Name: Obtendo um A com os 3Cs: Captura de Conformação Cromossômica para Graduandos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprenda a técnica de captura de conformação cromossômica (3C) para estudar a organização da cromatina e regulação da expressão gênica usando C. elegans. Este protocolo adaptado envolve estudantes de graduação em pesquisa molecular prática.

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Este trabalho foi apoiado em parte pela Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence do National Institute of General Medical Sciences dos National Institutes of Health sob o número de concessão P20GM103430 e pelo Bryant Center of Health and Behavioral Sciences.

Captura de Conformação Cromossômica (3C) para Pesquisa e Ensino de Graduação

<ol><li>McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+architectural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin architectural proteins.</a> Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).</li>
<li>Nalabothula, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+architectural+proteins+HMGD1+and+H1+bind+reciprocally+and+have+opposite+effects+on+chromatin+structure+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation.</a> BMC Genomics. 15, 92(2014).</li>
<li>John, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+pre-determines+glucocorticoid+receptor+binding+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns.</a> Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).</li>
<li>Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+occurrence+of+a+fibrous+lamina+on+the+inner+aspect+of+the+nuclear+envelope+in+certain+cells+of+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates.</a> The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).</li>
<li>Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+mediated+by+repositioning+of+genes+to+the+nuclear+lamina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina.</a> Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).</li>
<li>Finlan, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+to+the+nuclear+periphery+can+alter+expression+of+genes+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells.</a> PLoS Genetics. 4 (3), e1000039(2008).</li>
<li>Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+re-organisation+of+the+Hoxb+complex+during+mouse+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development.</a> Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).</li>
<li>Chambeyron, S., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+decondensation+and+nuclear+reorganization+of+the+HoxB+locus+upon+induction+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription.</a> Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).</li>
<li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+active+and+inactive+genes+and+noncoding+DNA+within+chromosome+territories%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).</li>
<li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+density+and+transcription+influence+the+localization+of+chromatin+outside+of+chromosome+territories+detectable+by+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH.</a> The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).</li>
<li>Li, B., Carey, M., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+chromatin+during+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of chromatin during transcription.</a> Cell. 128 (4), 707-719 (2007).</li>
<li>Chen, A., Chen, D., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+of+DNase-seq+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Advances of DNase-seq for mapping active gene regulatory elements across the genome in animals.</a> Gene. 667, 83-94 (2018).</li>
<li>Hughes, A. L., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+nucleosome+positioning+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo.</a> Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).</li>
<li>Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+nucleosome+mapping+reveals+transcription-dependent+promoter+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging.</a> Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).</li>
<li>Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+evolutionary+approach+to+identify+determinants+of+nucleosome+positioning%3A+A+unifying+model+for+establishing+the+genome-wide+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern.</a> Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).</li>
<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li>
<li>van Berkum, N. L., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+spatial+chromatin+organization+of+large+genomic+regions+using+5C+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology.</a> Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).</li>
<li>Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+TAD+boundaries+constrain+cell-type-specific+looping+interactions+between+promoters+and+distal+elements+around+the+CFTR+locus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus.</a> American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).</li>
<li>Crane, E. E. Two inputs into C. elegans dosage compensation: Chromosome conformation and the miRNA-specific argonaute ALG-2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+California%2C+Berkeley%22">University of California, Berkeley</a>. , PhD thesis (2012).</li>
<li>Bell, A. C., West, A. G., Felsenfeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+CTCF+is+required+for+the+enhancer+blocking+activity+of+vertebrate+insulators%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators.</a> Cell. 98 (3), 387-396 (1999).</li>
<li>Cuadrado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+contributions+of+cohesin-SA1+and+cohesin-SA2+to+TADs+and+polycomb+domains+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells.</a> Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).</li>
<li>Sarro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+the+three-dimensional+regulatory+topology+of+the+Pitx1+locus+results+in+overtly+normal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development.</a> Development. 145 (7), (2018).</li>
<li>Tolhuis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+among+polycomb+domains+are+guided+by+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture.</a> PLoS Genetics. 7 (3), e1001343(2011).</li>
<li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology%3A+From+fixation+to+computation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li>
<li>Fernández-Miñán, A., Bessa, J., Tena, J. J., Gómez-Skarmeta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+21+-+Assay+for+transposase-accessible+chromatin+and+circularized+chromosome+conformation+capture%2C+two+methods+to+explore+the+regulatory+landscapes+of+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish.</a> Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+%26%2334%3BC%26%2334%3B+s+of+chromosome+conformation+capture%3A+controls%2C+controls%2C+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The three &#34;C&#34; s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).</li>
<li>Hagège, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+%283C-qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li>
<li>Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((My5C%3A+Webtools+for+chromosome+conformation+capture+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies.</a> Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).</li>
<li>Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+C.+elegans+germ+nuclei+exhibit+distinct+genomic+profiles+of+histone+modification+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression.</a> BMC Genomics. 20 (1), 500(2019).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

O 3C é uma técnica poderosa que está enraizada em técnicas moleculares básicas. É essa base de ferramentas fundamentais que torna o 3C uma técnica tão intrigante para usar com alunos de graduação. Com tantos estudos recentes observando a dinâmica da cromatina em uma escala tão ampla, usar esses resultados para elaborar um experimento com foco restrito em um único gene ou região genômica tem o potencial de criar um experimento único e impactante na iniciação científica. Muitas vezes, experimentos como esses são considerados muito avançados para os graduandos, mas com um planejamento cuidadoso, eles são facilmente alcançáveis. É importante notar que os ensaios projetados para sondar as conexões de cromatina capturadas pela biblioteca 3C podem variar de PCR semiquantitativo final a sequenciamento do genoma inteiro. Na verdade, os dados do primeiro papel 3C16 foram gerados a partir de qPCR. Essa ampla gama de ensaios pode ser usada porque todas as tecnologias 3C produzem o mesmo produto - uma biblioteca de fragmentos de DNA representando conexões 3D no núcleo.
Apresenta-se aqui uma adaptação de um protocolo mais flexível e acomodado que melhor se adapta aos pesquisadores de graduação. Os períodos de pausa listados acima implicam atrasos durante a noite; No entanto, essas pausas podem se estender por finais de semana e, no caso das células e núcleos, por semanas. A consideração mais crucial é quando o trabalho será feito. Muitas vezes, em protocolos, há etapas sensíveis ao tempo quando a pausa não é uma opção. Fora alguns pontos (dia 1 e dia 2), há muitos lugares para parar e congelar a amostra. Estes são críticos quando se trabalha com estudantes de graduação, onde os horários e horários do trabalho de laboratório precisam ser flexíveis. Além de engendrar essas paradas no protocolo, os graduandos são incentivados a trabalhar em duplas ou mesmo pequenos grupos de três ou quatro. Os grupos funcionam bem para esse protocolo, pois os alunos podem apoiar uns aos outros e criar um sistema de amigos para que todos estejam trabalhando com segurança. O trabalho de laboratório também é mais divertido com os outros envolvidos. Com os grupos, os alunos também podem trabalhar uma variedade de questões focadas na organização da cromatina enquanto ainda realizam o mesmo protocolo. Assim, mesmo enquanto os alunos estão trabalhando em projetos separados, o protocolo vincula seus esforços e, por isso, eles podem apoiar uns aos outros.
Outras adaptações visam contornar o fato de que certas ferramentas e equipamentos especializados não são necessariamente encontrados em todas as instituições de graduação. Esses equipamentos incluem, mas não estão limitados a termocicladores qPCR, sistemas de documentação de gel e espectrômetros de nanovolume. Na verdade, esses equipamentos são convenientes, mas não são uma exigência. Aqui, o método clássico do 3C também é descrito na parte de design do primer; Isso envolve a identificação de um locus genômico de interesse e, a partir disso, a avaliação de outros loci genômicos para pontos de contato com a cromatina mais distantes. Essa técnica também funciona bem se um conjunto de dados publicado for usado, como um conjunto de dados usando Hi-C, onde loci positivos (conectando) e negativos (não conectando) conhecidos são identificados. Projetar experimentos usando esses conjuntos de dados publicados é outra ótima adaptação para laboratórios de ensino, pois a chance de sucesso na identificação de conexões de cromatina é geralmente maior. Além disso, o artigo de pesquisa pode ser discutido em sala de aula e ser utilizado como referência.
Este protocolo usa uma abordagem de qPCR modificada para visualizar a formação do produto 3C. Os controles são essenciais para o sucesso da técnica 3C. Cada experimento usa controles de amostra e controles de primer para determinar a conclusão do procedimento 3C. Os controles da amostra incluem um controle não digerido (DNA genômico) e um controle digerido. O controle não digerido determina o sinal basal para os conjuntos de primers e é usado com o controle de digestão reticulado para determinar a eficiência da digestão Espera-se que haja uma queda no produto para quaisquer primers direcionados através de um local de restrição. A comparação desse valor com o controle não digerido fornece uma indicação de quão bem a amostra foi digerida.
Os primers para a PCR incluem um primer de controle e primers de teste. O primer controle é um conjunto de primers que está próximo à região genômica que está sendo ensaiada e não contém um local de restrição. Isso fornece a linha de base para determinar a abundância dos produtos de PCR do primer de teste. Os primers de teste são primers para frente e para trás que ladeiam um local de restrição para um determinado locus genômico de interesse (Figura 3). As reações usando esses conjuntos de primers são comparadas para determinar a eficiência da digestão, pois a abundância do produto deve cair se o local de restrição tiver sido cortado. Na determinação da organização da cromatina, um primer de teste de um locus é emparelhado com outro primer de teste de um locus genômico diferente para determinar se esses dois loci estão próximos no espaço 3D. Nesse caso, a expectativa é que um produto de PCR só seja encontrado usando a amostra 3C como modelo.
É importante notar que mesmo os primers validados têm a tendência de falhar (Figura 4: conjunto de primers r14). Além disso, os produtos de PCR são frequentemente identificados em reações de controle e em reações nas quais uma conexão de cromatina não é prevista (como o controle digerido, uma vez que não é ligado). Essas instâncias são sequenciadas e falham no QC do Sanger ou retornam sem uma sequência definida (Figura 5). Além disso, os experimentos tradicionais em 3C geram um "modelo de controle", uma amostra de DNA não cruzada, digerida e ligada, que representa todos os possíveis fragmentos ligados que podem ser produzidos com uma determinada quantidade de DNA. O "modelo de controle" desempenha um papel importante na comparação das intensidades dos sinais de qPCR entre dois loci genômicos para determinar se o sinal representa uma interação verdadeira ou apenas uma associação aleatória. Criar um "modelo de controle" pode ser problemático, pois uma grande parte da cromatina que está sendo ensaiada deve ser capturada na forma de um cromossomo artificial e processada junto com as amostras 3C. Garantir tal construção pode não ser viável, e criar uma pode estar fora do escopo de um projeto semestral. Devido a essas dificuldades, sugere-se o uso de um primer controle. O primer de controle não substitui toda a funcionalidade do "modelo de controle", mas ainda fornece a oportunidade de analisar os dados para fazer determinações de "presença" ou "ausência".
Ao realizar qPCR, o uso de quantidades iguais da amostra é importante. Isso deve ser determinado, mesmo usando um nanoespectrofotômetro como uma nanogota, gerando uma curva padrão a partir do DNA genômico de uma concentração conhecida e ajustando as amostras de 3C a essa linha. Essas quantidades devem ser registradas e usadas em PCRs subsequentes. A qualidade da reação de PCR também é importante. Como a PCR é executada em qPCR, a abundância do produto é medida usando fluorescência e registrada. Esta gravação é acessível no gráfico de amplificação. Uma vez terminado o programa, é importante verificar o gráfico de amplificação e garantir que as reações (exceto os controles sem modelo) tenham três fases: uma linha de base, uma exponencial e uma fase de platô/saturação. É importante verificar se as reações têm uma fase exponencial, em particular para a definição do limiar (ver abaixo). Além disso, para amostras diluídas em série, deve haver uma mudança nos valores de Ct consistente com a diluição da amostra (a concentração mais alta terá os menores valores de Ct, enquanto a menor concentração terá os maiores valores de Ct). Amostras que não refletem essa mudança no gráfico de amplificação requerem uma nova diluição ou indicam um problema maior com a formação da amostra 3C. Finalmente, ao gerar a curva padrão, o software PCR calculará a eficiência da PCR e o valor de R2 . A eficiência da PCR deve ser maior que 90%, e o valor de R2 deve ser maior que 0,99. Se qualquer uma dessas condições não for atendida, é provável que algo esteja errado com a amostra ou os primers do PCR.
Após a qPCR, a porcentagem de digestão e a presença de interações 3C podem ser calculadas usando o qPCR Ct para cada reação. Para determiná-los, primeiro, o limiar para a reação de PCR deve ser definido. Isso normalmente é feito usando o software que vem com a máquina qPCR. A definição do limiar definirá a concentração do produto de PCR que será usado para comparar os valores de Ct da amostra. O limiar deve bissetriz as curvas de amplificação das reações de PCR na fase exponencial de amplificação. Somente as reações de PCR com amplificação exponencial podem ser comparadas (neste caso, os primers de controle e as reações de primer teste), pois esta é a única maneira de garantir que as reações estejam amplificando o DNA na mesma taxa e possam ser comparadas fielmente. Ao analisar os gráficos 3C, as reações condicionalmente positivas são identificadas como aquelas com mais produto do que as amostras controle, o controle genômico e o controle da digestão (Figura 4B). No entanto, essas amostras devem ser validadas usando o sequenciamento de Sanger após a purificação em gel do produto de PCR.
Após o sequenciamento de Sanger, as amostras que passam pelo CQ podem ser analisadas usando Blat. O objetivo desta análise é determinar se a amostra possui a sequência de ambos os loci genômicos alvo flanqueando o sítio de restrição (DpnII no caso deste protocolo). Se ambas as sequências forem identificadas, o fragmento 3C pode ser considerado validado. Se os resultados do Blat não retornarem a sequência esperada, isso pode indicar que um ou ambos os primers não são ideais, resultando em um resultado falso positivo de qPCR. Os arquivos de rastreamento para as amostras falso-positivas terão picos de base indefinidos, e os relatórios Seq conterão principalmente "n" chamadas de base.
A validação de Sanger é essencial, pois falsos positivos da formação de produtos de PCR artefactuais são possíveis. Esses falsos positivos podem ser identificados quando os produtos de sequenciamento não têm a sequência alvo esperada ou um sítio DpnII característico de um fragmento 3C adequado (Figura 5). O sequenciamento dos fragmentos de PCR também fornece outro ponto de dados para o experimento e mostra aos alunos que a técnica 3C está identificando loci genômicos distantes que estão se juntando no espaço 3D dentro dos núcleos.
A técnica 3C fornece uma riqueza de técnicas moleculares fundamentais para estudantes de graduação em um procedimento flexível e direto. Esta técnica 3C também é um ponto de partida para as outras técnicas 3C que incorporam sequenciamento de próxima geração (NGS). Esses tipos de experimentos podem expor os graduandos a aspectos importantes da bioinformática e estão enraizados nos princípios básicos aqui descritos. A experiência e o envolvimento na graduação são fundamentais para seu sucesso e desenvolvimento como jovens cientistas. Ao oferecer essas oportunidades, os graduandos podem fortalecer sua compreensão dos princípios básicos e, ao mesmo tempo, construir sua confiança para lidar com técnicas e questões de ponta.

O genoma de um organismo não só contém todos os genes necessários para a função, mas também todas as instruções sobre como e quando usá-los. Isso faz com que regular o acesso ao genoma seja uma das funções mais importantes da célula. Existem muitos mecanismos para controlar a função gênica; no entanto, em seu nível básico, a regulação gênica se resume à capacidade dos fatores de transcrição regulatórios (trans-fatores) de se ligarem às suas sequências específicas de DNA (sequências cis-regulatórias). Esta não é uma habilidade inata; em vez disso, é governada pela organização/estrutura do genoma no núcleo, que controla a disponibilidade/exposição das sequências cis-regulatórias aos trans-fatores 1,2,3. Se os trans-fatores não podem encontrar suas sequências cis-regulatórias, então os trans-fatores não podem executar suas tarefas regulatórias. Isso tornou a compreensão de como os genomas estão organizados no núcleo uma importante fonte de investigação.
É amplamente aceito que, durante a interfase, os cromossomos eucarióticos no núcleo ocupam seu próprio domínio ancorados à lâmina nuclear e à matriz nuclear (Figura 1), tornando o cromossomo mais parecido com uma fatia de pizza do que com um macarrão em um prato de espaguete. Os cromossomos são parcialmente condensados por interações proteína-DNA (cromatina) que torcem e fazem loop de porções do cromossomo. Através de microscopia eletrônica, fluorescência tridimensional do DNA hibridização in situ (FISH) e técnicas de marcação de DNA (i.e., metilação fluorescente e artificial do DNA), domínios inativos da cromatina foram encontrados firmemente embalados ao longo da periferia nuclear 4,5,6, enquanto porções de cromatina ativa menos condensada são encontradas no interior do núcleo 7,8,9, 10º. Esses experimentos fornecem uma visão grande angular da dinâmica cromossômica, mas pouco fazem para capturar as mudanças que ocorrem localmente ao redor dos promotores gênicos observados nos estudos com DNase11,12 e nucleossomo13,14,15.
A chave para desbloquear a dinâmica da cromatina de alta resolução foi a formulação da técnica de mapeamento cromossômico 3D, 3C. A técnica 3C propriamente dita compreende quatro etapas principais: reticulação da cromatina, digestão da cromatina por enzimas de restrição, ligadura da cromatina e purificação do DNA (Figura 2). Os novos fragmentos artificiais de DNA gerados por esse processo podem então ser caracterizados para revelar a estreita associação física entre pedaços linearmente distantes de DNA16. A técnica 3C tornou-se a base para a criação de múltiplas técnicas derivadas que utilizam os passos iniciais do 3C para fazer perguntas mais amplas sobre o genoma (por exemplo, Hi-C, 4C, ChIP-C). Esta família de técnicas 3C identificou que os cromossomos são organizados em múltiplas unidades discretas denominadas domínios topologicamente associados (DATs). As DATs são codificadas no genoma e definidas por alças de cromatina flanqueadas por limites não loopados16,17,18,19. Os limites das DAT são mantidos por dois fatores evolutivamente conservados e ubíquos, incluindo o fator de ligação da TCCCT (CTCF) e a coesão, que impedem que laços dentro de DATs separadosinterajam 16,20. As alças são mediadas pela interação de transfatores com suas sequências regulatórias, assim como a TCCF e a coesão21.
Embora muitos estudos usando tecnologias 3C façam perguntas amplas sobre o genoma e empreguem técnicas complicadas de coleta de amostras, a formulação da técnica 3C é baseada em técnicas básicas de biologia molecular. Isso torna o 3C intrigante para implantação em laboratórios de iniciação científica e ensino. A técnica 3C pode ser empregada para questões focadas menores e é inerentemente flexível para escalar para cima ou para baixo (genes únicos22, cromossomos16 e/ou genomas18), dependendo do foco e direção das perguntas feitas. Essa técnica também tem sido aplicada a uma ampla gama de sistemas modelo7,16,19,23 e tem se mostrado versátil em seu uso. Isso torna o 3C uma excelente técnica para graduandos, na medida em que os alunos podem ganhar experiência em técnicas comuns de biologia molecular, ao mesmo tempo em que ganham experiência valiosa em responder a perguntas direcionadas.
Apresenta-se um protocolo adaptado para preparação de biblioteca 3C baseado em protocolos previamente publicados24,25,26,27. Este protocolo foi otimizado para aproximadamente 1 × 107 células, embora tenha gerado bibliotecas 3C com apenas 1 × 105 células. Este protocolo provou ser versátil e tem sido usado para gerar bibliotecas 3C a partir de embriões de peixe-zebra, linhagens celulares de peixe-zebra e filho-adulto (YA) Caenorhabditis elegans (lombriga). O protocolo também deve ser apropriado para linhagens celulares de mamíferos e, com maior adaptação, leveduras.
O objetivo dessas adaptações é tornar o 3C mais acessível para os graduandos. Tem-se tido o cuidado de utilizar técnicas semelhantes àquelas que podem ser realizadas em um laboratório de ensino de graduação. A técnica 3C oferece muitas oportunidades de aprendizado para os alunos de graduação aprenderem técnicas básicas de biologia molecular que beneficiarão seu desenvolvimento na bancada, na sala de aula e em seus esforços após a graduação.

<table><tbody><tr><td>37% Formaldeído&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td>Millapore-Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>MP Biomédico</td><td>215350280</td><td></td></tr><tr><td>clorofórmio</td><td>Millapore-Sigma</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Millapore-Sigma</td><td>COEDTAF-RO</td><td>misturado a 50x em água. Diluído para 1x em tampão sacarose e tampão GB fresco</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td> <td>Millapore-Sigma</td><td>D0632</td><td>1 M estoque diluído para 500 &micro; M em tampão de sacarose e tampão GB fresco</td></tr><tr><td>DpnII</td><td>NEB</td><td>R0543M</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Millapore-Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>glicina</td><td>Millapore-Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>glicogênio</td><td>Millapore-Sigma</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millapore-Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>pironina verde de metila&nbsp; &nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>HT70116</td><td></td></tr><tr><td>MgAc2</td><td>Thermoscientific</td><td>1222530</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>fenol-clorofórmio&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Millapore-Sigma</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>IBI Scientific</td><td>IB05406</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Ready mix (Phire Taq etc)</td> <td>Millapore-Sigma</td><td>KCQS07</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>R6148</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Sódio</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>Millapore-Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Promega</td><td>M1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>108319</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millapore-Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

obtendo um a com os 3cs: captura de conformação cromossômica para graduandos

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

A captura de conformação cromossômica (3C) é uma ferramenta poderosa que gerou uma família de técnicas semelhantes (por exemplo, Hi-C, 4C e 5C, referidas aqui como técnicas 3C) que fornecem informações detalhadas da organização tridimensional da cromatina. As técnicas 3C têm sido utilizadas em uma ampla gama de estudos, desde o monitoramento das mudanças na organização da cromatina em células cancerosas até a identificação de contatos intensificadores feitos com promotores gênicos. Embora muitos dos estudos usando essas técnicas estejam fazendo grandes perguntas sobre o genoma com tipos de amostra intrincados (ou seja, análise de célula única), o que muitas vezes se perde é que as técnicas 3C são fundamentadas em métodos básicos de biologia molecular que são aplicáveis a uma ampla gama de estudos. Ao abordar questões fortemente focadas na organização da cromatina, esta técnica de ponta pode ser usada para melhorar a experiência de laboratório de pesquisa e ensino de graduação. Este artigo apresenta um protocolo 3C e fornece adaptações e pontos de ênfase para implementação em instituições de ensino e pesquisa de graduação.

Este procedimento produzirá uma amostra experimental de 3C e duas amostras controle (não digeridas e digeridas). Utilizando essas três amostras, foi realizada qPCR. A partir desses resultados, a eficiência da digestão foi calculada (equação 1) e registrada (Tabela 1). A partir desses cálculos, determinou-se que a amostra 3C apresentou aproximadamente 88% de eficiência de digestão (média da Tabela 1) nos sete loci genômicos testados.
Em seguida, as amostras foram testadas para a presença de contatos de cromatina de longo alcance entre os diferentes loci genômicos usando combinações de primers loci específicos (Tabela 2) e qPCR. Com esses resultados, as abundâncias de produtos relativas a um conjunto de primers controle foram calculadas (equação 2) e grafadas para comparação (Figura 4). Esses dados indicaram que 8 das 10 reações foram condicionais positivas para interações de longo alcance.
As reações de PCR foram então executadas em gel de agarose. O produto de PCR esperado para os oito positivos condicionais e uma reação negativa foram purificados em gel e enviados para sequenciamento de Sanger. Os resultados para as reações representativas positivas (seta azul, caixa azul) e negativas (seta vermelha, caixa vermelha) são mostrados (Figura 5).
<img alt="Diagrama de dobramento de proteínas; ilustra as alterações de estrutura dos estados desdobrado para dobrado com anotações." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Estrutura cromossômica no núcleo. Organização cromossômica hipotética dentro do núcleo. (A) Envelope nuclear, linhas pretas; (B) lâmina nuclear, laranja; (C) heterocromatina, linhas compactadas; (D) eucromatina, laços soltos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama de cruzamento cromossômico; ilustra a recombinação genética, o processo de troca de cromátides." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Esquema do protocolo 3C. Porções distantes de cromossomos lineares (azul, amarelo e rosa) são aproximadas dentro do núcleo através de laços regulatórios. (A) As estruturas das alças são mediadas por fatores de transcrição (círculo cinza e estrela preta); Essas interações são preservadas através de reticulação química. (B) As alças são quebradas através da digestão enzimática (linhas pretas). (C) Pedaços distantes de cromatina são ligados entre si através das extremidades de aderência criadas pela digestão. (D) O DNA é purificado a partir de proteínas. (E) A sequência dentro dos fragmentos é identificada e mapeada de volta ao genoma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama cromossômico, sítios DpnII, dados RepeatMasker, mapeamento genético, análise de sequência genômica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: O esquema de primers 3C. Os primers 3C são projetados em torno de locais de restrição a distâncias variáveis do local genômico de interesse. As setas rosas representam os conjuntos de primers experimentais que circundam um sítio DpnII. Os primers experimentais podem ser misturados e combinados para avaliar o looping da cromatina na região. Os primers laranja representam um controle negativo sem um sítio DpnII. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Gráficos de barras comparando os níveis de primer de teste em amostras de gDNA não digeridas e digeridas, resultados 3C." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Dados representativos de qPCR para um experimento 3C. Abundância relativa dos conjuntos de primers teste 3C. (A) Gráfico de controle mostrando a abundância relativa do produto na amostra controle não digerida (azul), controle digerido (cinza) e 3C (laranja). (B) O experimento 3C; a abundância relativa do produto a partir de combinações de primers de teste na amostra controle não digerido (azul), controle digerido (cinza) e 3C (laranja). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Resultado da eletroforese e sequenciamento; análise de fragmentos de DNA; digestão enzimática; estudo genético." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: Visualização dos produtos 3C qPCR. Superior, gel com os produtos de endpoint qPCR com as amostras indicadas. Abaixo, arquivos de rastreamento de sequência de Sanger representativos para as reações indicadas. A amostra laranja é um exemplo de falso positivo (ver Figura 4, r38/34), e a amostra azul é um exemplo de um verdadeiro positivo com o sítio DpnII indicado acima do traço. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Local</td>
			<td>% digestão</td>
		</tr><tr><td>R8</td>
			<td>86.98</td>
		</tr><tr><td>R3</td>
			<td>88.44</td>
		</tr><tr><td>r38</td>
			<td>89.64</td>
		</tr><tr><td>r34</td>
			<td>87.55</td>
		</tr><tr><td>r33</td>
			<td>87.85</td>
		</tr><tr><td>r14</td>
			<td>86.97</td>
		</tr><tr><td>r47</td>
			<td>89.45</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Eficiência de digestão calculada.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nome</td>
			<td colspan="3">Seqüenciar</td>
			<td>Loci genômicos</td>
		</tr><tr><td>r3 FWD</td>
			<td colspan="3">ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC</td>
			<td>chrX:11361475</td>
		</tr><tr><td>RVS r3</td>
			<td colspan="3">TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC</td>
			<td>chrX:11361561</td>
		</tr><tr><td>r38 FWD</td>
			<td colspan="3">TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC</td>
			<td>chrX:5859700</td>
		</tr><tr><td>RVS r38</td>
			<td colspan="3">AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG</td>
			<td>chrX:5859775</td>
		</tr><tr><td>r34 FWD</td>
			<td colspan="3">ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG</td>
			<td>chrX:5429702</td>
		</tr><tr><td>RVS r34</td>
			<td colspan="3">AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC</td>
			<td>chrX:5429777</td>
		</tr><tr><td>r33 FWD</td>
			<td colspan="3">AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC</td>
			<td>chrX:6296704</td>
		</tr><tr><td>RVS r33</td>
			<td colspan="3">TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG</td>
			<td>chrX:6296807</td>
		</tr><tr><td>r14 FWD</td>
			<td colspan="3">AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG</td>
			<td>chrX:8036367</td>
		</tr><tr><td>RVS r14</td>
			<td colspan="3">ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTC</td>
			<td>chrX:8036427</td>
		</tr><tr><td>r47 FWD</td>
			<td colspan="3">ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC</td>
			<td>chrX:9464939</td>
		</tr><tr><td>RVS r47</td>
			<td colspan="3">AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC</td>
			<td>chrX:9465064</td>
		</tr><tr><td>r8 FWD</td>
			<td colspan="3">GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG</td>
			<td>chrX:11094257</td>
		</tr><tr><td>RVS r8</td>
			<td colspan="3">TTACGAAATTTGGTAGTTTTGGACC</td>
			<td>chrX:11094362</td>
		</tr><tr><td>Primer de controle FWD</td>
			<td colspan="3">CAATCGTCTCGCTCACTTGTC</td>
			<td>chrX:7608049</td>
		</tr><tr><td>Primer de controle RVS</td>
			<td colspan="3">GATGTGAGCAACAAGGCACC</td>
			<td>chrX:7608166</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Primers para o experimento representativo 3C.

Aqui, apresentamos uma adaptação da técnica de captura da conformação cromossômica (3C) em detalhes com ênfase no envolvimento e aprendizagem da graduação.

Obtendo um A com os 3Cs: Captura de Conformação Cromossômica para Graduandos

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Nossa pesquisa visa descobrir como a organização da cromatina controla a expressão gênica. O foco é determinar quais fatores regulam a cromatina no nível do gene para controlar a atividade gênica. Atualmente, tecnologias semelhantes à captura de confirmação cromossômica, ou 3C, são usadas para avançar nesse campo.Os investimentos em tecnologias de coleta e sequenciamento de amostras nos impulsionaram o que as técnicas 3C podem nos mostrar. O maior desafio experimental atualmente é a coleta de amostras com arquitetura uniforme de cromatina. A heterogeneidade nas amostras leva a resultados confusos.No futuro, vamos nos concentrar em como as mudanças na organização da cromatina desempenham um papel no câncer.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

O método de Hi-C permite a identificação imparciais, de todo o genoma de interações cromatina (1). Oi-C casais ligadura proximidade e seqüenciamento massivamente paralelo. Os dados resultantes podem ser usados ​​para estudar a arquitetura genômica em múltiplas escalas: resultados iniciais identificadas características como territórios cromossomo, a segregação da cromatina abertas e fechadas, e estrutura da cromatina na escala megabase.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

Chromosomics: Detecção de alterações numéricas e estruturais em todos os 24 cromossomos humanos ao mesmo tempo usando um ensaio de FISH Novel OctoChrome

Este trabalho descreve um protocolo para a geração de alta resolução em situ Hi-C bibliotecas de encenado firmemente pre-gastrulação Drosophila melanogaster embriões.

Geração de todo o genoma da cromatina conformação captura bibliotecas de firmemente encenado embriões adiantados da drosófila

Loop de cromatina desempenha um papel significativo na regulação gênica; no entanto, tem havido sem avanços tecnológicos que permitem a modificação seletiva e reversível de loops de cromatina. Aqui descrevemos um sistema poderoso para reorganização do laço da cromatina usar CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrado para seletivamente e reversivelmente modular a expressão gênica no alvo loci.

Mediada por CRISPR reorganização da estrutura de Loop de cromatina

A identificação das interações físicas entre genes e dos elementos reguladores é um desafio, mas tem sido facilitada pelos métodos de captura de conformação de cromossomo. Esta modificação no protocolo de 4C-seq atenua o viés PCR, minimizando a amplificação excessiva de modelos PCR e maximiza o mappability de leituras, incorporando um passo de digerir adição da enzima de restrição.

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

Relatamos a aplicação da captura de conformação de cromossomos quantitativos seguida de sequenciamento de alto throughput em corpos embrionários gerados a partir de células-tronco embrionárias. Esta técnica permite identificar e quantificar os contatos entre melhoradores putativos e regiões promotoras de um determinado gene durante a diferenciação de células-tronco embrionárias.

Identificação de contatos intensificadores-promotores em corpos embrionários por captura quantitativa de conformação de cromossomo (4C)

O Hi-C 3.0 é um protocolo Hi-C aprimorado que combina reticulantes de formaldeído e glutarato de disuccinimidil com um coquetel de enzimas de restrição DpnII e DdeI para aumentar a relação sinal-ruído e a resolução da detecção da interação cromatina.

Capturando a Conformação Cromossômica Através de Escalas de Comprimento

Este protocolo descreve o método Capture Hi-C usado para caracterizar a organização 3D de regiões genômicas alvo de tamanho megabaseado em alta resolução, incluindo limites de domínios topologicamente associados (TADs) e interações de cromatina de longo alcance entre elementos regulatórios e outros elementos de sequência de DNA.

Decifrando a organização da cromatina 3D de alta resolução via captura Hi-C

Aqui apresentamos um protocolo para investigar a metilação do DNA do genoma ampla em grande escala estudos de triagem de pacientes clínicos utilizando o Metil-Binding tecnologia de sequenciamento de DNA Captura (MBDCap-seq ou MBD-seq) eo gasoduto análise bioinformática subsequentes.

Sequenciamento de captura de DNA de ligação de metilo em tecidos de pacientes

Nós descrevemos um método fácil, rápido e relativamente barato para a geração de gene-interrompeu Streptococcus mutans cepas; Esta técnica pode ser adaptada para a geração de linhagens gene-interrompido de várias espécies.

Geração de um Gene-interrompeu Streptococcus mutans estirpe sem Gene clonagem

Aprenda a técnica de captura de conformação cromossômica (3C) para estudar a organização da cromatina e regulação da expressão gênica usando C. elegans. Este protocolo adaptado envolve estudantes de graduação em pesquisa molecular prática.

Obtendo um A com os 3Cs: Captura de Conformação Cromossômica para Graduandos

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