados à patologia coclear.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microdissecção e imagem confocal para o preparo e análise ideais de explantes.
- Exige acesso a sistemas de cultura multiwell e marcadores moleculares validados para identificação celular.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de dissecção, cultura e aquisição de imagens.
- Adaptável a diversos modelos de roedores e potencialmente a outros explantes de tecidos mediante modificações no protocolo.
- Manuseio cuidadoso é essencial para manter a integridade do explante e garantir resultados quantitativos confiáveis.
