Name: Implante de Minibomba Osmótica para Aumento da Concentração de Glicose no Líquido Cefalor de Camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Aprenda a implantar minibomba osmótica para elevar glicose no líquido cefalorraquidiano de camundongos sem alterar glicemia. Este método permite estudar neurodegeneração e função cognitiva.

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National Institutes of Health concessão DK124619 para KHC.
Fundos de start-up e prêmio de pesquisa piloto, Departamento de Medicina, Universidade de Rochester, NY, para KHC.
Prêmio de Pesquisa Piloto do Instituto Del Monte de Neurociência, Universidade de Rochester, para KHC.
Prêmio de Pesquisa Universitária, Escritório do Vice-Presidente de Pesquisa, Universidade de Rochester, NY, para KHC.
MUR desenhou e executou o método, analisou os resultados, elaborou gráficos e figuras, escreveu e editou o manuscrito. KHC concebeu e supervisionou o estudo, analisou os resultados, escreveu e editou o manuscrito. A KHC é a fiadora desse trabalho. Todos os autores aprovaram a versão final do manuscrito.

Todos os procedimentos em camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Rochester e foram realizados de acordo com as diretrizes do Serviço de Saúde Pública dos EUA para o cuidado humano e uso de animais de experimentação. Camundongos machos C57BL/6J com seis semanas de idade utilizados para este estudo foram obtidos comercialmente. Todos os animais foram alojados em grupo (5 camundongos por gaiola) em uma sala com ciclo dia/noite de 12 h e tiveram acesso a ração e água ad libitum. Depois que os camundongos foram implantados com uma cânula para infusão de glicose no ventrículo lateral, eles foram alojados individualmente para evitar qualquer dano aos implantes de outros camundongos.
1. Montagem de minibombas osmóticas
<ol><li>Preparar o líquido cefalorraquidiano artificial (LCRa) de acordo com o seguinte protocolo. Dissolver NaCl (8,66 g), KCl (0,224 g), CaCl 2,2H 2 O (0,206 g) e MgCl2,6H 2 O (0,163 g) em 500 mL de água estéril para preparar a solução A. Dissolver Na 2 HPO 4,7H 2 O (0,214 g) e NaH2 PO4. H2O (0,027 g) em 500 mL de água estéril para preparar a solução B. Em seguida, misture as soluções A e B na proporção de 1:1 para preparar o aCSF. NOTA: Esta formulação de aCSF não contém glicose.</li>
	<li>Para preparar a solução de glicose a 50%, adicione 50 g de glicose a 50 mL de aCSF em um béquer. Coloque o copo numa placa quente e leve a temperatura da suspensão a 60 °C. Misture a suspensão com um agitador magnético até que a glicose esteja completamente dissolvida.</li>
	<li>Adicionar aCSF ao copo para completar o volume final de 100 mL. Passar a solução através do filtro de poros de 0,22 μm para esterilizá-la.</li>
	<li>Preparar uma solução salina a 0,9% (NaCl) e passar a solução através do filtro de 0,22 μm.</li>
	<li>Coloque todos os componentes da minibomba e do kit de infusão em uma bandeja estéril e corte a tubulação do kit de infusão cerebral para 1 polegada de comprimento com uma tesoura estéril. Segure a tubulação com um hemostático estéril e empurre-a na parte superior de uma extremidade da cânula. Conecte a outra extremidade da tubulação ao lado superior do modulador de fluxo. Cubra ambas as extremidades da tubulação com uma pequena quantidade de cola para uma conexão mais forte.</li>
	<li>Ligue uma agulha de 27 G a uma seringa de 1 ml e preencha-a com aCSF ou com a solução de glicose. Insira a agulha de 27 G em um pequeno pedaço de tubo. Em seguida, conecte a tubulação à extremidade aberta do modulador de fluxo e preencha-a com a solução correspondente até que gotas da solução comecem a sair da cânula. Remova todas as bolhas de ar presas na tubulação.</li>
	<li>Para encher a minibomba, segure a bomba na vertical e insira a agulha da seringa na bomba. Encha-o com a solução correspondente até que uma gota da solução comece a se formar na abertura da minibomba.</li>
	<li>Insira lentamente o modulador de fluxo na bomba, certificando-se de não introduzir bolhas de ar no conjunto.</li>
	<li>Após a montagem das minibombas osmóticas, transfira-as para um tubo cônico de 50 mL. Encha o tubo com o soro fisiológico estéril para que as bombas fiquem completamente submersas, certificando-se de que a cânula fique fora da solução salina. Quatro dessas bombas montadas podem ser colocadas em um tubo de 50 mL.</li>
	<li>Coloque a tampa em cada tubo e incube as bombas a 37 °C para prime durante, pelo menos, 48 horas.</li>
</ol>2. Cirurgia para implante de bombas osmóticas
<ol><li>Procedimento pré-operatório<ol><li>Esterilizar os instrumentos cirúrgicos em autoclave e deixá-los esfriar por pelo menos 30 minutos antes do uso. As condições de autoclave envolvem esterilização a vapor a 121 °C por 30 min.</li>
		<li>Desinfetar a área cirúrgica com etanol 70%. Limpe os botões, as barras auriculares e a superfície da estrutura estereotáxica. NOTA: A cirurgia deve ser realizada em um ambiente asséptico, tendo em mente evitar tocar em superfícies não estéreis durante a realização da cirurgia. Substitua as luvas se houver suspeita de contaminação.</li>
		<li>Coloque o camundongo em uma câmara de anestesia para anestesiar com isoflurano a 3% misturado ao ar por 3-5 min. Em seguida, retire o rato da câmara e coloque-o sobre um campo estéril. Manter a anestesia através de um cone nasal a 1,5%-2%.</li>
		<li>Aperte a pata traseira do rato para observar qualquer reflexo e verificar a profundidade da anestesia.</li>
		<li>Injetar 5 mg/kg de carprofeno por via subcutânea para analgesia.</li>
		<li>Use cortadores limpos para cortar a área de cirurgia na cabeça do mouse. Esfregue o couro cabeludo primeiro com solução de iodopovidona e, em seguida, com cotonetes de álcool completamente por pelo menos 2 min. Repita esse processo pelo menos três vezes.</li>
		<li>Aplique um lubrificante ocular para evitar que os olhos sequem durante a cirurgia.</li>
	</ol></li>
	<li>Cirurgia<ol><li>Coloque o mouse sobre a armação estereotáxica e encaixe a cabeça na barra do incisivo. Cubra o nariz com o cone do nariz. Aplicar campos estéreis para fixar a área cirúrgica.</li>
		<li>Deslocar o fluxo de isoflurano para o cone nasal. Continuar a manter a anestesia a 1,5%-2% de isoflurano.</li>
		<li>Coloque uma almofada de aquecimento sob o mouse para manter a temperatura corporal.</li>
		<li>Coloque novas luvas estéreis e, com um bisturi, faça uma incisão na linha média (~10-15 mm de comprimento) no couro cabeludo. Exponha a superfície do crânio com uma espátula enquanto usa pontas de algodão para limpar qualquer sangramento. NOTA: Use um cauterizador se sangrar profusamente, o que é raro.</li>
		<li>Esfregue com uma ponta de algodão mergulhada em peróxido de hidrogênio a 3% para expor as suturas cranianas.</li>
		<li>Tome nota de bregma e lambda para navegar pelas coordenadas do crânio. Defina todas as coordenadas como zero no bregma. NOTA: Estas coordenadas foram obtidas a partir de um atlas cerebral de camundongos14. A distância de referência bregma-lambda no atlas é de 4,21 mm. Para corrigir as diferenças de idade e sexo no tamanho do crânio, a distância bregma-lambda para cada camundongo foi medida e, em seguida, dividida por 4,21 mm para obter um fator de multiplicação. Por exemplo, se a distância entre bregma e lambda foi de 4,65 mm, a divisão por 4,21 mm deu um fator de multiplicação de 1,10. Todas as coordenadas obtidas a partir do atlas foram então multiplicadas com este fator para medir as coordenadas reais que foram usadas para perfurar o furo. No exemplo acima, as coordenadas anteroposterior (AP) e médio-lateral (ML) resultantes seriam de 0,55 e 1,1 mm, respectivamente (ou seja, 1,1 x 0,5 ou 1 mm).</li>
		<li>Use uma furadeira elétrica para fazer um furo nestas coordenadas: 0,5 mm posterior ao bregma e 1 mm lateral à linha média em direção à direita. NOTA: Ao fazer o furo no crânio, tenha cuidado para não romper a dura-máter. Certifique-se de que a broca é estéril. Pode ser colocado com outros instrumentais na mesma bolsa de autoclave para esterilização.</li>
		<li>Insira um hemostático sob a pele incisada e empurre-o para o local onde a minibomba osmótica será implantada. Abra e feche suavemente o hemostático para fazer um bolso para a minibomba.</li>
		<li>Use um hemostático estéril para escolher uma minibomba osmótica preparada da ponta do modulador de fluxo. Empurre a bomba através da pele incisada para o bolso. NOTA: Tenha cuidado para não deixar a bomba e a cânula tocarem em qualquer superfície não estéril.</li>
		<li>Aplique um pouco de cola na parte inferior da cânula e fixe-a no suporte da cânula. Abaixe a cânula lentamente através do orifício perfurado 2 mm ventral até a superfície do crânio. Deixe por pelo menos 5 min para que a cola se solidifique.</li>
		<li>Antes de inserir a cânula no cérebro, certifique-se de que a cânula não está entupida e que a solução está fluindo corretamente. NOTA: Às vezes, a glicose pode se depositar na ponta da cânula devido a uma taxa de fluxo muito baixa, bloqueando o fluxo.</li>
		<li>Com a ajuda de uma tesoura, prenda a parte superior da cânula certificando-se de que ela não se desloque da superfície do crânio.</li>
		<li>Cubra a cânula com uma camada de cimento dentário para um suporte extra.</li>
		<li>Use suturas de nylon (tamanho 5-0 e 30 polegadas de comprimento) para fechar a ferida e aplicar antibiótico tópico na ferida para prevenir a infecção.</li>
		<li>Desligue o isoflurano e deixe o animal se recuperar da anestesia. Em seguida, transfira o animal para uma nova gaiola limpa.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuidados pós-cirúrgicos<ol><li>Após a cirurgia, monitore o mouse por pelo menos 1 semana.</li>
		<li>Administrar 5 mg/kg de carprofeno por via subcutânea, uma vez a cada 24 horas durante três dias pós-operatórios.</li>
		<li>Deixe a ferida cicatrizar completamente antes de remover as suturas 7-10 dias após a cirurgia. NOTA: Observou-se que camundongos com glicose no LCR elevada demoraram mais tempo para cicatrizar. O corte de unhas nas patas traseiras de camundongos minimiza a chance de lesão no local da incisão devido ao comportamento de arranhões dos camundongos.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Substituição das minibombas
NOTA: Como as minibombas utilizadas neste estudo duram apenas 4 semanas, a substituição das minibombas também foi testada para prolongar a duração da infusão de glicose, pois pode ser necessária no caso de estudos de longo prazo. Isso envolveu as seguintes etapas.
<ol><li>Prepare os ratos para a cirurgia conforme detalhado acima.</li>
	<li>Faça uma pequena incisão vertical de 1 cm na pele ligeiramente acima da bomba.</li>
	<li>Insira um hemostático sob a pele incisada e puxe a bomba para fora.</li>
	<li>Remova a bomba da tubulação e conecte uma nova bomba preparada à tubulação.</li>
	<li>Insira a bomba de volta para dentro e costurar a pele.</li>
	<li>Siga as mesmas instruções de cuidados pós-operatórios descritas acima.</li>
</ol>4. Procedimento de recolha do LCR
<ol><li>Preparação<ol><li>Puxe capilares de vidro de 1 mm de diâmetro com uma máquina extratora de micropipeta para obter pontas de 0,5 mm de diâmetro. As configurações são: calor = 800, tração = 15, velocidade = 5 e tempo = 200 unidades. Coloque os capilares puxados em uma caixa estéril até o uso.</li>
		<li>Ligue uma agulha de 27 G a uma seringa de 1 ml. Insira o capilar puxado na agulha e use uma pequena fita adesiva para fixar a conexão.</li>
		<li>Fixe firmemente a seringa em um suporte capilar de um micromanipulador.</li>
		<li>Em seguida, prepare o mouse para a cirurgia, conforme descrito no procedimento pré-operatório acima.</li>
	</ol></li>
	<li>Procedimento cirúrgico<ol><li>Coloque o mouse sobre o quadro estereotáxico. Depois de fixar a cabeça no quadro, como descrito anteriormente, gire os botões para inclinar a cabeça de modo que o nariz fique voltado para baixo. Aplicar campos estéreis para fixar a área cirúrgica.</li>
		<li>Realizar pequena incisão na face dorsal, iniciando-se do plano intra-aural até o lado caudal. OBS: Cuidado para não danificar a tubulação durante a incisão.</li>
		<li>Remova o suporte do corpo do mouse e deixe o mouse descansar verticalmente para que o pescoço fique totalmente estendido dorsalmente.</li>
		<li>Com a ajuda de pinças rombas curvas, separa suavemente os músculos posteriores do pescoço da linha média para criar uma pequena janela. Em seguida, use um aplicador de ponta de algodão molhado para deslocar suavemente os músculos do pescoço da linha média para a periferia.</li>
		<li>Observe se a cisterna magna está exposta, que aparece como uma janela triangular com uma membrana de dura-máter transparente.</li>
		<li>Coloque o conjunto do micromanipulador na estrutura estereotáxica ao lado do mouse, certificando-se de que a ponta capilar não toque em nenhuma superfície.</li>
		<li>Quebre suavemente a ponta capilar sem atrapalhar o setup.</li>
		<li>Ao olhar para a lupa (ampliação de 2,25x), gire os botões correspondentes no micromanipulador para alinhar lentamente e mover a ponta capilar em direção à cisterna magna.</li>
		<li>Alguma resistência é sentida quando a ponta capilar toca a membrana da cisterna magna. Muito lentamente, empurre a ponta contra a membrana com a ajuda dos botões. NOTA: Tenha cuidado para não danificar quaisquer vasos sanguíneos na membrana. Este passo é muito importante para evitar qualquer contaminação sanguínea no LCR.</li>
		<li>Perfure muito suavemente a membrana. O LCR começará a fluir para o capilar imediatamente devido à pressão negativa no capilar.</li>
		<li>Deixe o setup por alguns minutos até que ~10 μL de LCR sejam coletados no capilar.</li>
		<li>Em seguida, retire lentamente o capilar da cisterna magna e pressione suavemente um aplicador de ponta de algodão estéril contra a abertura da cisterna magna para impedir o vazamento de LCR.</li>
		<li>Retire cuidadosamente o capilar da seringa e fixe-o a um dispensador de bulbo de microtampa. Pressione o bulbo para transferir o LCR para um tubo de microcentrífuga estéril.</li>
		<li>Coloque um suporte sob o mouse e gire os botões estereotáxicos para nivelar a cabeça.</li>
		<li>Feche a ferida com suturas de nylon.</li>
		<li>Injetar 300 μL de soro fisiológico estéril por via subcutânea antes de remover o camundongo do aparelho.</li>
		<li>Dar cuidados pós-operatórios aos animais conforme descrito acima, até chegar a hora de retirar as suturas-~7-10 dias após a cirurgia.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Dosagem de glicose
<ol><li>Seguir o protocolo descrito no kit de dosagem colorimétrica de glicose.</li>
	<li>Diluir a solução-mãe tampão de fosfato de sódio fornecida no kit até à concentração de 50 mM em água ultrapura.</li>
	<li>Preparar padrões de glicose em intervalos de 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25 e 50 mg/dL a partir da solução-estoque de 1.000 mg/dL fornecida no kit em solução tampão diluída.</li>
	<li>Preparar uma diluição de 7 vezes das amostras de LCR no tampão. Por exemplo, se o volume total de LCR coletado for de 10 μL, o volume diluído sete vezes será de 70 μL.</li>
	<li>Pipetar 15 μL de padrões de glicose e LCR diluído em duplicatas em placa de 96 poços.</li>
	<li>Pipetar 85 μL de tampão diluído em cada um dos poços com padrões e LCR.</li>
	<li>Adicione 6 ml de tampão diluído ao frasco para injetáveis de mistura de enzimas calorimétricas de glicose e agite-o durante alguns segundos para misturar completamente.</li>
	<li>Adicionar 100 μL da preparação da mistura enzimática a cada poço para iniciar a reação.</li>
	<li>Sele a placa com uma folha de cobertura e bata na placa suavemente para misturar os reagentes.</li>
	<li>Colocar a placa numa incubadora a 37 °C durante 10 min. Frascos com glicose alta começam a ficar violetas imediatamente.</li>
	<li>Após 10 min, retire a tampa e meça a absorbância a 500-520 nm usando um leitor de placas.</li>
	<li>Calcular a concentração de glicose nas amostras de LCR interpolando seus valores a partir da curva padrão.</li>
</ol>6. Dosagem de glicemia
<ol><li>Faça um pequeno corte lateral na cauda do rato usando uma lâmina de barbear e use uma gota de sangue para medir a glicose no sangue com um glicosímetro, de acordo com as instruções do manual.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Este artigo relata um protocolo detalhado para aumentar a glicose no LCR em camundongos usando minibombas osmóticas conectadas a uma cânula implantada no ventrículo lateral. A infusão crônica de glicose no cérebro de camundongos através deste procedimento será útil para delinear os efeitos da hiperglicorraquia a longo prazo sobre a cognição, metabolismo sistêmico de glicose e balanço energético e para melhor compreensão da patogênese das complicações do diabetes.
O diabetes crônico causa dano ...

Tanto o diabetes tipo 1 quanto o tipo 2 prejudicam a função cerebral 1,2,3. Por exemplo, o diabetes aumenta o risco de declínio cognitivo e doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer 3,4. Além disso, pessoas com diabetes apresentam sensibilidade cerebral defeituosa de glicose 5,6. Esse defeito contribui para a patogênese da hipoglicemia associada ao desconhecimento e a uma resposta contra-regulatória insuficiente à hipoglicemia7,8, que pode ser fatal se não tratada imediatamente.
Considerando que o diabetes aumenta os níveis de glicose no sangue, bem como no líquido cefalorraquidiano (LCR)9, é importante determinar se um ou ambos os fatores contribuem para o comprometimento da função cerebral. Se o diabetes causa danos cerebrais por glicose elevada no LCR sozinho ou em combinação com outros fatores, como deficiência de insulina ou resistência à insulina, também é uma questão em aberto. Modelos animais de diabetes tipo 1 e tipo 2 apresentam declínio cognitivo e neurodegeneração, além de comprometimento do balanço energético e do metabolismo periférico da glicose10,11,12,13. No entanto, a partir desses modelos, não é viável desacoplar os efeitos seletivos da glicose no LCR versus os níveis glicêmicos na mediação das complicações do diabetes na função cerebral.
Este protocolo descreve métodos para desenvolver um modelo de hiperglicorraquia em camundongos para testar os efeitos de níveis cronicamente altos de glicose no LCR sobre a função cerebral, balanço energético e homeostase da glicose. O modelo murino desenvolvido através desta técnica apresenta uma ferramenta para estudos que investigam o papel etiológico da homeostase desregulada da glicose na função neural e comportamental.
Portanto, a abordagem proposta será útil na compreensão dos efeitos diretos dos níveis elevados de glicose no LCR em várias condições fisiopatológicas.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m seringa filtro</td><td>Soluções</td><td>de membrana SFPES030022S</td><td></td></tr><tr><td>1 mL seringa estéril (ponta Luer-lok)</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>1 mL TB seringa</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>100 mL Copo de vidro</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>100% Etanol (Koptec)</td><td>DLI</td><td>UN170</td><td>Use 70% de diluição para limpar a área de cirurgia</td></tr><tr><td>Tubo cônico de 50 mL</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Indicador de alinhamento</td><td>KOPF</td><td>1905</td><td></td></tr><tr><td>Kit de infusão cerebral Alzet</td><td>DURECT</td><td>Kit # 3; 0008851</td><td>Corte a tubulação no kit para 1 polegada de comprimento</td></tr><tr><td>Bomba osmótica Alzet</td><td>DURECT</td><td>2004</td><td>Taxa de fluxo 0,25 &micro; Sistema de anestesia L/h</td></tr><tr><td></td><td>Kent Scientific</td><td>SomnoSuite</td><td></td></tr><tr><td>Solução Betadine</td><td>Avrio Health</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 . 2H2O</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de cânula</td><td>KOPF</td><td>1966</td><td></td></tr><tr><td>Escopo de centralização</td><td>KOPF</td><td>1915</td><td></td></tr><tr><td>Cimento Dental Líquido</td><td>Lang Dental</td><td>REF1404</td><td></td></tr><tr><td>Cimento dental em pó Lang</td><td>Dental</td><td>REF1220-C</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose&nbsp; &nbsp;</td><td>Berbequim elétrico Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td></td><td>KOPF</td><td>1911</td><td>Ao fazer um furo, evite romper a dura-máter</td></tr><tr><td>Lubrificante ocular (Optixcare)</td><td>CLC Medica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de esferas de vidro (Germinator 500)</td><td>VWR</td><td>101326-488</td><td>Coloque os instrumentos em água estéril para deixá-los esfriar antes da cirurgia</td></tr><tr><td>Kit de ensaio de glicose</td><td>Cayman 10009582</td><td></td> <td>químico</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>H1009-500ml</td><td>Aplique 3% de H2O2 na superfície do crânio para tornar as suturas cranianas visíveis.</td></tr><tr><td>Máquina de cortar cabelo</td><td>WAHL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>almofada de aquecimento</td><td>Heatpax</td><td>19520483</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (Fluriso)</td><td>Zoetis</td><td>NDC1385-046-60</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>0395-500g</td><td></td></tr><tr><td>Suporte magnético</td><td>WPI</td><td>M1</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada de mesa de aumento</td><td>Brightech</td>Espátula de Metal <td>LightView Pro Flex 2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 . 6H2O</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador (Destro)</td><td>WPI</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador com display digital</td><td>KOPF</td><td>1940</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 . 7H2O</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-5Kg</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 . H2O</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>Neosporin</td><td>Johnson & Johnson</td><td>N/A</td><td>Aplicar pomada tópica para prevenir infecções</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>DM-999</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl (Carprofeno) 50mg/ml</td><td>Zoetis</td><td>N/A</td><td>5 mg/kg, subcutâneo, para analgesia</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de alinhamento estereotáxico</td><td>KOPF</td><td>1900</td><td></td></tr><tr><td>Agulha estéril de calibre 27</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores de ponta de algodão estéreis (Solon)</td><td>AMD Medicom</td><td>56200</td><td></td></tr><tr><td>Suturas de nylon estéreis (5.0)</td><td>Oasis</td><td>MV-661</td><td>Use sutura não absorvível para fechar a ferida</td></tr><tr><td>Tesoura afiada estéril&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas cirúrgicas estéreis</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Luvas cirúrgicas (Nitrilo)</td><td>Ammex</td><td>N/A</td><td>Troque as luvas se houver suspeita de contaminação</td></tr><tr><td>Tabuleiro</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

implante de minibomba osmótica para aumento da concentração de glicose no líquido cefalor de camundongos

Osmotic Minipump Implantation for Increasing Glucose Concentration in Mouse Cerebrospinal Fluid

O diabetes aumenta o risco de declínio cognitivo e prejudica a função cerebral. Se essa relação entre glicose alta e déficits cognitivos é causal ou não, permanece indefinido. Além disso, também não está claro se esses déficits são mediados por um aumento nos níveis de glicose no líquido cefalorraquidiano (LCR) e/ou no sangue. Há poucos estudos investigando os efeitos diretos dos altos níveis de glicose no LCR sobre a função do sistema nervoso central (SNC), especialmente sobre a aprendizagem e a memória, uma vez que os modelos atuais de diabetes não estão suficientemente desenvolvidos para abordar tais questões de pesquisa. Este artigo descreve um método para aumentar cronicamente os níveis de glicose no LCR por 4 semanas por meio da infusão contínua de glicose no ventrículo lateral usando minibombas osmóticas em camundongos. O protocolo foi validado medindo-se os níveis glicêmicos no LCR. Esse protocolo aumentou os níveis de glicose no LCR para ~328 mg/dL após a infusão de uma solução de glicose a 50% a uma taxa de fluxo de 0,25 μL/h, em comparação com uma concentração de glicose no LCR de ~56 mg/dL em camundongos que receberam líquido cefalorraquidiano artificial (LCRa). Além disso, esse protocolo não afetou os níveis glicêmicos. Portanto, este método pode ser usado para determinar os efeitos diretos da glicose elevada no LCR sobre a função cerebral ou uma via neural específica, independentemente de alterações nos níveis de glicose no sangue. Em geral, a abordagem descrita aqui facilitará o desenvolvimento de modelos animais para testar o papel da glicose elevada no LCR na mediação de características da doença de Alzheimer e/ou outras doenças neurodegenerativas associadas ao diabetes.

Camundongos machos foram implantados com uma cânula montada em uma minibomba osmótica (Figura 1) para infundir cronicamente aCSF ou uma solução de glicose a 50% em seus ventrículos laterais (Figura 2). O LCR foi coletado 10 dias após a cirurgia (Figura 3) para validar a eficácia desse procedimento. Os resultados mostraram um aumento nos níveis de glicose no LCR (média: 327,7 mg/dL) em camundongos infundidos com glicose a 50% em comp...

Este artigo descreve um protocolo detalhado para aumentar a concentração de glicose no líquido cefalorraquidiano (LCR) de camundongos. Esta abordagem pode ser útil para estudar os efeitos da glicose elevada no LCR sobre a neurodegeneração, cognição e metabolismo periférico da glicose em camundongos.

Implante de Minibomba Osmótica para Aumento da Concentração de Glicose no Líquido Cefalor de Camundongos

Diabetes increases the risk of cognitive decline and impairs brain function. Whether or not this relationship between high glucose and cognitive deficits ...

Esta técnica aumenta os níveis de glicose no líquido cefalorraquidiano ou no LCR em camundongos sem afetar sua concentração de glicose no sangue. Isso ajuda a investigar os efeitos diretos dos altos níveis de glicose no LCR na função cerebral do animal. Esta técnica pode estabelecer modelos animais para explorar o papel teológico da glicose mais elevada no LCR na disfunção cognitiva.Levando à descoberta de novos alvos moleculares para melhorar a função cognitiva. O método também ajudará a determinar se altos níveis de glicose no LCR são suficientes para mediar fenótipos de doenças neurodegenerativas em camundongos. Deve-se atentar para a montagem e priming adequados da montagem da cânula e inserção da cânula no cérebro nas coordenadas corretas.Para iniciar a cirurgia de Implante de Minibomba Osmótica coloque o mouse anestesiado sobre o quadro estereotáxico. Encaixe a cabeça do animal na barra do incisivo. Cubra o nariz com o cone nasal para manter a anestesia e conecte o fluxo de isofluorano ao cone nasal a uma taxa de 1,5 a 2% Coloque uma almofada de aquecimento sob o mouse para manter a temperatura corporal.Depois de desinfetar a área cirúrgica e fazer uma incisão, exponha a superfície do crânio com uma espátula e limpe o sangue, se houver, com pontas de algodão. Use um cauterizador se sangrar profusamente. Esfregue com uma ponta de algodão mergulhada em peróxido de hidrogênio a 3% para expor as suturas cranianas.Trabalhando sob um microscópio, tome nota de bregma e lambda para navegar pelas coordenadas do crânio. Defina todas as coordenadas como zero no bregma. Usando uma furadeira elétrica cuidadosamente e sem romper a dura-máter faça um furo nas coordenadas 0,5 milímetros posterior ao bregma e 1 milímetro lateral à linha média em direção à direita.Insira um hemostático e abra-o e feche suavemente para fazer um bolso para a mini bomba. Segurando a bomba a partir da ponta do modulador de fluxo, empurre-a através da pele incisada para o bolso criado. Aplique um pouco de cola na parte inferior da cânula e fixe-a no suporte da cânula.Certifique-se de que a cânula não está entupida e que a solução está fluindo corretamente. Em seguida, abaixe a cânula lentamente através do orifício perfurado, dois milímetros ventral até a superfície do crânio. Deixe por pelo menos cinco minutos para que a cola se solidifique.Com a ajuda de uma tesoura, prenda a parte superior da cânula garantindo que ela não se desloque da superfície do crânio. Cubra a cânula com uma camada de cimento dentário para um suporte extra. Para a coleta de líquido cefalorraquidiano ou LCR, coloque o mouse devidamente anestesiado no quadro estereotáxico.Depois de fixar a cabeça no quadro, como demonstrado anteriormente, gire os botões para inclinar a cabeça de modo que o nariz fique voltado para baixo. Depois de desinfetar a área cirúrgica e fazer uma incisão, remova o suporte do corpo do mouse e deixe o mouse descansar verticalmente para que o pescoço fique totalmente estendido dorsalmente. Usando pinças rombas curvas, bissetriz suavemente os músculos posteriores do pescoço a partir da linha média para criar uma pequena janela.Em seguida, use um aplicador de ponta de algodão molhado para deslocar suavemente os músculos do pescoço da linha média para a periferia. Observe se a cisterna magna está exposta como uma janela triangular com uma membrana dura transparente. Coloque o conjunto do micromanipulador na estrutura estereotáxica ao lado do mouse, garantindo que a ponta capilar não toque em nenhuma superfície.Quebre suavemente a ponta capilar sem atrapalhar o setup. Gire os botões correspondentes no micromanipulador para alinhar lentamente e mover a ponta capilar em direção à cisterna magna. Alguma resistência é sentida quando a ponta capilar toca a membrana da cisterna magna.Muito lentamente, empurre a ponta contra a membrana com a ajuda dos botões tomando cuidado para não danificar quaisquer vasos sanguíneos na membrana. À medida que a membrana é perfurada, o LCR flui para o capilar de uma só vez devido à pressão capilar negativa. Deixe o setup por alguns minutos até que aproximadamente 10 microlitros de líquor se acumulem no capilar.Retire cuidadosamente o capilar da seringa e fixe-o a um dispensador de bulbo de microtampa. Pressione o bulbo para transferir o LCR para um tubo de microcentrífuga estéril. Coloque o suporte sob o mouse e gire os botões estereotáxicos para nivelar a cabeça.Feche a ferida com suturas de nylon. Injetar 300 microlitros de soro fisiológico estéril por via subcutânea antes de retirar o camundongo do aparelho. Dar cuidados pós-operatórios aos animais até chegar a hora de retirar as suturas, cerca de 7 a 10 dias após a cirurgia.O LCR coletado 10 dias após a cirurgia mostrou um aumento de cerca de seis vezes no nível de glicose em camundongos, infundido com glicose a 50% em comparação com o de camundongos infundidos com LCR. No entanto, os níveis glicêmicos não foram diferentes entre os grupos. Ao abaixar a cânula no cérebro, retraia-a e verifique se o LCR sai do buraco.Também é vital identificar corretamente a cisterna magna e evitar a contaminação do LCR com sangue. Esta técnica também pode ser usada para entregar qualquer droga que é incapaz de atravessar a barreira hemato - encefálica para testar o seu efeito na função cerebral. Há um número muito limitado de modelos animais de diabetes, e eles perturbam a homeostase da glicose no ambiente periférico.Esse modelo, no entanto, ajuda a investigar alterações cerebrais específicas na regulação da glicose sobre a função neural.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Como neurociência inquérito se torna mais sofisticada investigação, de estruturas cerebrais e circuitos exige melhores níveis de precisão e de alta resolução. Nós desenvolvemos um método para a preparação e implantação de um sistema de infusão crônica no cérebro utilizando uma microcânula borosilicato com um diâmetro da ponta de 50 microns.

Construção e Implantação de um Sistema de Microinfusion para entrega Sustentada de Agentes neuroativos.

Um dispositivo perifusion microfluídicos ilhota foi desenvolvido para a avaliação dinâmica da secreção de insulina de ilhotas múltiplo e imagens de fluorescência simultânea de influxo de cálcio e mitocondrial possíveis mudanças.

A Multi-Parametric Sistema Perifusion Islet dentro de um dispositivo Perifusion microfluídicos

Neste vídeo, demonstramos a montagem de um sistema de infusão cerebral com bomba micro-osmótica seguida de sua implantação cirúrgica no crânio do camundongo. Este sistema permite a entrega contínua de medicamentos potenciais e facilita o estudo de seus efeitos no cérebro e no tecido cerebral.

Sistema de Infusão Contínua de Medicamentos em Modelo de Camundongo: Um Procedimento Cirúrgico para Implantar Sistema de Infusão de Bomba Micro-osmótica no Cérebro de Camundongo para Administração Contínua de Medicamentos

Este vídeo demonstra o efeito da infusão contínua de drogas no cérebro do camundongo nos níveis de glicose no sangue. O metabolismo da glicose é avaliado coletando sangue da cauda de um camundongo em jejum e medindo os níveis de glicose antes e depois da administração oral de glicose. A tolerância à insulina é avaliada pela injeção de insulina no camundongo, com níveis de glicose registrados em intervalos específicos.

Avaliando o efeito da infusão contínua de drogas no cérebro de camundongos nos níveis periféricos de glicose

Fonte: Wang, X. et. al., Entrega de medicamentos baseada em bomba osmótica para pesquisa de remielinização in vivo no sistema nervoso central. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra o método de administração de medicamentos neuroterapêuticos usando uma bomba osmótica em um modelo de camundongo desmielinizado. A liberação controlada do medicamento promove a remielinização ativando as células produtoras de mielina no corpo caloso.

 Entrega de medicamentos neuroterapêuticos baseados em bomba osmótica em um modelo de camundongo desmielinizado

A atividade de neurônios individuais de ratos em idade adulta pode ser estudado por dissociar os neurônios de regiões específicas do cérebro e usando membrana fluorescente potencial de imagem corante. Por testes de respostas a alterações nos níveis de glucose, esta técnica pode ser utilizada para estudar a sensibilidade à glicose dos neurónios hipotalâmicos ventromediais adultos.

Membrana Potencial Dye imagem de Ventromedial Hipotálamo Neurônios de camundongos adultos para estudar Glucose Sensing

Para estudar a reorganização cerebral em condições patológicas, usamos bombas miniosmóticas para entrega direta de proteínas no cérebro, contornando a barreira hematoencefálica. Os traçadores do trato são então injetados para estudar alterações na conectividade cerebral sob a influência da proteína.

Implantação de miniosmóticas Bombas e Entrega de Tracers Trato de Estudar Reorganização do cérebro em condições fisiopatológicas

Este protocolo estuda o papel do ligante de chemokine (C-C motif) 5 (CCL5) no hipotálamo, entregando um antagonista, MetCCL5, dentro do cérebro de rato usando um sistema de infusão de cérebro de bomba micro-osmótica. Esta inibição transitória de CCL5 atividade interrompida hipotalâmica insulina sinalização, levando à intolerância à glicose e a sensibilidade periférica à insulina sistêmica.

Estudando o sinal de insulina hipotalâmico a intolerância de glicose periférica com um sistema de infusão contínua de drogas dentro do cérebro de rato

A administração crônica de isoproterenol através de uma bomba osmótica implantada tem sido amplamente utilizada para imitar a insuficiência cardíaca avançada em camundongos. Aqui, nós descrevemos métodos detalhados no implante cirúrgico da mini-bomba para a administração contínua do isoproterenol sobre 3 semanas, assim como, Avaliação ecocardiográfica para a criação bem sucedida do modelo.

Implante de uma Minibomba isoproterenol para induzir insuficiência cardíaca em camundongos

Fornecemos um protocolo para gerar um modelo de rato de dytonia DYT/PARK-ATP1A3 farmacológico através da implantação de cânulas em gânglios basais e cerebelo ligados a bombas osmóticas. Descrevemos a indução de movimentos semelhantes à distonia através da aplicação de um desafio motor e a caracterização do fenótipo através de sistemas de pontuação comportamental.

Implantação de Bombas Osmóticas e Indução de Estresse para Estabelecer um Modelo de Rato Sintomático e Farmacológico para DyT/PARK-ATP1A3 Dystonia

A desmielinização ocorre em múltiplas doenças do sistema nervoso central. Uma técnica confiável de entrega de medicamentos in vivo é necessária para remyeliar testes de drogas. Este protocolo descreve um método baseado em bomba osmótica que permite a entrega de drogas a longo prazo diretamente no parenchyma cerebral e melhora a biodisponibilidade da droga, com ampla aplicação em pesquisas de remyelination.

Entrega de drogas baseada em bomba osmótica para pesquisa de remyelination in vivo sobre o sistema nervoso central

Aprenda a implantar minibomba osmótica para elevar glicose no líquido cefalorraquidiano de camundongos sem alterar glicemia. Este método permite estudar neurodegeneração e função cognitiva.

Implante de Minibomba Osmótica para Aumento da Concentração de Glicose no Líquido Cefalor de Camundongos

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