Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos
21 de abril de 2023
Este protocolo detalha o procedimento para obter imagens de respostas de cálcio no colículo superior (CS) de camundongos acordados, incluindo a obtenção de imagens da atividade de um único neurônio com microscopia de dois fótons, deixando o córtex intacto em camundongos selvagens, e a obtenção de imagens de todo o SC com microscopia de campo largo em camundongos mutantes do córtex parcial.
Minha pesquisa se concentra em codificação neural e mecanismos de processamento visual. Estamos tentando responder como várias informações são codificadas no cérebro, especialmente no colículo superior sob os neuro-mecanismos subjacentes. Para entender o processamento visual, os cientistas combinam várias abordagens, incluindo morfologia neuronal, traçado anterógrado e retrógrado, sequenciamento de IL, modelagem neuro, aprendizado de máquina, é bem compreendido.
O desafio é remover o crânio sobre o SSA, cortando e deixado no osso em um pedaço maior, é provável que falhe porque o osso está ligado à dura-máter. Combinando duas fotos em uma imagem de cálcio de campo amplo, nosso trabalho recente revelou a arquitetura de função da direção do movimento no SC do camundongo em resolução de célula única e escala global. Descobrimos que neurônios com preferência semelhante formam manchas de até 500 micrômetros sob o movimento global para cima no movimento nasal.
Com nosso protocolo, estamos abordando duas lacunas de pesquisa. Primeiro, os pesquisadores podem realizar imagens de gesso de longo prazo em SC de camundongos em uma única resolução de célula sem quebrar o córtex. Em segundo lugar, os pesquisadores podem registrar a neuroatividade em toda a CS usando microscópio de campo largo.
Nosso protocolo fornece uma medida para obter imagens das CT póstero-mediais em resolução de célula única com um córtex intacto em camundongos. Além disso, usamos um plugue biocompatível para expor o SC, o que reduz a infecção por exames crônicos. Nossos resultados fornecem uma maneira de estudar a codificação neural da informação visual através de um grande campo visual.
Combinado com a optogenética, pode-se estudar meias entradas de diferentes regiões cerebrais modulando a neuroatividade em CT.
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Visão Geral
Este estudo fornece um protocolo para a aquisição de respostas de cálcio no colículo superior (SC) de camundongos acordados, utilizando microscopia de dois fótons para capturar a atividade de neurônios individuais preservando a região cortical em camundongos selvagens, e empregando microscopia de campo amplo para todo o SC em camundongos mutantes com córtex parcial.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Técnicas de Imagem
- Processamento Visual
Contexto
- O colículo superior desempenha um papel crucial no processamento de informações visuais.
- Compreender a codificação neuronal no CS é essencial para elucidar os mecanismos de processamento visual.
- Métodos de imagem anteriores podem comprometer a integridade cortical, complicando estudos de gravação de longo prazo.
- Este protocolo busca enfrentar esses desafios ao fornecer uma abordagem minimamente invasiva para a aquisição de imagens.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um método confiável para imageamento prolongado de cálcio no SC de camundongos.
- Facilitar a gravação de atividade neural em todo o SC sem perturbar o córtex.
- Aprimorar a compreensão de como as informações visuais são representadas neuronalmente no SC.
Métodos Utilizados
- O estudo emprega técnicas de microscopia de dois fótons e campo amplo.
- São utilizados modelos de camundongos selvagens e mutantes, empregando um vírus adeno-associado para expressar GCaMP6m para imageamento de cálcio.
- As principais metodologias incluem a implantação de placa craniana, abordagens cirúrgicas para expor o SC e o uso de uma cúpula de sucção para imageamento crônico.
- Após a injeção viral, é observado um período de recuperação de três semanas antes do início do imageamento.
- Os passos cirúrgicos detalhados garantem danos mínimos aos tecidos circundantes.
Resultados Principais
- O protocolo permite o exame detalhado da atividade neuronal associada às preferências de direção do movimento dentro do colículo superior.
- Os resultados indicam que neurônios que exibem preferências semelhantes podem se agrupar, afetando o processamento de sinais visuais em áreas extensas.
- A imagem crônica é viável enquanto se mantém a integridade cortical, facilitando estudos contínuos da dinâmica neuronal.
- A combinação de dados de imagem com optogenética permite investigar entradas modulatórias provenientes de outras regiões do cérebro.
Conclusões
- Este estudo estabelece um método robusto para analisar a sinalização de cálcio no colículo superior, contribuindo significativamente para a compreensão dos mecanismos de processamento visual.
- As técnicas de imagem descritas prometem avanços em estudos longitudinais da atividade neuronal em animais acordados.
- Essas metodologias aprimorarão a investigação dos mecanismos neuronais e suas implicações para o comportamento visual e distúrbios associados.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem de cálcio de alta resolução no colículo superior (CS) de camundongos permite a investigação direta da codificação neural subjacente ao processamento visual, apoiando a redução de riscos mecanicistas na fase de validação de alvos. A capacidade de capturar tanto a atividade de células individuais quanto de estruturas inteiras em animais acordados fornece confiança preditiva para portfólios de neurociência translacional e neurofarmacologia. Essa abordagem em dupla escala fortalece decisões precoces de descoberta e orienta o desenvolvimento de ensaios posteriores para alvos do sistema visual.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a mapeamento funcional de circuitos de processamento visual em níveis celulares e de rede.
- Apoia a redução de riscos mecanicistas ao distinguir codificação neural herdada versus de novo no SC.
- Fornece dados quantitativos de atividade neural para orientar a seleção e validação de alvos.
- Facilita a investigação orientada por hipóteses sobre a codificação de características visuais em sistemas relevantes para doenças.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Estabelece plataformas de imagem validadas para medição reprodutível de respostas neuronais.
- Fornece leituras quantitativas e escaláveis adequadas para triagem de compostos em modelos de via visual.
- Permite a padronização de condições de ensaio para comparabilidade entre estudos e equipes.
- Apoia o desenvolvimento de ensaios de triagem fenotípica robustos para compostos neuroativos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha medições de atividade neural com biomarcadores translacionais da função visual.
- Fornece continuidade do codificação neural em estágio de descoberta até a validação pré-clínica de intervenções no sistema visual.
- Permite o avanço ajustado ao risco de alvos na via visual com base em dados funcionais in vivo.
- Apoia estudos mecanicistas de modulação de circuitos mediante integração optogenética.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de imagem conecta a descoberta inicial e a pesquisa pré-clínica ao permitir testes de hipóteses, esclarecimento de vias e análises quantitativas no SC. Está posicionado para integração desde a validação de alvos até a identificação de compostos líderes e estudos translacionais.
- Biologia da Descoberta: Facilita a medição direta da codificação neural e da função de vias no colículo superior.
- Triagem: Fornece saídas de imagem quantitativas e reprodutíveis para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Fornece dados de alto conteúdo sobre a atividade neuronal, permitindo comparações estatísticas entre condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a atividade neural in vivo a possíveis biomarcadores para distúrbios do sistema visual.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma de imagem reutilizável, adaptável a outras regiões cerebrais e questões de pesquisa.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de processamento visual.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho de imagem para garantir reprodutibilidade e escalabilidade entre estudos.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção e a eficiência do capital ao fornecer dados funcionais robustos no início do processo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos do sistema visual e apoia decisões de avanço com evidências quantitativas.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em imagem in vivo, preparo cirúrgico e análise de dados.
- Exige acesso a plataformas de microscopia de dois fótons e de campo amplo, além de infraestrutura de apoio.
- Necessita padronização entre equipes nos procedimentos de manejo de animais, entrega viral e protocolos de imagem.
- Adaptável a outras regiões cerebrais com modificações nos protocolos, conforme suportado pela fonte.
- A estabilidade prolongada da imagem e o direcionamento preciso são considerações práticas para estudos crônicos.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:41
Preparation of a Suction Cup and Plugs for Calcium Imaging in Mouse
4:30
Viral Construct (AAV) Injection in Mouse Superior Colliculus for Calcium Imaging
5:48
Implantation of the Headplate in Mouse for Calcium Imaging
6:40
Implanting the Plug in the Mouse for Calcium Imaging
8:06
Two‐Photon Calcium Imaging of Mouse Superior Colliculus Neurons
9:37
Wide‐Field Calcium Imaging of Mouse Superior Colliculus Neurons
