Name: Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Aprenda ensaios independentes de oxigênio para medir a função mitocondrial em células de mamíferos sob hipóxia. Este método utiliza espectrometria de massas e traçadores isotópicos estáveis para avaliar vias metabólicas alternativas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

As figuras produzidas neste manuscrito foram criadas com BioRender.com. Somos gratos a Amy Walker por fornecer feedback sobre este artigo. J.B.S. foi apoiado pela Worcester Foundation for Biomedical Research Grant.

Rastreamento de isótopos estáveis e análise LC-MS para medir as atividades de DHODH e SDH

<ol><li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li>
<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2, 16080(2016).</li>
<li>Chandel, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+generated+at+mitochondrial+complex+III+stabilize+hypoxia-inducible+factor-1alpha+during+hypoxia%3A+A+mechanism+of+O2+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III stabilize hypoxia-inducible factor-1alpha during hypoxia: A mechanism of O2 sensing.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25130-25138 (2000).</li>
<li>Cadenas, E., Boveris, A., Ragan, C. I., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+superoxide+radicals+and+hydrogen+peroxide+by+NADH-ubiquinone+reductase+and+ubiquinol-cytochrome+C+reductase+from+beef-heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide by NADH-ubiquinone reductase and ubiquinol-cytochrome C reductase from beef-heart mitochondria.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 180 (2), 248-257 (1977).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li>
<li>Spinelli, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fumarate+is+a+terminal+electron+acceptor+in+the+mammalian+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain.</a> Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).</li>
<li>Kumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+redox+cycle+with+complex+II+prioritizes+sulfide+quinone+oxidoreductase-dependent+H%282%29S+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A redox cycle with complex II prioritizes sulfide quinone oxidoreductase-dependent H(2)S oxidation.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (1), 101435(2022).</li>
<li>Warburg, O., Geissler, A. W., Lorenz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+growth+of+cancer+cells+in+media+in+which+glucose+is+replaced+by+galactose%5BTitle%5D)+AND+%22Hoppe-Seyler%27s+Zeitschrift+f%C3%BCr+Physiologische+Chemie%22%5BJournal%5D)">On growth of cancer cells in media in which glucose is replaced by galactose.</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie. 348 (12), 1686-1687 (1967).</li>
<li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+the+Crabtree+effect%3A+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicological Sciences. 97 (2), 539-547 (2007).</li>
<li>Attardi, G., King, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cells+lacking+mtDNA%3A+Repopulation+with+exogenous+mitochondria+by+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation.</a> Science. 246 (4929), 500-503 (1989).</li>
<li>Bodnar, A. G., Cooper, M., Leonard, J. V., Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory-deficient+human+fibroblasts+exhibiting+defective+mitochondrial+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Respiratory-deficient human fibroblasts exhibiting defective mitochondrial DNA replication.</a> Biochemical Journal. 305, 817-822 (1995).</li>
<li>Gregoire, M., Morais, R., Quilliam, M. A., Gravel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+auxotrophy+for+pyrimidines+of+respiration-deficient+chick+embryo+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">On auxotrophy for pyrimidines of respiration-deficient chick embryo cells.</a> European Journal of Biochemistry. 142 (1), 49-55 (1984).</li>
<li>Mackay, G. M., Zheng, L., vanden Broek, N. J., Gottlieb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+metabolism+using+LC-MS+and+isotope+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell metabolism using LC-MS and isotope tracers.</a> Methods in Enzymology. 561, 171-196 (2015).</li>
<li>Heinrich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+for+natural+isotope+abundance+and+tracer+impurity+in+MS-%2C+MS%2FMS-+and+high-resolution-multiple-tracer-data+from+stable+isotope+labeling+experiments+with+IsoCorrectoR%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Correcting for natural isotope abundance and tracer impurity in MS-, MS/MS- and high-resolution-multiple-tracer-data from stable isotope labeling experiments with IsoCorrectoR.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17910(2018).</li>
<li>Lee, P., Chandel, N. S., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+adaptation+to+hypoxia+through+hypoxia+inducible+factors+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular adaptation to hypoxia through hypoxia inducible factors and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (5), 268-283 (2020).</li>
<li>Bisbach, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Succinate+can+shuttle+reducing+power+from+the+hypoxic+retina+to+the+O%282%29-rich+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Succinate can shuttle reducing power from the hypoxic retina to the O(2)-rich pigment epithelium.</a> Cell Reports. 31 (2), 107606(2020).</li>
<li>Angebault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idebenone+increases+mitochondrial+complex+I+activity+in+fibroblasts+from+LHON+patients+while+producing+contradictory+effects+on+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Idebenone increases mitochondrial complex I activity in fibroblasts from LHON patients while producing contradictory effects on respiration.</a> BMC Research Notes. 4, 557(2011).</li>
<li>Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Methods in Cell Biology. 155, 3-31 (2020).</li>
<li>Iwai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+accumulation+during+ischemia+induces+mitochondrial+damage+in+perfused+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Sodium accumulation during ischemia induces mitochondrial damage in perfused rat hearts.</a> Cardiovascular Research. 55 (1), 141-149 (2002).</li>
<li>Murphy, E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+and+mitochondrial+sodium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular and mitochondrial sodium in health and disease.</a> Circulation Research. 104 (3), 292-303 (2009).</li>
<li>Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+analysis+of+mitochondria+from+cultured+cells+and+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52076(2015).</li>
<li>Murphy, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+measuring+reactive+oxygen+species+and+oxidative+damage+in+cells+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo.</a> Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).</li>
<li>Xiao, Y., Meierhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+hydroethidine-based+probes+reliable+for+reactive+oxygen+species+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Are hydroethidine-based probes reliable for reactive oxygen species detection.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 31 (4), 359-367 (2019).</li>
<li>DeBerardinis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+aerobic+glycolysis%3A+Transformed+cells+can+engage+in+glutamine+metabolism+that+exceeds+the+requirement+for+protein+and+nucleotide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Beyond aerobic glycolysis: Transformed cells can engage in glutamine metabolism that exceeds the requirement for protein and nucleotide synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19345-19350 (2007).</li>
<li>Keeley, T. P., Mann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+physiological+normoxia+for+improved+translation+of+cell+physiology+to+animal+models+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Defining physiological normoxia for improved translation of cell physiology to animal models and humans.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 161-234 (2019).</li>
<li>Ast, T., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+and+mammalian+cell+culture%3A+Are+we+repeating+the+experiment+of+Dr.+Ox%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Oxygen and mammalian cell culture: Are we repeating the experiment of Dr. Ox.</a> Nature Metabolism. 1 (9), 858-860 (2019).</li>
<li>Gu, C., Jun, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+hypoxia+decrease+the+metabolic+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Does hypoxia decrease the metabolic rate.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 668(2018).</li>
<li>Voorde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+metabolic+fidelity+of+cancer+models+with+a+physiological+cell+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Advances%22%5BJournal%5D)">Improving the metabolic fidelity of cancer models with a physiological cell culture medium.</a> Scientific Advances. 5 (1), 7314(2019).</li>
<li>Cantor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologic+medium+rewires+cellular+metabolism+and+reveals+uric+acid+as+an+endogenous+inhibitor+of+UMP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Physiologic medium rewires cellular metabolism and reveals uric acid as an endogenous inhibitor of UMP synthase.</a> Cell. 169 (2), 258-272 (2017).</li>
<li>MacPherson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+relevant+T+cell+expansion+media+activate+distinct+metabolic+programs+uncoupled+from+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Clinically relevant T cell expansion media activate distinct metabolic programs uncoupled from cellular function.</a> Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 24, 380-393 (2022).</li>
<li>Torres-Quesada, O., Doerrier, C., Strich, S., Gnaiger, E., Stefan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+cell+culture+media+tune+mitochondrial+bioenergetics+and+drug+sensitivity+in+cancer+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Physiological cell culture media tune mitochondrial bioenergetics and drug sensitivity in cancer cell models.</a> Cancers. 14 (16), 3917(2022).</li>
<li>Chan, S. W., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mtDNA+damage+using+a+supercoiling-sensitive+qPCR+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring mtDNA damage using a supercoiling-sensitive qPCR approach.</a> Methods in Molecular Biology. 554, 183-197 (2009).</li>
<li>Doherty, E., Perl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+mass+by+flow+cytometry+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Reactive+Oxygen+Species%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial mass by flow cytometry during oxidative stress.</a> Reactive Oxygen Species. 4 (10), 275-283 (2017).</li>
<li>Birsoy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+of+the+mitochondrial+electron+transport+chain+in+cell+proliferation+is+to+enable+aspartate+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An essential role of the mitochondrial electron transport chain in cell proliferation is to enable aspartate synthesis.</a> Cell. 162 (3), 540-551 (2015).</li>
<li>Beigneux, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-citrate+lyase+deficiency+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">ATP-citrate lyase deficiency in the mouse.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (10), 9557-9564 (2004).</li>
<li>Gameiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+HIF-mediated+reductive+carboxylation+is+regulated+by+citrate+levels+and+sensitizes+VHL-deficient+cells+to+glutamine+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo HIF-mediated reductive carboxylation is regulated by citrate levels and sensitizes VHL-deficient cells to glutamine deprivation.</a> Cell Metabolism. 17 (3), 372-385 (2013).</li>
<li>Fendt, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+glutamine+metabolism+is+a+function+of+the+alpha-ketoglutarate+to+citrate+ratio+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Reductive glutamine metabolism is a function of the alpha-ketoglutarate to citrate ratio in cells.</a> Nature Communications. 4, 2236(2013).</li>
<li>Lee, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+studies+of+isolated+mitochondria+from+normal+and+diseased+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Biochemical studies of isolated mitochondria from normal and diseased tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1271 (1), 21-28 (1995).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Como pesquisas emergentes demonstram que as mitocôndrias de mamíferos podem funcionar sem consumir oxigênio molecular, é de extrema importância que os pesquisadores empreguem ensaios ortogonais, além das medições de OCR, para quantificar com precisão a função mitocondrial. Aqui, compilamos uma série de ensaios que podem ser usados para avaliar diretamente as atividades do complexo I, complexo II, complexo V e DHODH medindo o balanço NAD+/NADH mitocondrial, a utilização de aceptores de elétrons terminais adaptativos, a produção de ATP, biossíntese de pirimidina de novo e ROS derivadas de mitocôndrias. Notavelmente, esses ensaios medem mais diretamente a função mitocondrial do que as medidas de OCR. Além disso, esses ensaios fornecem aos pesquisadores maneiras tratáveis de quantificar a função mitocondrial durante a hipóxia, para a qual as medidas de OCR são em grande parte irrelevantes devido ao fumarato ser usado como o aceitador de elétrons terminal favorecido. Finalmente, os métodos baseados em proliferação descritos aqui são mais custo-efetivos do que os experimentos clássicos de respirometria, fornecendo uma maneira amplamente acessível de estudar a função mitocondrial em sistemas de mamíferos.
Existem considerações importantes ao utilizar esses ensaios para medir a função mitocondrial em células cultivadas. Em relação aos ensaios de proliferação, é importante ajustar o número de células semeadas para a taxa de duplicação de cada linhagem celular. As células devem ser semeadas com pelo menos 10% de confluência e com espaço suficiente para permitir três a quatro duplicações para que as diferenças na proliferação possam ser quantificadas. Outra consideração para cada ensaio é a concentração das pequenas moléculas usadas como controles para as atividades de cada complexo ETC. Como diferentes linhagens celulares podem apresentar diferentes sensibilidades a esses inibidores, é fundamental testar a dose dessas pequenas moléculas para identificar a concentração ideal.
Uma limitação universal dos ensaios que estudam a função mitocondrial in vitro, incluindo medidas de OCR e todos os ensaios aqui descritos, é a composição metabólica do meio de cultura. O meio de cultura celular padrão tende a enviesar os sistemas para níveis superficialmente altos de função mitocondrial. Por exemplo, níveis suprafisiológicos de glutamina aumentam sua anaplerose do ciclo do TCA25, o que alimenta a síntese mitocondrial de NADH e, consequentemente, aumenta a fosforilação oxidativa. Da mesma forma, a pressão parcial de oxigênio varia entre 3 mmHg e 100 mmHg (aproximadamente 0,1%-13%O2) em tecidos de mamíferos, mas é atmosférica (140 mmHg, aproximadamente 21%) in vitro26,27. Esse excesso de O2 maximiza a capacidade respiratória mitocondrial e a produção de superóxido28. Recentemente, esforços têm sido feitos para projetar meios de cultura mais fisiológicos29,30. Notavelmente, a cultura de células em meios semelhantes a plasma humano diminui a respiração mitocondrial em algumas linhagens de células cancerosas30, as ROS mitocondriais em células T31 e as adaptações mitocondriais à terapêutica do câncer32. Assim, é fundamental estar atento à composição dos meios de cultura que estão sendo utilizados e entender como isso pode impactar a função mitocondrial.
Outra limitação importante e universal na interpretação da função mitocondrial é o potencial para diferenças no número de mitocôndrias. É, portanto, fundamental medir o conteúdo mitocondrial através da quantificação do mtDNA33, da medida da massa mitocondrial com corantes insensíveis ao potencial de membrana34 ou do western blotting de marcadores mitocondriais. Este é um controle crítico para que uma diminuição no número de mitocôndrias não seja confundida com uma diminuição na função mitocondrial.
Há também limitações específicas e solução de problemas que se aplicam aos ensaios descritos aqui. Primeiro, dado que células diferenciadas não proliferam, os ensaios baseados em proliferação não serão úteis para avaliar a função mitocondrial neste contexto. Uma limitação fundamental do protocolo de rastreamento de 13C 4-aspartato para medir a atividade de DHODH é que a captação de aspartato nas células pode ser extremamente ineficiente35. Para superar essa limitação potencial, os pesquisadores podem superexpressar o transportador de aspartato, SLC1A3, para facilitar a captação de 13C 4-aspartato35.
Uma limitação do protocolo que utiliza o traçado 13C 5-glutamina para medir a atividade de SDH é que este ensaio requer que as células utilizem a via de carboxilação redutiva para enriquecer os isotopólogos M+3 a fim de medir a atividade reversa. Algumas linhagens celulares são incapazes de fluxo redutivo de carboxilação devido à baixa expressão de ATP citrato liase36, estabilização insuficiente de HIF37 ou uma relação α KG:citrato muito baixa38. Para superar essa limitação, pode-se utilizar o traçado 13C 4-aspartato para medir as atividades direta e reversa do SDH7. Neste ensaio, a atividade direta do SDH pode ser medida pela razão fumarato M+2:succinato M+2 e a reação reversa pelo succinato M+4:fumarato M+4. Notavelmente, este traçado contorna a maioria das enzimas na via de carboxilação redutiva.
Uma limitação do ensaio de atividade do complexo I usando redução DCPIP como leitura é que as mitocôndrias não estão estruturalmente intactas. O processo de congelamento-descongelamento das mitocôndrias para permitir sua captação de NADH para o ensaio certamente pode manchar a integridade estrutural da membrana mitocondrial39. Este ensaio deve ser realizado em paralelo com ensaios como o ensaio de proliferação do complexo I para garantir que as mudanças na atividade do complexo I observadas também sejam verdadeiras com células intactas.
Em estudos futuros, algumas dessas técnicas podem ser adaptadas para medir funções mitocondriais in vivo usando organismos modelo como camundongos e Caenorhabditis elegans. Os métodos atuais usados para medir a função mitocondrial in vivo estão centrados no OCR em nível de organismo, especificamente na taxa de troca respiratória quando se usa modelos de camundongos. Uma limitação clara deste método é que o oxigênio serve muitas funções bioquímicas e de sinalização além de seu papel como um aceptor de elétrons terminais ubíquo na ETC mitocondrial. Por exemplo, o oxigênio é "consumido" pela atividade catalítica de enzimas da família das dioxigenases. Embora essas enzimas contribuam para a taxa de consumo celular de oxigênio, elas não participam, regulam ou refletem a função mitocondrial. Experimentos clássicos de respirometria in vitro tipicamente controlam o "OCR não mitocondrial", enquanto os experimentos de razão de troca respiratória do organismo (RER) não podem controlar isso, limitando a interpretação do RER como uma métrica para a função mitocondrial in vivo. No entanto, é viável adaptar os protocolos para medir a atividade de DHODH via traçado de 4-aspartato de 13 C, atividade do complexo II via traçado de5-glutamina de 13C, atividade do complexo I em mitocôndrias purificadas detecidos e ROS mitocondrial usando compostos amigáveis ao LC-MS como MitoB para medir a função mitocondrial in vivo. Esses ensaios diretos para interrogar funções mitocondriais, em combinação com experimentos clássicos de respirometria, fornecem aos pesquisadores uma avaliação mais abrangente e precisa da função mitocondrial em células e tecidos de mamíferos.

A função mitocondrial é uma métrica crítica da saúde celular, pois sustenta funções-chave biossintéticas, bioenergéticas e de sinalização em células de mamíferos1. A grande maioria das funções mitocondriais requer fluxo de elétrons através da cadeia de transporte de elétrons (ETC), e interrupções no fluxo de elétrons na ETC causam doença mitocondrial grave2. O ETC é composto por uma série de reações de redução e oxidação (redox) que estão embutidas na membrana mitocondrial interna, e essas reações de transferência de elétrons liberam energia livre que pode ser aproveitada para apoiar a síntese de ATP, processos fisiológicos como a termogênese, vias biossintéticas como a biossíntese de pirimidina de novo e o equilíbrio do status redox de cofatores como NADH. Os complexos I e III da ETC produzem espécies reativas de oxigênio (ROS)3,4,5, que, por sua vez, regulam vias chave de sinalização, como HIF, PI3K, NRF2, NFκB e MAPK 6. Consequentemente, métricas de fluxo de elétrons no ETC são classicamente usadas como um proxy para a função mitocondrial em células de mamíferos.
Experimentos de respirometria são frequentemente empregados para medir a função mitocondrial em células de mamíferos. Uma vez que O2 é o mais onipresente aceitador de elétrons terminais para a ETC de mamíferos, sua redução é usada como um proxy para a função mitocondrial. No entanto, evidências emergentes demonstram que mitocôndrias de mamíferos podem empregar fumarato como um aceitador de elétrons para sustentar funções mitocondriais que dependem da ETC, incluindo a biossíntese de pirimidina de novo 7, a oxidação de NADH7 e a desintoxicação do sulfeto de hidrogênio 8. Assim, em determinados contextos, especialmente em ambientes hipóxicos, as medidas da taxa de consumo de O2 (OCR) não fornecem uma indicação precisa ou precisa da função mitocondrial.
Aqui, descrevemos uma série de ensaios que podem ser empregados para medir a função mitocondrial independentemente do OCR. Nós fornecemos ensaios para medir diretamente a oxidação de NADH mediada pelo complexo I, a biossíntese de pirimidina de novo mediada por diidrororotato desidrogenase, a síntese de ATP dependente do complexo V complexo, a direcionalidade líquida do complexo succinato desidrogenase (SDH) e as ERO derivadas da mitocôndria. Estes ensaios devem ser realizados em células de mamíferos cultivadas, embora muitos possam ser adaptados para estudar as funções mitocondriais in vivo. Notavelmente, os ensaios descritos neste protocolo são medidas mais diretas das funções mitocondriais do que o OCR. Além disso, permitem medir a função mitocondrial na hipóxia, contexto em que o OCR não é uma medida indicativa. Em conjunto, esses ensaios, em combinação com experimentos clássicos de respirometria, fornecerão aos pesquisadores uma avaliação mais abrangente da função mitocondrial em células de mamíferos.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Tubo de 1,5 mL</td><td>Cell Treat</td><td>667443 Tubo</td><td></td></tr> de <tr><td>2,0 mL</td><td>Cell Treat</td><td>229446</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 poços</td><td>Cell Treat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 poços</td><td>Cell Treat</td><td>229112</td><td></td></tr><tr><td>13C4-aspartato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>604852</td><td></td></tr><tr><td>13C5-Glutamina</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>285978-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 mL</td><td>Cell Treat</td><td>667411</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 50 mL</td><td>Cell Treat</td><td>667421</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de tecidos de 150 mm</td><td>Cell Treat</td><td>229651</td><td></td></tr><tr><td>1x solução salina tamponada com fosfato</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>2,6- diclorofenolindofenol</td><td>Honeywell</td><td>33125</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37999</td><td></td></tr><tr><td>Antimicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Ascentis Express C18</td><td>Filtro superior de garrafa Sigma-Aldrich</td><td>53825-U</td><td></td></tr><tr><td>500 mL, 0.22 &micro; m, PES 9 9 mm de diâmetro da membrana</td><td>Tratamento</td><td>celular 229717</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Brequinar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0113</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lifter, Lâmina plana e estreita de extremidade dupla</td><td>Cell Treat</td><td>229305</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap -105 Cold Trap</td><td>Labconco</td><td>7385020</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor completo de protease Tablets</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>4693116001</tr><tr><td>Coulter Counter Cups</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-000-694</td><td></td></tr><tr><td>Deciliquinona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7911</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5425R</td><td>Eppendorf</td><td>2231000908</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5910 Ri</td><td>Eppendorf</td><td>5943000343</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5388</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sem glicose</td><td>Gibco</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sem glutamina</td><td>Thermo Fisher</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal inativado por calor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de amônio 35% grau HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>460801000</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila de grau HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900667</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio de grau HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico de grau HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol de grau HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>MeOH de grau HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>900688 HPLC Water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Linha Celular Osteossarcômica Humana 143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Clorídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tampão isotônico</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546719</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MitoSox Red</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Moedor de Tecidos Potter-Elvehjem, Tamanho 21</td><td>Kimble</td><td>885502-0021</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Mídia DMEM livre de piruvato</td> Espectrômetro de massa <td>Gibco</td><td>11965175</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>726030</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora ReCO2ver</td><td>Concentrador</td> de Vácuo de Bancada Refrigerado Centrivap Baker <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Labconco</td><td>7310020</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Millipore Sigma</td><td>20188</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC 5&mu; m Coluna analítica de 150 x 2,1 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.50460.0001</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC kit de proteção</td><td>Millipore Sigma</td><td>1.50438.0001</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio, Pellets</td><td>Millipore Sigma</td><td>567530-250GM</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SW, TRACEFINDER 5.1 SP3</td><td>Thermo Scientific</td><td>OPTON-31001</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hidroperóxido de terc-butila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>25-200-114</td><td></td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-S01-A-02</td><td></td></tr><tr><td>Z2 Coulter Contagem e tamanho de partículas analisador</td><td>Beckman Coulter</td><td>BZ10131270</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaios independentes de oxigênio para medir a função mitocondrial em mamíferos

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

O fluxo de elétrons na cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) suporta funções biossintéticas, bioenergéticas e de sinalização multifacetadas em células de mamíferos. Como o oxigênio (O 2) é o mais onipresente aceitador de elétrons terminais para a ETC de mamíferos, a taxa de consumo de O2 é frequentemente usada como proxy da função mitocondrial. No entanto, pesquisas emergentes demonstram que esse parâmetro nem sempre é indicativo da função mitocondrial, já que o fumarato pode ser empregado como um aceitador alternativo de elétrons para sustentar funções mitocondriais na hipóxia. Este artigo compila uma série de protocolos que permitem aos pesquisadores medir a função mitocondrial independentemente da taxa de consumo de O2. Estes ensaios são particularmente úteis quando se estuda a função mitocondrial em ambientes hipóxicos. Especificamente, descrevemos métodos para medir a produção de ATP mitocondrial, biossíntese de pirimidina de novo, oxidação de NADH pelo complexo I e produção de superóxido. Em combinação com experimentos clássicos de respirometria, esses ensaios ortogonais e econômicos fornecerão aos pesquisadores uma avaliação mais abrangente da função mitocondrial em seu sistema de interesse.

As atividades do DHODH, do complexo I e do complexo V podem ser avaliadas por meio de ensaios de proliferação. Após a privação da uridina do meio de cultura, as células tornam-se mais dependentes da via de novo para a biossíntese de pirimidina. Assim, quando as células foram desafiadas a proliferar em um meio livre de uridina, elas foram mais sensíveis à inibição da atividade do DHODH pelo brequinar do que as células cultivadas em um meio contendo uridina (Figura 6A). Da mesma forma, a privação do piruvato do meio de cultura torna as células mais dependentes da atividade do complexo I para proliferação. Assim, quando as células foram desafiadas a proliferar em meio livre de piruvato, elas foram mais sensíveis à inibição da atividade do complexo I pela rotenona do que as células cultivadas em meio contendo piruvato (Figura 6B). A atividade do complexo V pode ser avaliada desafiando as células a proliferarem em um meio contendo galactose em vez de glicose. Como a galactose produz ATP líquido zero na glicólise, as células que crescem neste combustível são mais dependentes da síntese de ATP mitocondrial via atividade do complexo V. Assim, as células que proliferavam em meio contendo galactose eram mais sensíveis à inibição do complexo V pela oligomicina do que as células que proliferavam em meio contendo glicose (Figura 6C).
A atividade do SDH pode ser medida usando o traçado de 5-glutamina 13C e monitorando sua incorporação em isotopólogos de fumarato e succinato. Em condições tratadas com veículo, o complexo SDH favoreceu a atividade anterior, e a incorporação de 13 C 4-succinato em 13 C4-fumarato foi maior do que a incorporação de 13 C 3-fumarato em 13C 3-succinato (Figura 7). Nas condições tratadas com antimicina, o complexo SDH favoreceu a atividade reversa, e a incorporação de 13 C 3-fumarato em 13 C3-succinato foi maior do que a incorporação de 13 C 4-succinato em 13C 4-fumarato (Figura 7).
A produção de superóxido dentro da mitocôndria pode ser medida usando o repórter fluorescente MitoSox, que gera 2-hidroxi-mitoetídio após a reação com superóxido. Neste estudo, as células tratadas com MitoSox na presença de peróxido de hidrogênio tertbutílico apresentaram níveis mais elevados de 2-hidroximitoetídio de forma suprimida pela adição de NAC, um antioxidante que extingue as ROS celulares (Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig01.jpg"> Figura 1: Base mecanística para o ensaio de proliferação do complexo V. Oxidação de glicose e galactose via glicólise. A glicose produz dois ATP líquidos da glicólise, enquanto a galactose produz ATP líquido zero porque a síntese de UTP é necessária para a UDP-galactose. Assim, as células cultivadas em galactose são mais dependentes da síntese de ATP mitocondrial devido à falta de ATP produzido a partir da glicólise. Abreviações: GALK = galactocinase; GALT = galactose-1-fosfato uridililtransferase; PGM1 = fosfoglucomutase 1; GPI = glicose-6-fosfato isomerase, UGP = UDP-glicose pirofosforilase; GALE = UDP-galactose-4-epimerase; NDK = nucleotídeo difosfato quinase; UMPK = uridina monofosfato quinase; HK = hexoquinase; PFK = fosfofrutoquinase; ALDO = aldolase; TPI = triosefosfato isomerase; GAPDH = gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; PGK = fosfoglicerato quinase; PGM = fosfoglucomutase; ENO = enolase; PK = piruvato quinase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig02.jpg"> Figura 2: Base mecanicista para o ensaio de proliferação complexa I. Esquema das vias metabólicas que são alteradas com a inibição da atividade do complexo I. Em meios com alto piruvato, a inibição do complexo I é contornada pela oxidação de NADH mediada por LDH. Em meios com baixo teor de piruvato, essa adaptação é menos viável, tornando as células mais dependentes da atividade do complexo I para reoxidar o NADH. Abreviações: LDH = lactato desidrogenase; Ciclo do TCA = ciclo do ácido tricarboxílico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig03.jpg"> Figura 3: Esquema da reação DHODH no traçado de 13C 4-aspartato. Brequinar inibe a oxidação diidroorotato para orotato, impedindo assim a síntese a jusante de UMP. 13ºC 4-aspartato é incorporado em 13C3-UMP via atividade DHODH. Abreviações: OMM = membrana mitocondrial externa; IMM = membrana mitocondrial interna; DHODH = diidroorotato desidrogenase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig04.jpg"> Figura 4: Medição da atividade do complexo II anterior e reverso através do traçado de 5-glutamina a 13C. Para medir a atividade direta do complexo II (esquerda), a incorporação de 13 C 5-glutamina em 13 C 4-succinato e 13C 4-fumarato é monitorada. Para medir a atividade do complexo II reverso (à direita), a incorporação de 13 C 5-glutamina em 13 C 3-succinato e 13C 3-fumarato é monitorada. Abreviações: SDH = succinato desidrogenase; CytC = citocromo C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig05.jpg"> Figura 5: Reação de MitoSox Red com superóxido. A reação de MitoSox com superóxidos mitocondriais para formar 2-OH-MitoE2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig06.jpg"> Figura 6: Ensaios baseados em proliferação para medir a função mitocondrial (A) Proliferação de células de osteossarcoma 143B tratadas com brequinar 5 uM, um inibidor de DHODH, em meio com uridina ±100 ug/mL. Os dados são médios ± MEV; N = 3 por condição. (B) Proliferação de células do osteossarcoma 143B tratadas com a rotenona 2 uM, um inibidor do complexo I, em meio com piruvato ±5 mM. Os dados são médios ± MEV; N = 3 por condição. (C) Proliferação de células de osteossarcoma 143B tratadas com oligomicina 5 uM, um inibidor do complexo V, em meio com glicose 10 mM ou galactose 10 mM como única fonte central de carbono. Os dados são médios ± MEV; N = 3 por condição. * indica p &lt; 0,05 usando um teste ANOVA unidirecional no Graphpad Prism. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig07.jpg"> Figura 7: Traçado 13C 5-glutamina para medir a atividade do complexo II. Oxidação de succinato e redução de fumarato (SDH reverso) em células Caki1 e DLD1 tratadas com DMSO e antimicina A 500 nM. Os dados representam média ± EPM; N = 3 por condição. indica p &lt; 0,05 usando um teste t não pareado no GraphPad Prism. Abreviações: SDH = oxidação do succinato; SDH reverso = redução do fumarato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig08v2.jpg"> Figura 8: Ensaio MitoSox baseado em LCMS para detectar superóxido. Cromatograma iônico extraído de 2-OH-Mito E2+ isolado de células Caki1 tratadas com MitoSox por 30 min na presença de tBuOOH ± NAC. Abreviaturas: LCMS = cromatografia líquida-espectrometria de massas; NAC = N-acetilcisteína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Composição dos reagentes, buffers e meios utilizados neste protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184_Table%201%20Reaction%20Compositions_Revision%20(2).xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Aqui, apresentamos uma compilação de ensaios para medir diretamente a função mitocondrial em células de mamíferos, independentemente de sua capacidade de consumir oxigênio molecular.

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Nossa pesquisa se concentra em como as mitocôndrias sentem e se adaptam aos estressores metabólicos. Um dos principais estressores metabólicos é a hipóxia, que ocorre quando as células estão carentes de oxigênio. Estamos desenvolvendo melhores ensaios para estudar a função mitocondrial em ambientes com baixo teor de oxigênio.Espectrometria de massa de maior resolução foi empregada para estudar os níveis de metabólitos celulares e teciduais. Usamos estudos de rastreamento de isótopos estáveis para rastrear o destino de metabólitos específicos e descobrir novas vias metabólicas relevantes para a fisiologia de mamíferos saudáveis e doentes. Grupo descobriu que mitocôndrias de mamíferos podem sustentar funções críticas em ambientes com baixo teor de oxigênio.Mecanisticamente, eles empregam fumarato como um cetro eletrônico alternativo para a cadeia de transporte de elétrons. Este protocolo compila vários ensaios que os pesquisadores podem usar para avaliar melhor a função mitocondrial em células de mamíferos. É importante ressaltar que esses protocolos podem ser usados para estudar a função mitocondrial na hipóxia, já que os experimentos clássicos de respirometria não serão suficientes.

oxygen-independent-assays-to-measure-mitochondrial-function-in-mammals

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um protocolo espectrofluorométrico para a medição da abertura do poro de permeabilidade mitocondrial transição de coração de rato isolado mitocôndrias é aqui apresentada. O teste envolve a medição simultânea de Ca...

Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

A comparação do potencial da membrana mitocondrial entre as amostras produz informações valiosas sobre o status celular. São descritas etapas detalhadas para isolar mitocôndrias e avaliar a resposta a inibidores e desacopladores usando fluorescência. O método e a utilidade deste protocolo são ilustrados pelo uso de uma cultura de células e modelo animal de estresse celular.

Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Os métodos apresentados fornecem instruções passo a passo para a realização de uma coleção de ensaios respirométricos baseados em microplacas usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de músculo esquelético de camundongo. Esses ensaios são capazes de medir mudanças/adaptações mecanicistas no consumo de oxigênio mitocondrial em um modelo animal comumente usado.

Usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para alta taxa de transferência de microplacas respiratórias Medições

Aqui, apresentamos uma modificação de um método relatado anteriormente que permite o isolamento de mitocôndrias purificadas e de alta qualidade de quantidades menores de músculo esquelético de camundongo. Este procedimento resulta em mitocôndrias altamente acopladas que respiram com alta função durante ensaios respiratórios baseados em microplacas.

Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias

Neste trabalho, é descrito um método para medir o consumo de oxigênio usando respirometria de alta resolução em permeabilized avermelhado da drosófila. Esta técnica requer uma quantidade mínima de tecido, em comparação com a técnica de isolamento mitocondrial clássico e os resultados obtidos são fisiologicamente mais relevantes.

Medição do consumo de oxigênio mitocondrial nas fibras Permeabilized da drosófila usando quantidades mínimas de tecido

Respiração mitocondrial é fundamental para a sobrevivência; Portanto, a taxa de consumo de oxigênio é um excelente indicador de saúde mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos a utilização de um respirometer comercialmente disponível para medir basal e taxas de consumo máximo de oxigênio em viver, intacto e livremente motile Caenorhabditis elegans.

Medição das taxas de consumo de oxigênio em intacta Caenorhabditis elegans

Desenvolvemos um protocolo prático e abordagem analítica para avaliar a fosforilação oxidativa mitocondrial e a capacidade de transferência de elétrons em homogeneizadores de tumores frescos. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para levantamento de várias funções mitocondriais que contribuem para a iniciação do câncer, progressão e resposta ao tratamento.

Determinação Analítica da Função Mitocondrial de Homogeneiza tumor sólido excisado

Aqui, descrevemos um método detalhado para o isolamento das mitocôndrias do músculo esquelético do camundongo e a análise subsequente da respiração pela Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR) usando assins respirométricos à base de microplacas. Este gasoduto pode ser aplicado para estudar os efeitos de múltiplas intervenções ambientais ou genéticas no metabolismo mitocondrial.

Isolamento das Mitocôndrias do Músculo Esquelético do Rato para Ensaios Respirométricos

Este artigo descreve um método para avaliar as interações e montagens de proteínas integrais de membrana in vitro com vários fatores parceiros em um ambiente lipídico-proximal.

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal In Vitro

Um protocolo é apresentado para a produção de tRNA (UUU) e a análise de tRNA (UUU) em complexo com a enzima TcdA por ensaios de retardamento de gel de agarose.

Ensaios de Retardamento de Gel de Agarose Protein-tRNA para Análise do<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -Treonilcarbamoyladenosina TcdA Function

Aprenda ensaios independentes de oxigênio para medir a função mitocondrial em células de mamíferos sob hipóxia. Este método utiliza espectrometria de massas e traçadores isotópicos estáveis para avaliar vias metabólicas alternativas.

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

Explorar mais vídeos