Name: Preparação de montagem inteira à base de metanol para a investigação de células ganglionares da retina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T12:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 47 s
Description: Aprenda um método de preparação de montagem inteira à base de metanol para investigação de células ganglionares da retina. Esta técnica permite o armazenamento de longo prazo de amostras retinianas sem imunomarcação imediata, facilitando pesquisas futuras em neuropatias ópticas degenerativas.

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Este trabalho foi financiado pelo Projeto de Abertura dos Laboratórios Chave de Hubei (bolsa nº 2021KFY055), Fundação de Ciências Naturais da Província de Hubei (bolsa nº 2020CFB240) e Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (bolsa nº 2042020kf0065).

Todas as etapas são realizadas à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. Todos os camundongos C57BL/6J utilizados foram obtidos do Centro de Animais de Laboratório da Universidade de Wuhan, e todos os experimentos relacionados foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentos com Animais da Universidade de Wuhan. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos camundongos.
1. Enucleação e fixação dos olhos
<ol><li>Eutanasiar os camundongos com asfixia por dióxido de carbono e enuclear o globo ocular suavemente usando pinças desdentadas.</li>
	<li>Enxaguar o globo ocular uma vez em solução salina tamponada com fosfato (PBS).</li>
	<li>Puncionar o globo ocular com uma agulha de seringa na córnea sob um microscópio (ocular WF: 10x/22; objetiva de aumento contínuo: 0,67x-4,5x) para acelerar a fixação no globo ocular e melhorar a eficiência de fixação.</li>
	<li>Transfira para uma placa de 24 poços contendo paraformaldeído (PFA) a 4%.</li>
	<li>Fixe o globo ocular em PFA a 4% por 45 min e, em seguida, transfira-o para 1x PBS para remover o excesso de PFA (lave três vezes, 5 min/tempo) imediatamente.</li>
</ol>2. Isolamento e achatamento da retina
<ol><li>Transferir o globo ocular para uma lâmina de vidro e colocá-lo sob um microscópio dissecante (ocular WF: 10x/22; objetiva de aumento contínuo: 0,67x-4,5x).</li>
	<li>Segure a pinça em uma das mãos e use-a para prender a margem da córnea para evitar o movimento do globo ocular. Use a outra mão para segurar a tesoura dissecante e corte ao redor da córnea a aproximadamente 1 mm de profundidade através do limbo corneoescleral. Remova a lente e o corpo vítreo.</li>
	<li>Segure o disco óptico no centro e, com uma tesoura dissecante, corte a retina radialmente ao longo dos quatro quadrantes, atingindo aproximadamente 2/3 do raio da retina.</li>
	<li>Aperte uma das bordas esclerais usando pinça dentada. Com a outra mão, segure a borda da esclera com pinças não dentadas e mova-se de onde a esclera é fixada pela pinça dentada em direção à base da esclera. Descasque cuidadosamente a retina.</li>
	<li>Retire o PBS usando uma pipeta (200 μL) para lavar e molhar a retina e, em seguida, remova qualquer excesso de PBS com um pequeno pedaço de papel absorvente. Se necessário, achate suavemente a retina com uma pequena escova de cerdas.</li>
	<li>Pipetar lentamente metanol frio (pré-resfriado em um freezer de -20°C) gota a gota na superfície interna da retina (o volume de metanol não é fixo, desde que a retina possa ser completamente coberta pelo metanol). A retina fica branca e desenvolve maior tenacidade.</li>
	<li>Achate suavemente a retina e remova impurezas, como membranas pigmentares residuais e o corpo vítreo, com pequenas escovas de cerdas. Inverta a retina usando pequenas escovas de cerdas e repita o processo mencionado acima.</li>
	<li>Transfira a retina tratada com metanol para um poço de uma placa de 24 poços e mantenha-a embebida em metanol.</li>
	<li>Armazene-o a -20°C por 1-2 h para imunomarcação imediata, ou deixe a retina em metanol e armazene-o a -20°C para armazenamento a longo prazo.</li>
	<li>Retire o metanol da placa de 24 poços e lave a retina com 1x PBS.</li>
</ol>3. Coloração por imunofluorescência dos CGRs
<ol><li>Transfira cuidadosamente a retina para uma placa de hemaglutinação de 24 poços com uma pipeta plástica de Pasteur e bloqueie em 5% PBS-TX-BSA (5 g de pó de albumina de soro bovino dissolvido em 100 mL de solução de 1x PBST; o PBST é formado pela adição de 10 mL de Triton X-100 a 2.000 mL de 1 x PBS) à temperatura ambiente por 4 h ou durante a noite a 4 °C. Mantenha o gânglio para cima.</li>
	<li>Remover o PBS-TX-BSA e incubar a retina a 4 °C por 48-96 h, adicionando 100 μL do anticorpo primário selecionado (anticorpo anti-RBPMS da cobaia) usando uma diluição de 1:400.</li>
	<li>Remova o anticorpo primário e lave a retina três vezes (20 min cada) com 1x PBS, agitando à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar a retina com agitação suave durante a noite a 4 °C com 100 μL do anticorpo secundário correspondente (ver Tabela de Materiais), cianina Cy3 affiniPure burro anti-cobaia IgG (H+L), utilizando uma diluição de 1:400.</li>
	<li>Enxaguar a retina com 1x PBS três vezes (20 min cada).</li>
	<li>Coloque a retina plana na lâmina com a camada de células ganglionares voltada para cima, solte uma quantidade apropriada de agente de têmpera antifluorescência ao redor da retina com uma pipeta e cubra a lâmina com uma lamínula (cuidado para não ter bolhas). NOTA: Para determinar a quantidade apropriada de quencher antifluorescência, certifique-se de que ele cobre toda a retina. Depois disso, cubra a lâmina sem deixar a retina flutuar e se mover facilmente.</li>
	<li>Sele a corrediça toda ao redor com um agente de vedação para evitar que ela se mova. Conservar as amostras a -20°C e protegê-las da luz.</li>
	<li>Imagem da retina usando um microscópio de fluorescência/confocal.</li>
</ol>

Isolamento da retina de camundongos e tratamento com metanol para estudar células ganglionares da retina

<ol><li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+types+of+retinal+ganglion+cells%3A+Current+status+and+implications+for+neuronal+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li>
<li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).</li>
<li>Au, N. P. B., Ma, C. H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%2C+microglia+and+implications+for+retinal+ganglion+cell+survival+and+axon+regeneration+in+traumatic+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy.</a> Frontiers in Immunology. 13, 860070(2022).</li>
<li>Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cells+resistant+to+advanced+glaucoma%3A+A+postmortem+study+of+human+retinas+with+the+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).</li>
<li>Vidal-Sanz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+glaucomatous+damage%3A+anatomical+and+functional+data+from+ocular+hypertensive+rodent+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).</li>
<li>Kole, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+transcription+factor+3+%28ATF3%29+protects+retinal+ganglion+cells+and+promotes+functional+preservation+after+optic+nerve+crush%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31(2020).</li>
<li>Nadal-Nicolás, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells%3A+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).</li>
<li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+protein+with+multiple+splicing%3A+A+new+marker+for+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li>
<li>Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+strategies+for+retinal+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Fixation strategies for retinal immunohistochemistry.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).</li>
<li>Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moniliform+deformation+of+retinal+ganglion+cells+by+formaldehyde-based+fixatives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).</li>
<li>Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+methods+for+three-dimensional+reconstructions+from+confocal+images%3A+I.+Tissue+shrinking+and+axial+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).</li>
<li>Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+a+wide-ranging+panel+of+antigens+in+the+rat+retina+by+immunohistochemistry%3A+Comparison+of+Davidson%27s+solution+and+formalin+as+fixatives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).</li>
<li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology%3A+A+comparison+with+Davidson%27s+fixative+and+other+fixation+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li>
<li>Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+fixation+of+the+whole+bodies+of+fish+by+a+double-fixation+method+with+formalin+solution+and+Bouin%27s+fluid+or+Davidson%27s+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).</li>
<li>Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+commercial+and+three+home-made+fixatives+for+the+substitution+of+formalin%3A+A+formaldehyde-free+laboratory+is+possible%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible.</a> Environmental Health. 11, 59(2012).</li>
<li>Tang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+to+visualize+the+goblet+cell-associated+antigen+passages+and+identify+goblet+cells+in+the+intestine%2C+conjunctiva%2C+and+airway%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway.</a> Immunobiology. 227 (6), 152260(2022).</li>
<li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li>
<li>Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+post-fixation+on+visualising+vimentin+in+the+retina+using+immunofluorescence+method%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Morphologica%22%5BJournal%5D)">The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method.</a> Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).</li>
<li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li>
<li>Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+methanol+to+preserve+retinas+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Using methanol to preserve retinas for immunostaining.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).</li>
<li>Kalesnykas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+morphology+after+optic+nerve+crush+and+experimental+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).</li>
<li>Parrilla-Reverter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-course+of+the+retinal+nerve+fibre+layer+degeneration+after+complete+intra-orbital+optic+nerve+transection+or+crush%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study.</a> Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).</li>
</ol>

Os autores não estão cientes de quaisquer afiliações, associações, financiamentos ou participações financeiras que possam afetar a objetividade deste estudo.

A fixação é um passo essencial para preservar a retina, o que pode interferir em investigações subsequentes do CGR com base na morfologia. A fixação bem-sucedida captura rapidamente a estrutura e o estado das retinas no momento de expô-las ao meio de fixação, o que é fundamental para uma análise mais aprofundada. Embora o formaldeído tenha sido considerado um dos agentes fixadores mais comuns para fixação e preservação de tecidos e células, o formaldeído isoladamente nem sempre funciona bem como o fixador químico ideal p...

As células ganglionares da retina (CGRs) são os únicos neurônios de projeção na retina, integrando-se e transmitindo informações visuais externas ao cérebro1. Muitas doenças neurodegenerativas, como o glaucoma e a neuropatia óptica traumática, são caracterizadas por danos irreversíveis e perda deCGRs 2,3. Analisar as alterações morfológicas e quantitativas dos CGRs é um passo crucial para determinar como as doenças neurodegenerativas se desenvolvem e avançam 4,5.
O ensaio de imunofluorescência indireta é um método amplamente aceito para monitorar a distribuição de proteínas e contagem celular. Em laboratório, a imunomarcação retiniana de montagem total é comumente utilizada em estudos experimentais em CGRs para avaliar as condições fisiológicas e patológicas daretina6. Os marcadores mais comuns utilizados para quantificação de RGC em toda a retina incluem Brn3a, RNA binding protein with multiple splicing (RBPMS), e assim por diante 7,8. A caracterização da quantidade e distribuição dos RGCs requer imunomarcação retiniana de alta qualidade em toda a montagem. Geralmente, nos protocolos de imunomarcação, a retina é imersa em fixadores químicos antes de ser incubada em anticorpos. Os fixadores ideais não devem alterar a forma das células, a acessibilidade ou afinidade dos epítopos por anticorpos ou as dimensões lineares do tecido 9,10.
Devido à estrutura complexa da retina, problemas como fragilidade e dobramento da retina, bem como algumas dificuldades comuns, incluindo encolhimento celular e núcleos obscuros, são propensos a ocorrer ao fazer um adesivo de retina de montagem inteira, o que tem um impacto negativo na pesquisa experimental. Além disso, nem todas as retinas são imunomarcadas imediatamente, especialmente quando se trata de retinas de camundongos transgênicos com preços caros e de origem preciosa, exigindo a preservação das amostras extras de retina para uso posterior.
A solução fixadora apropriada pode fixar o tecido rapidamente, evitar a autólise tecidual, preservar a morfologia e a estrutura normais das células teciduais e manter a antigenicidade de proteínas e outras substâncias10. Atualmente, a fixação à base de formaldeído tem sido amplamente utilizada em vários tecidos, incluindo retinas separadas, copos hemisseccionados e globos oculares inteiros10. A retração tecidual e a alteração morfológica das células são os dois desafios críticos encontrados após a imersão em formaldeído11. Além disso, formulações de fixação modificadas estão surgindo cada vez mais para maximizar a retenção das propriedades originais da retina e das células-alvo 9,10. Diferentes tratamentos de fixação retiniana podem afetar a estrutura retiniana, a imunogenicidade de proteínas, a excitação da fluorescência e o ciclo de têmpera da atenuação de forma diferente12,13. As retinas fixadas com solução de Davidson são morfologicamente mais intactas quando comparadas àquelas fixadas com formalina, mas a solução de Davidson é menos compatível com alguns anticorpos, como a molécula adaptadora de ligação de cálcio ionizada a marcadores microgliais 112. Considerando a natureza frágil das retinas, os pesquisadores naturalmente se perguntariam se a integridade da retina, bem como as propriedades e a morfologia das células-alvo, mudarão após o armazenamento de longo prazo. No entanto, os possíveis efeitos da solução de fixação na morfologia das células retinianas e RGC após o armazenamento por vários meses foram raramente relatados. A otimização da fixação retiniana é fundamental para a avaliação e preservação dos CGRs.
Fornecemos uma descrição detalhada de um método confiável e tecnicamente simples que usamos para coloração de retina murina de montagem total. Nosso método enfatiza o preparo e armazenamento adequado de retinas para investigação de CGR, levando em consideração a necessidade de armazenamento em longo prazo do tecido retiniano, bem como aspectos específicos da formação ou degradação de fluoróforos.

<table><tbody><tr><td>Conjunto de cultura de células de 24 poços</td><td>Costar</td><td></td><td>Fixação do globo ocular</td></tr><tr><td>Placa de hemaglutinação de 24 poços</td><td>Labedit Company</td><td></td><td>Anticorpo de incubação</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio de adesão</td><td>Citotest</td><td></td><td>Ou similar</td></tr><tr><td>Montante de têmpera antifluorescente</td><td>Servicebio</td><td>G1401</td><td>Retardar a extinção de fluorescência</td></tr><tr><td>BSA (albumina de soro bovino)</td><td>Servicebio</td><td>GC305010</td><td>Microscópio</td></tr><tr><td>confocal</td> de bloqueio de reagente <td>OLYMPUS</td><td></td><td>Aplicar lente objetiva 40x</td></tr><tr><td>Tesoura curva</td><td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td><td></td><td>Ferramentas de dissecação</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>RWD Life science Co.,LTD&nbsp;</td><td>77001S</td><td>Ferramentas de dissecação</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td><td></td><td>Ferramentas de dissecação</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>20210624</td><td>GC&ge; 99,5%</td></tr><tr><td>Esmalte</td><td>SecheVite</td><td></td><td>Agente de vedação</td></tr><tr><td>Agulhas&nbsp;</td><td>Xangai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.</td><td></td><td>Acelere a fixação</td></tr> Solução <tr><td>de paraformaldeído</td><td>Servicebio</td><td>G1101</td><td>Fixação do globo ocular</td></tr><tr><td>PBS (solução salina tamponada com fosfato pH 7,4)</td><td>Servicebio</td><td>G0002</td><td>Enxágue o globo ocular</td></tr><tr><td>Anticorpo primário: proteína de ligação anti-RNA de cobaia com splicing múltiplo (RBPMS)</td><td>PhosphoSolutions</td><td>Cat. #1832-RBPMS</td><td>Para imunofluorescência. Usado a 1:400</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário: Cy3 affiniPure burro anti-cobaia IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-165-148</td><td>Para imunofluorescência. Usado em 1:400</td></tr><tr><td>tesouras retas</td><td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td><td></td><td>Ferramentas de dissecação</td></tr></tbody></table>

preparação de montagem inteira à base de metanol para a investigação de células ganglionares da retina

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

As células ganglionares da retina (RGCs), que são os neurônios de projeção da retina, propagam informações visuais externas para o cérebro. As alterações patológicas nos CGRs têm estreita relação com inúmeras doenças degenerativas da retina. A imunomarcação retiniana de montagem total é frequentemente usada em estudos experimentais em CGRs para avaliar as condições de desenvolvimento e patologias da retina. Em algumas circunstâncias, algumas amostras valiosas de retina, como as de camundongos transgênicos, podem precisar ser retidas por um longo período sem afetar a morfologia ou o número de RGCs. Para resultados experimentais confiáveis e reprodutíveis, o uso de um meio de preservação eficaz é essencial. Aqui, descrevemos o efeito do metanol como um meio fixo auxiliar para preparações retinianas de montagem completa e armazenamento a longo prazo. Em resumo, durante o processo de isolamento, o metanol frio (-20 °C) é pipetado na superfície da retina para ajudar a fixar os tecidos e facilitar sua permeabilidade, e então as retinas podem ser armazenadas em metanol frio (-20 °C) antes de serem imunomarcadas. Este protocolo descreve o fluxo de trabalho de isolamento da retina e o protocolo de armazenamento de amostras de tecido, que é útil e prático para a investigação de CGRs.

Após a dissecção, a retina deve parecer um trevo plano de quatro folhas. Neste estudo, utilizando o protocolo descrito acima, a retina ficou branca após a adição de metanol (Figura 1). Enquanto isso, a retina mudou de macia para maleável e plana. Em seguida, os CGRs foram marcados com anti-RBPMS8. Quatro campos de imagem foram obtidos na retina de montagem total (n = 3) usando um microscópio confocal (ocular: 10x; objetivo: 40x). Visões representativas dos CGRs visual...

O metanol pode ser usado como um meio fixo auxiliar para preparações retinianas de montagem completa e armazenamento a longo prazo, o que é útil para a investigação de células ganglionares da retina.

Preparação de montagem inteira à base de metanol para a investigação de células ganglionares da retina

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

A pesquisa visa fornecer um fluxo de trabalho de isolamento de retina modificado e um protocolo de armazenamento de amostras de tecido, o que é útil e prático para investigar RGCs. As retinas são frágeis e dobradas, o que limita a pesquisa experimental ao fazer um adesivo de retina de montagem inteira. Além disso, todas as retinas não requerem imunocoloração imediata.Às vezes, amostras extras de retina precisam de preservação para uso posterior. Fornecemos uma descrição detalhada de um método confiável e tecnicamente simples de coloração de retina de montagem total que enfatiza o preparo adequado e a necessidade de armazenamento de retinas a longo prazo para investigação de CGR. Continuaremos a trabalhar na pesquisa básica de neuropatias ópticas degenerativas.Além disso, o mecanismo molecular da lesão do nervo óptico e regeneração de acidentes e potenciais alvos clínicos para o diagnóstico e tratamento de doenças neurodegenerativas serão explorados.

methanol-based-whole-mount-preparation-for-investigation-retinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este artigo fornece uma descrição de como dissecar e registro da preparação isolada da retina em mouse. Em particular, descrevemos como luz para gravar as respostas de uma população fluorescente etiquetado células ganglionares e, posteriormente, identificar e analisar a sua morfologia.

Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55229/ single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells'&gt;Laboissonniere, et. al. RNA-seq de célula única de subconjuntos definidos de células ganglionares da retina. J. Vis. exp. (2017). Este vídeo demonstra uma técnica de rastreamento fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares da retina (RGC) em uma retina de camundongo transgênico. O processo envolve proteger a retina isolada em uma...

Identificação de subtipos de células ganglionares da retina de camundongos por meio de rastreamento fluorescente

Este artigo vídeo ilustra os set-up, os procedimentos para consertar os corpos celulares e como implementar as gravações braçadeira dinâmicas a partir de células ganglionares em todo o monte do mouse retina. Esta técnica permite a investigação da contribuição precisa de inputs sinápticos excitatórios e inibitórios, e sua magnitude relativa e tempo para spiking neuronal.

Implementação da braçadeira dinâmico com Condutâncias Synaptic e Artificial em células ganglionares da retina do rato

A retina de murino neonatal fornece um modelo fisiológico bem caracterizado da angiogénese, que permite investigações dos papéis dos diferentes genes ou drogas que modulam a angiogénese...

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

O protocolo descrito aqui é para avaliação estrutural de uma preparação retiniana de montagem total. Isso inclui descrições de dissecção tecidual, montagem em uma inserção de membrana de politetrafluoretileno (PTFE) hidrofilizada, carregamento em bolus com marcadores fluorescentes e uma comparação da fixação com carbodiimida e paraformaldeído para análise imuno-histoquímica de componentes celulares e sinápticos.

Protocolo otimizado para preparação de montagem total da retina para imagem e imuno-histoquímica

Imunohistoquímica protocolos são usados ​​para estudar a localização de uma proteína específica na retina. Técnicas de imagem de cálcio são utilizados para estudar a dinâmica de cálcio nas células ganglionares da retina e seus axônios.

Os métodos de imagem de imuno-histoquímica e cálcio em Wholemount Rat Retina

Aqui, apresentamos uma abordagem combinatória para classificar tipos de células neuronais antes do isolamento e para a caracterização subsequente de transcriptomas de célula única. Este protocolo otimiza a preparação de amostras para o bem sucedido RNA Sequencing (RNA-Seq) e descreve uma metodologia projetada especificamente para a compreensão melhorada da diversidade celular.

Single-cell RNA-Seq de subgrupos definidos de células de gânglio retiniano

Este protocolo descreve as etapas detalhadas da microscopia imunoeletrônica pré-incorporada, com foco na exploração de circuitos sinápticos e localização de proteínas na retina.

Investigando circuitos retinianos e localização molecular por microscopia imunoeletrônica pré-incorporada

Este protocolo descreve o procedimento para isolar a retina de camundongo de montagem inteira e realizar imunocoloração para marcar todas as células ganglionares da retina (RGCs). O processo é seguido por imagens e contagem automática de RGCs usando software baseado em IA, fornecendo um método simples, rápido e preciso para quantificar RGCs em toda a retina do camundongo.

Imunocoloração de montagem total e contagem automática de células ganglionares da retina de camundongos

A retina exibe uma organização espacial complexa em toda a sua estrutura laminar. As técnicas modernas de transcriptômica espacial e sequenciamento requerem seções de tecido &lt; 20 μm de espessura, limitando sua aplicabilidade na pesquisa da retina. Este método de crioseccionamento recém-congelado produz seções finas na face da retina do camundongo, preservando as relações espaciais planares, permitindo um mapeamento molecular abrangente entre as lâminas.

En face Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

Aqui, descrevemos o uso de um método de marcação de fosfatase alcalina (AP) geneticamente direcionado para investigar as características anatômicas e fenótipos de retinas de camundongos sob excitotoxicidade induzida por NMDA. Em conjunto com várias linhas repórter específicas do subtipo de células ganglionares da retina (RGC), descobrimos novos fenótipos em RGCs moribundos ao longo do processo degenerativo.

Exame das características anatômicas das células ganglionares da retina sob excitotoxicidade induzida por ácido N-metil-D-aspártico (NMDA)

Aprenda um método de preparação de montagem inteira à base de metanol para investigação de células ganglionares da retina. Esta técnica permite o armazenamento de longo prazo de amostras retinianas sem imunomarcação imediata, facilitando pesquisas futuras em neuropatias ópticas degenerativas.

Preparação de montagem inteira à base de metanol para a investigação de células ganglionares da retina

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