Name: Um implante de acionamento leve para gravações crônicas de tetrodo em camundongos juvenis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Aprenda a realizar gravações crônicas de tetrodo em camundongos juvenis usando um micro-drive de acionamento leve. Este método permite registrar atividade neural em múltiplas regiões cerebrais simultaneamente.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health R01 NS104829 (B.E.P.), R01 MH117149 (L.J.V.) e F99NS12053 (L.D.Q.) e pelo UT Southwestern GSO Endowment Award (R.J.P. e L.D.Q.). Os autores agradecem a Jenny Scaria (Texas Tech University Health Sciences Center School of Pharmacy) pela assistência técnica e ao Dr. Brendon Watson (University of Michigan) pelas sugestões metodológicas.

Implante Micro-Drive para Registro da Atividade Neural Diária em Camundongos Juvenis

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<li>Voigts, J., Newman, J. P., Wilson, M. A., Harnett, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy-to-assemble%2C+robust%2C+and+lightweight+drive+implant+for+chronic+tetrode+recordings+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">An easy-to-assemble, robust, and lightweight drive implant for chronic tetrode recordings in freely moving animals.</a> Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026044(2020).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Experimentos modernos explorando a função de circuitos neurais in vivo em roedores frequentemente utilizam eletrofisiologia extracelular via eletrodos permanentemente implantados para monitorar a atividade de neurônios individuais (ou seja, unidades únicas) ou populações locais (via potenciais de campo locais, LFP), mas tais métodos raramente são aplicados a camundongos juvenis devido a desafios técnicos. Este manuscrito descreve um método para obter registros eletrofisiológicos in vivo em camundongos através das janelas críticas de desenvolvimento de p20 a p60 e além. Essa metodologia envolve um processo de fabricação para a impressão e construção de um implante de micro-drive, um procedimento de implante cirúrgico e uma estratégia de recuperação pós-cirurgia, todos adaptados especificamente para uso em camundongos juvenis. Várias considerações foram influentes no desenvolvimento deste protocolo, incluindo o pequeno tamanho e a fraqueza relativa de camundongos juvenis em comparação com seus homólogos adultos, bem como a ossificação reduzida do crânio de camundongos juvenis no qual a micro-unidade precisava ser anexada.
Dois métodos primários comumente usados para realizar eletrofisiologia in vivo são arranjos de eletrodos (por exemplo, tetrodos) e sondas de silício. Sondas de silicone são leves, podem fornecer um grande número de locais de registro por unidade de peso e foram previamente utilizadas em ratos juvenis25. No entanto, as sondas de silício são relativamente caras por unidade. Em contraste, o micro-drive descrito neste manuscrito pode ser construído usando menos de US$ 50 em matérias-primas, tornando-se uma opção econômica para gravação in vivo . Além disso, as sondas de silicone muitas vezes devem ser implantadas em linhas fixas, o que proíbe o registro de regiões cerebrais espacialmente diversas. Em contraste, o projeto de micro-drive descrito neste manuscrito utiliza tetrodos ajustáveis independentemente para acomodar gravações simultâneas em até 16 locais diferentes, praticamente sem restrição na relação espacial entre esses locais. Este projeto de micro-acionamento pode ser facilmente modificado para permitir o direcionamento de locais diferentes daqueles descritos aqui, movendo as extrusões do orifício da cânula para qualquer localização anterior/posterior e medial/distal desejada. Ao visar áreas cerebrais alternativas, é importante notar que, embora os tetrodos muitas vezes viajem retos, é possível que esses fios finos se desviem ligeiramente à medida que saem da cânula de micro-unidade. Assim, quanto menor ou mais ventral for uma região cerebral, mais desafiador será atingir com sucesso a área com tetrodos.
O implante de micro-drive descrito neste manuscrito é fundamentalmente semelhante a vários projetos anteriores de micro-drive baseados em tetrodo 23,32,33,34,35 em que os tetrodos individuais são afixados em parafusos, que permitem o controle fino da profundidade de registro de cada tetrodo. Embora várias características do projeto atual do micro-drive sejam únicas, incluindo a facilidade de segmentar áreas cerebrais espacialmente distribuídas, a principal novidade do presente manuscrito é a descrição do implante cirúrgico e das estratégias de recuperação pós-cirurgia, que permitem estudos crônicos da atividade da rede em camundongos juvenis ainda em desenvolvimento. De fato, as metodologias de cirurgia e recuperação aqui descritas poderiam ser adaptadas para suportar outros implantes em camundongos jovens.
Para manter um registro consistente ao longo de vários dias, os fios ou sondas devem ser fixados rigidamente no crânio. Enquanto a estrutura geral do crânio de camundongos sofre apenas pequenas alterações após p20, o crânio engrossa consideravelmente entre as idades p20 e p4536. De fato, o crânio em p20 é insuficientemente rígido para suportar um implante anexado sem ser danificado. Para superar essa limitação biológica, este protocolo engrossa artificialmente o crânio via cianoacrilato durante a cirurgia de implante. A implantação em camundongos com menos de p20 é provavelmente possível usando essa estratégia, mas o crânio de camundongos sofre mudanças consideráveis de tamanho e forma até aproximadamente p2036. Assim, o implante por longos períodos em camundongos com menos de p20 não é recomendado, pois o cianoacrilato e os parafusos ósseos fixos no crânio ainda em desenvolvimento podem afetar significativamente o crescimento natural do crânio e o desenvolvimento do tecido cerebral subjacente. É importante ressaltar que, neste estudo, não foi observado impacto nas medidas macroscópicas do crânio ou do tamanho do cérebro após o implante crônico a partir de p20 (Figura 5C).
Uma etapa crítica no método descrito neste manuscrito é a estratégia de recuperação pós-operatória; De acordo com essa estratégia, o peso do implante deve ser continuamente contrabalançado à medida que o camundongo amadurece e sofre desenvolvimento muscular e do sistema musculoesquelético. No início após o implante, os camundongos são incapazes de suportar com sucesso o peso do implante sem o contrapeso, levando à desnutrição e desidratação, já que o camundongo não consegue alcançar adequadamente as fontes de alimento e água em sua gaiola. O sistema de contrapeso é fácil e barato de construir, trivial de implementar, e permite que ratos de qualquer idade implantável explorem livremente toda a sua gaiola doméstica, garantindo assim nutrição e hidratação adequadas. À medida que os ratos envelhecem, a quantidade de contrapeso pode ser diminuída até que possa ser totalmente removida em camundongos adultos; no entanto, recomenda-se o uso contínuo do sistema de contrapeso durante a duração do experimento, com pelo menos um contrapeso nominal ligado em todos os momentos. Enquanto um camundongo adulto pode ser capaz de suportar o tamanho e o peso da microunidade ao longo do tempo, o movimento natural contínuo durante o comportamento livre sem contrapeso de melhora produz torque e força de cisalhamento nos parafusos ósseos que ancoram a microunidade no crânio, tornando-a cada vez mais propensa a se desprender, especialmente durante experimentos crônicos mais longos.
Duas limitações importantes são dignas de nota para o presente estudo. Primeiro, para avaliar o impacto do implante em p20 no desenvolvimento do crânio e do cérebro, várias coortes de camundongos foram sacrificadas após implante prolongado (Figura 5C). Embora essas análises não tenham revelado impacto significativo do implante no tamanho da cavidade craniana ou na massa cerebral (Figura 5C), o presente estudo não examinou o tamanho do crânio ou a massa cerebral em vários momentos ao longo do período inicial de desenvolvimento de p20-p60. Embora trabalhos anteriores demonstrem que o desenvolvimento da cavidade cerebral se completa até p2036, é possível que a implantação nessa janela inicial possa produzir mudanças inesperadas que são corrigidas ou compensadas pelas idades adultas aqui avaliadas. Em segundo lugar, os experimentos que produziram os dados eletrofisiológicos mostrados na Figura 3 e na Figura 4 não foram projetados para maximizar o rendimento celular. Assim, embora os dados aqui apresentados demonstrem registros estáveis, crônicos e unidades isoladas bem isoladas, eles não devem ser tomados como representativos do rendimento potencial máximo para esse dispositivo.
Muitos transtornos neurológicos e psiquiátricos humanos se manifestam durante períodos de desenvolvimento precoce ou ao longo da adolescência, incluindo autismo e esquizofrenia. No entanto, pouco se sabe sobre a disfunção em nível de circuito que pode estar subjacente a essas doenças, apesar da infinidade de modelos de camundongos disponíveis. A identificação dessas mudanças iniciais na rede é fundamental para a criação de estratégias de detecção precoce e paradigmas de tratamento. No entanto, devido a desafios técnicos, ainda não está claro como a função da rede é interrompida em todo o desenvolvimento em modelos de camundongos de doenças neuropsiquiátricas. A estratégia de micro-drive e recuperação descrita aqui é projetada para apoiar investigações sobre o desenvolvimento de redes cerebrais multirregionais no cérebro de camundongos e, assim, permitir que os pesquisadores meçam o desenvolvimento cerebral saudável, bem como identifiquem alterações nesse desenvolvimento em modelos de doença em camundongos.

O cérebro sofre mudanças em larga escala durante as janelas críticas de desenvolvimento da infância e adolescência 1,2,3. Muitas doenças neurológicas e psiquiátricas, incluindo autismo e esquizofrenia, manifestam-se comportamental e biologicamente pela primeira vez durante esse período de desenvolvimento cerebral juvenil e adolescente 4,5,6. Embora muito se saiba sobre as mudanças celulares, sinápticas e genéticas que ocorrem ao longo do desenvolvimento inicial, comparativamente pouco se sabe sobre como os processos em nível de circuito ou rede mudam ao longo dessa janela de tempo. É importante ressaltar que a função cerebral em nível de circuito, que em última análise está subjacente a comportamentos complexos, memória e cognição, é uma propriedade emergente e não previsível da função celular e sináptica 7,8,9,10. Assim, para entender completamente a função cerebral em nível de rede, é necessário estudar diretamente a atividade neural no nível de um circuito neural intacto. Além disso, para identificar como a atividade cerebral é alterada ao longo da progressão dos transtornos neuropsiquiátricos, é fundamental examinar a atividade da rede em um modelo de doença válido durante a janela temporal específica em que os fenótipos comportamentais da doença se manifestam e rastrear as mudanças observadas à medida que persistem na idade adulta.
Um dos organismos modelo científicos mais comuns e poderosos é o camundongo, com grande número de linhagens genéticas únicas que modelam distúrbios do neurodesenvolvimento com início dependente da idade dos fenótipos comportamentais e/ou mnemônicos 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Embora seja desafiador correlacionar pontos precisos de tempo de desenvolvimento entre os cérebros de humanos e camundongos, comparações morfológicas e comportamentais indicam que os camundongos p20-p21 representam as idades humanas de 2-3 anos de idade, e os camundongos p25-p35 representam as idades humanas de 11-14 anos, com camundongos provavelmente atingindo o equivalente de desenvolvimento de um adulto humano de 20 anos por p603, 22º. Assim, para entender melhor como o cérebro juvenil se desenvolve e identificar como as redes neurais do cérebro se tornam disfuncionais em doenças como autismo ou esquizofrenia, o ideal seria monitorar diretamente a atividade cerebral in vivo em camundongos com idades entre 20 dias e 60 dias de idade.
No entanto, um desafio fundamental no monitoramento da atividade cerebral ao longo do desenvolvimento inicial em camundongos é o pequeno tamanho e a relativa fraqueza de camundongos juvenis. O implante crônico de eletrodos, necessário para estudos longitudinais do desenvolvimento cerebral, tipicamente requer carcaça grande e volumosa para proteger os fios finos dos eletrodos e as placas de interface23,24, e os implantes devem estar firmemente fixados ao crânio de camundongos, que é mais fino e menos rígido em camundongos jovens devido à reduzida ossificação. Assim, praticamente todos os estudos de fisiologia in vivo de roedores foram realizados em indivíduos adultos devido ao seu tamanho relativo, força e espessura do crânio. Até o momento, a maioria dos estudos explorando a fisiologia do cérebro de roedores juvenis in vivo foi realizada em ratos juvenis selvagens, o que necessariamente limita a capacidade de monitorar experimentalmente a função cerebral juvenil em um modelo de comportamento livre de um distúrbio humano 25,26,27,28,29,30.
Este manuscrito descreve a nova carcaça do implante, um procedimento cirúrgico de implantação e uma estratégia de recuperação pós-cirurgia para estudar cronicamente a função cerebral in vivo a longo prazo (até 4 ou mais semanas) de camundongos juvenis através de uma janela de tempo crítica para o desenvolvimento (p20 a p60 e além). O procedimento de implantação permite a fixação confiável e permanente dos eletrodos nos crânios de camundongos juvenis. Além disso, o design do micro-drive é leve, pois este micro-drive pesa ~4-6 g quando totalmente montado, e devido ao contrabalanceamento mínimo necessário para compensar o peso do implante, ele não afeta o desempenho comportamental de camundongos juvenis durante paradigmas comportamentais típicos.

<table><tbody><tr><td>LEDs de rastreamento de vídeo de 10 V</td><td>Neuralynx</td><td>HS-LED-Vermelho/Verde-omni-10V</td><td>Para uso com pré-amplificadores de headstage que contêm soquetes de LED para fins de rastreamento de movimento</td></tr><tr><td>16TT EIB Board</td><td>Neuralynx</td><td>EIB-36-16TT</td><td>Placa de interface eletrônica - conector omnético</td></tr><tr><td>16TT pré-amplificador de headstage</td><td>Neuralynx</td><td>HS-36-LED</td><td>Amplificador de sinal de soquete Omnetics 44 entre a placa EIB e o cabo de amarração para aplicações de gravação; inclui conectores para LEDs de cabeçote para fins de rastreamento de movimento</td></tr><tr><td>Baby-Mixter</td><td>hemostat FST</td><td>13013-14</td><td>Hemostático fino curvado</td></tr><tr><td>Parafuso de ancoragem óssea</td><td>Stoelting</td><td>51457</td><td>Usado para fixar a placa EIB ao corpo principal da</td></tr><tr><td>unidade Burpenorphine</td><td>ZooPharm</td><td>Lote #BERLAB0.5-221207</td><td>Burpenorfina (0,5 mg/mL) quantidade de 5mL</td></tr><tr><td>Cabo de amarração</td><td>Neuralynx</td><td>HS-36 Litz Tether</td><td>Fio blindado leve para headstages omnéticos; opções de comprimento de 1 m/2 m/3 m/5 m</td></tr><tr><td>Carprofeno/Rimadyl</td><td>Bio-Serve</td><td>MD150-2</td><td>Agente anti-inflamatório pós-operatório</td></tr><tr><td>Resina transparente v4</td><td>Formlabs</td><td>FLGPGR04</td><td>Resina líquida que é fotopolimerizada por impressora 3D durante o processo de impressão 3D</td></tr><tr><td>Parafuso personalizado (shuttle)</td><td>Advanced Machining and Tooling, Inc.</td><td></td><td>Parafusos personalizados usinados e rosqueados</td></tr><tr><td>Componente líquido acrílico dental</td><td>Teets material de dentadura</td><td>Lote# 329801</td><td>componente líquido&nbsp; de material de dentadura (veja acima)</td></tr> <tr><td>Componente de pó acrílico dental</td><td>Teets material de dentadura</td><td>Lote# 583987</td> <td>material de dentadura "cura fria", metacrilato de metila; misturado com componente líquido para aplicação para fixar o dispositivo de gravação no lugar</td></tr><tr><td>DietGel Boost</td><td>ClearH2O</td><td>72-04-5022</td><td>Suplemento dietético de alta caloria para camundongos jovens/em recuperação</td></tr><tr><td>Digital Lynx 16SX</td><td>Neuralynx</td><td>DigitalLynx 16SX Base</td><td>Aparelho de gravação principal com 16 slots de placa combinada para até 512 canais de gravação</td></tr><tr><td>Tesouras de dissecção - lâminas pesadas</td><td>FST</td><td>14082-09</td><td>Várias</td></tr><tr><td>pinças revestidas de cerâmica Dumont #5</td><td>FST</td><td>11252-50</td><td>Manuseio/rosqueamento/pinagem de</td></tr><tr><td>Tetrodo Pinça de #5SF Dumont</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>Uso de montagem multiuso</td></tr><tr><td>Pinça de #5SF Dumont</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>Uso cirúrgico multiuso</td></tr><tr><td>Pinça fina Dumont #7 (curvada)</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td>Várias</td></tr><tr><td>pinças finas Dumont #7 (curvada)</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td>Uso cirúrgico multiuso</td></tr><tr><td>EIB-36 adaptador de chapeamento</td> Adaptador de chapeamento <td>Neuralynx</td><td>EIB-36</td><td>Chapeamento/montagem use</td></tr><tr><td>adaptador de chapeamento EIB-36</td> Adaptador de chapeamento <td>Neuralynx</td><td>EIB-36</td><td>Acessório estereotáxico para abaixar o acionamento no crânio durante a cirurgia</td></tr><tr><td>Euthasol</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td>Pentobarbital sódico para eutanásia</td></tr><tr><td>Tesoura Bonn extra fina</td><td>FST</td><td>14083-38</td><td>Vários</td></tr><tr><td>Extra fino pinça graefe</td><td>FST</td><td>11150-10</td><td>Pinça serrilhada reta pequena</td></tr><tr><td>Pinça graefe extra fina</td><td>FST</td><td>11150-10</td><td>Pinça serrilhada reta pequena</td></tr><tr><td>Hemostáticos finos</td><td>FST</td><td>13006-12</td><td>Hemostáticos finos</td></tr><tr><td>Tesouras finas- CeramaCut</td><td>FST</td><td>14958-09</td><td>Corte Tetrode</td></tr><tr><td>Tesouras finas- ToughCut</td><td>FST</td><td>14058-09</td><td>Vários</td></tr><tr><td>Form 3+</td><td>Formlabs</td><td>PKG-F3-P-WS-SVC-BASIC</td><td>impressora 3D para fabricação de todas as peças/materiais impressos; impressora 3D de estereolitografia de baixa força (LFS)</td></tr><tr><td>Gel super cola</td><td>Loctite</td><td>1363589</td><td>Várias etapas</td></tr><tr><td>Pinça Graefe</td><td>FST</td><td>11049-10</td><td>Pinça serrilhada angular pequena</td></tr><tr><td>Fio terra</td><td>A-M Systems</td><td>Lote# 582335</td><td>Fio nu de aço inoxidável, .005" de diâmetro, recozido, 100 pés</td></tr><tr><td>Gel de depilação</td><td>Genérico</td><td>Disponível comercialmente</td><td>Para remoção pré-operatória de pelos do topo da cabeça do rato</td></tr><tr><td>Pistola de calor</td><td>Dewalt</td><td>D26960K</td><td>Tetrode fusão após fiação</td></tr><tr><td>Kit de cautério de alta temperatura</td><td>FST</td><td>18010-00</td><td>Para uso com cera óssea se aplicável</td></tr><tr><td>Esterilizador de esferas quentes</td><td>FST</td><td>18000-45</td><td>Aparelho de esterilização elétrica para esterilização de instrumentos ad hoc durante procedimentos cirúrgicos</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Covetrus</td><td>11695067771</td><td>Anestesia líquida isoflurana padrão para uso em vaporizador de isoflurano até no máximo 5%</td></tr> <tr><td>Álcool isopropílico 91%</td> <td>Genérico</td><td>Disponível comercialmente</td><td>Para procedimento de esterilização pré-operatório padrão</td></tr><tr><td>Parafuso de joalheria (parafusos ósseos para camundongos juvenis)</td><td>Fornecimento de componentes co.</td><td>MX-000120-02SFL</td><td>S/S parafuso de máquina #000-120 x 1/8'' cabeça de filister, tesoura LaGrange de acionamento com fenda</td></tr><tr><td></td><td>FST</td><td>14173-12</td><td>Vários</td></tr><tr><td>tubos de poliimida grandes</td><td>Nordson medical</td><td>Lote # 13564</td><td>Tubo de poliimida - diâmetro interno 0,0071"; diâmetro externo 0,0115"; comprimento 36"</td></tr><tr><td>Cola super líquida</td><td>Loctite</td><td>1365882</td><td>Várias etapas</td></tr><tr><td>Micro kit</td> de micromotor rotativo de alta velocidade <td>Foredom</td><td>K.1070</td><td>K.1070; com caixa de controle, pinça de 3/32", controle de pé de velocidade variável, berço de peça de mão; estereoticamente ajustável; 100&ndash; 115 V usam</td></tr><tr><td>micro broca (0,5 mm +)</td> <td>FST</td><td>19007-05/07/09</td><td>Craniotomia</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma</td><td>Pcode 1002076577; M5904-500mL</td><td>Várias etapas</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma</td><td>Pcode 1002076577; M5904-500mL</td><td>Para uso mantendo os orifícios de craniotomia abertos</td></tr><tr><td>Chave de fenda miniatura</td><td>FST</td><td>30051-10</td><td>Inserção/aperto de parafusos ósseos</td></tr><tr><td>Neosporin Triple Antibiotic Pomada</td><td>Johnson & </td><td>Pomada antibiótica</td>Johnson <td>512373700</td></tr><tr><td>Omnetics 44 soquete nano conector</td><td>Neuralynx Neuralynx parte #A70427-801</td><td>ITEM NÃO PADRÃO- omnetics 44 soquete (fêmea) conector nano de perna reta de linha dupla com 2 pinos guia (macho) para uso com aparelho de contrapeso personalizado</td><td></td></tr><tr><td>Fio de irídio de platina 10% Fio</td><td>fino da Califórnia</td><td>MO# M374710</td><td>Fio de gravação fino girado em tetrodos para uso durante a gravação usando a estação de montagem de terode e spinner 2.0 (veja abaixo); HML NATRL VG BOND COAT; TAMANHO .0007 X 200FT</td></tr><tr><td>Solução de revestimento preto de platina</td><td>Neuralynx</td><td>Solução de revestimento preto de platina</td><td>Revestimento</td></tr><tr><td>de fundo de gaiola de policarbonato</td><td>Thomas Scientific/Maryland plastics</td><td>1113M35; mfr. No. E0270</td><td>Fundo de gaiola padrão; pode ser equipado com aparelho de malha de arame por cima que contém ração + garrafa de água para camundongos não implantados</td></tr><tr><td>Parte superior da gaiola de policarbonato com micro filtro N10</td><td>Ancare</td><td>N / A</td><td>Parte superior da gaiola padrão a ser modificada com tubo de PVC para aparelho de contrapeso</td></tr><tr><td>Iodo povidona 10%</td> <td>Genérico</td><td>Disponível comercialmente</td><td>Para procedimento de esterilização pré-operatória padrão</td></tr><tr><td>Tubo de PVC</td><td>Tubo Charlotte</td><td>N / A</td><td>1/2 "x 600 PSI cronograma 40 tubo de PVC branco; para uso/montagem em aparelho de contrapeso durante a recuperação do mouse</td></tr><tr><td>Lâminas de bisturi- #4</td><td>FST</td><td>10060-00</td><td>Incisão use</td></tr><tr><td>cabo de bisturi - # 4 anatomia grosseira</td><td>FST</td><td>10060-13</td><td>Incisão use</td></tr><tr><td>pino auto-segurando e fórceps de parafuso ósseo</td><td>FST</td><td>26100-00</td><td>Suporte para parafusos de osso e aterramento ao inserir no crânio</td></tr><tr><td>Pequenos pinos EIB</td><td>Neuralynx</td><td>Pequenos pinos EIB</td><td>Fixação de fios de tetrodo à placa EIB</td></tr><tr><td>Pequeno tubo de poliimida</td><td>Nordson médico</td><td>Lote # 19102423</td><td>Diâmetro interno da tubulação 0,004'' da poliimida; diâmetro externo 0,0044 ''; comprimento 36"</td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>Dassault Systemes</td><td>SolidWorks</td><td>Programa CAD 3D para design de micro-drive</td></tr><tr><td>Espátula e sonda</td><td>FST</td><td>1090-13</td><td>Aplicador para vaselina/óleo mineral + uso opcional para endireitamento de tetrodo ad hoc</td></tr><tr><td>Tesoura de mola- 8 mm</td><td>FST</td><td>15024-10</td><td>Tesoura para incisões de tecido craniano</td></tr><tr><td>Tesoura de mola- 8 mm</td><td>FST</td><td>15024-10</td><td>Incisões iniciais</td></tr><tr><td>Pinça de padrão padrão</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td>Pinça serrilhada grande</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica - afiada-romba</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td>Várias</td></tr><tr><td>tesouras cirúrgicas - ToughCut</td><td>FST</td><td>14054-13</td><td>Várias</td></tr><tr><td>estações de montagem Tetrode</td> Estação de montagem <td>Neuralynx</td><td>Tetrode</td><td>Montagem Tetrode</td></tr><tr><td>Spinner Tetrode 2.0</td><td>Neuralynx</td><td>Tetrode spinner 2.0</td><td>Tetrode Assembly</td></tr><tr><td>Epóxi de duas partes</td><td>da marca Gorilla</td><td>4200102</td><td>Várias etapas</td></tr></tbody></table>

um implante de acionamento leve para gravações crônicas de tetrodo em camundongos juvenis

A Lightweight Drive Implant for Chronic Tetrode Recordings in Juvenile Mice

A eletrofisiologia in vivo fornece uma visão incomparável sobre a dinâmica de circuitos de sub-segundo nível do cérebro intacto e representa um método de particular importância para o estudo de modelos de camundongos de transtornos neuropsiquiátricos humanos. No entanto, tais métodos geralmente requerem grandes implantes cranianos, que não podem ser usados em camundongos nos primeiros momentos de desenvolvimento. Como tal, praticamente nenhum estudo de fisiologia in vivo foi realizado em camundongos infantis ou juvenis de comportamento livre, apesar do fato de que uma melhor compreensão do desenvolvimento neurológico nessa janela crítica provavelmente forneceria insights únicos sobre transtornos de desenvolvimento dependentes da idade, como autismo ou esquizofrenia. Aqui, um projeto de micro-unidade, procedimento de implante cirúrgico e estratégia de recuperação pós-cirurgia são descritos que permitem registros de campo crônico e de unidade única de várias regiões cerebrais simultaneamente em camundongos à medida que envelhecem do dia pós-natal 20 (p20) ao dia pós-natal 60 (p60) e além, uma janela de tempo aproximadamente correspondente às idades humanas de 2 anos de idade até a idade adulta. O número de eletrodos de gravação e locais de registro final podem ser facilmente modificados e expandidos, permitindo assim um controle experimental flexível do monitoramento in vivo de regiões cerebrais relevantes para o comportamento ou a doença ao longo do desenvolvimento.

O protocolo descrito acima foi usado para registrar sinais potenciais de campo local e unidades únicas de múltiplas áreas cerebrais simultaneamente em camundongos, com registros diários realizados nos mesmos camundongos de p20 a p60. Aqui são relatados registros eletrofisiológicos representativos de dois camundongos e histologia pós-experimento demonstrando os locais finais de registro.
Implantação cirúrgica do micro-drive em camundongos p20 Um micro-drive (Figura 1) foi construído (Figura 2) e implantado cirurgicamente em um camundongo p20, conforme descrito acima. Imediatamente após a cirurgia, o camundongo foi acoplado ao sistema de contrapeso (Figura 2G-I) e permitiu a recuperação. Uma vez que o mouse estava totalmente móvel, o micro-drive foi conectado a um sistema de gravação de eletrofisiologia in vivo. Os cabos que conectavam o micro-drive ao aparelho de gravação foram suspensos acima do mouse. Registros eletrofisiológicos (32 kHz) foram obtidos em todos os canais por 1 h enquanto o camundongo se comportava naturalmente em sua gaiola de origem. Após a gravação, o mouse foi desconectado do sistema de gravação, reconectado ao sistema de contrapeso e devolvido ao biotério com livre acesso à água e ração.
Registro diário da atividade neural Registros eletrofisiológicos foram obtidos diariamente por várias semanas para permitir o monitoramento crônico da mesma região cerebral através das janelas críticas de desenvolvimento de p20-p60. Amostras de potenciais de campo local brutos (LFP) de todos os registros crônicos são mostradas na Figura 3A,C. Unidades isoladas foram obtidas simultaneamente a partir de múltiplos tetrodos (Figura 3B). Unidades com formas de onda semelhantes foram identificadas ao longo de vários dias (Figura 3B, meio e direita), mas devido à deriva potencial do eletrodo de registro, não foi possível afirmar definitivamente que a mesma unidade estava sendo identificada ao longo dos dias. Em um camundongo separado implantado em p20 e registrado diariamente por várias semanas, a atividade neural foi examinada em um tetrodo visando a área dorsal CA1. Ondulações de grande amplitude e unidades isoladas bem isoladas foram identificadas em cada dia de registro (Figura 4). Esses dados indicam que registros eletrofisiológicos in vivo estáveis e de alta qualidade podem ser do mesmo camundongo durante o desenvolvimento inicial.
Confirmação histológica dos locais de registro e o impacto do implante crônico no desenvolvimento Após o último dia de registro, o camundongo foi completamente anestesiado por meio de anestesia com isoflurano, seguido de uma injeção letal de pentobarbital sódico, e uma corrente foi passada através das pontas dos eletrodos para produzir pequenas lesões nos locais de registro. O corte histológico pós-experimento do cérebro de camundongos permitiu a visualização dos locais finais de registro (Figura 5A,B). Em uma coorte separada, três camundongos machos e três fêmeas foram implantados cirurgicamente em p20, conforme descrito acima. Igual número de ninhadas não foi implantado e mantido em idênticas condições de alojamento. Os camundongos foram sacrificados em p62 (6 semanas pós-cirurgia para a coorte implantada). Os crânios foram cuidadosamente limpos, e foram realizadas medidas externas da distância bregma-lambda (Figura 5C, canto superior esquerdo) e da largura máxima externa do crânio no lambda (Figura 5C, canto superior direito). Uma incisão foi feita ao longo da linha média do crânio, e metade do crânio foi removida para exérese do cérebro para medida de massa (Figura 5C, canto inferior direito). A altura da cavidade craniana no bregma foi medida a partir da metade do crânio intacto (Figura 5C, canto inferior esquerdo). Nenhuma medida foi significativamente diferente entre as coortes implantadas e não implantadas (teste da soma de postos de Wilcoxon), indicando que o implante a longo prazo, a partir de p20, não tem impacto macroscópico no desenvolvimento natural do crânio ou volume cerebral.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65228/65228fig01.jpg"> Figura 1: Componentes da microunidade. Renderizações tridimensionais do (A) corpo de micro-acionamento, (B) cânula, (C) cone, (D) tampa, (E) acessórios de parafuso e (F) parafuso de avanço de tetrodo. As características críticas de cada componente são indicadas. Os detalhes da medição podem ser extraídos dos arquivos de modelo disponíveis em https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive/. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65228/65228fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65228/65228fig02.jpg"> Figura 2: Construção do micro-drive . (A) Vista lateral e (B) superior do parafuso de avanço do tetrodo com os acessórios de parafuso superior e inferior conectados. (C) Vista lateral e (D) superior do micro-acionamento com o corpo e a cânula acoplados e o grande tubo de poliimida atravessando cada orifício da cânula e aparado até o fundo da cânula. (E) Vista lateral do micro-acionamento com os parafusos e pequenos tubos de poliimida no lugar. Os topos dos pequenos tubos de poliimida são aparados imediatamente antes do carregamento do tetrodo. (F) Micro-drive completo acoplado ao aparelho estereotáxico. O cone de proteção que normalmente cercaria a microunidade foi removido para fins de visualização. Observe que alguns dos acessórios de parafuso foram impressos em uma resina preta para este micro-drive. (G) Sistema de apoio ao contrapeso. (H) Vista lateral e (I) superior de uma gaiola do mouse com o sistema de suporte de contrapeso conectado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65228/65228fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65228/65228fig03.jpg"> Figura 3: Registros eletrofisiológicos representativos. Um camundongo p20 foi implantado com um micro-drive como descrito acima. A partir de p21 e, posteriormente, todos os dias durante 2 semanas, o camundongo foi conectado ao aparelho de registro, e a atividade neural foi registrada por pelo menos 1 h. (A) Registros de potencial de campo local bruto (LFP) do bilateral (L = esquerda; R = direita) córtex cingulado anterior (ACC), área hipocampal CA3 (CA3) e área hipocampal CA1 (CA1). Os dados foram coletados diariamente; Para maior clareza, apenas dados de dias ímpares são exibidos. Todos os vestígios foram feitos durante os períodos de imobilidade na gaiola domiciliar. Barra de escala: 1 mV, 2 s. (B) Unidades individuais representativas isoladas da área hipocampal CA3 (esquerda) e CA1 (direita) para os registros no painel A. Todas as formas de onda brutas em cada eletrodo são mostradas em preto; a média está em vermelho. Barra de escala: 50 μV, 0,2 ms. (C) Traços representativos de LFP bruto para cada 10º dia até o último dia de registro em p60 para um segundo camundongo implantado em p20. Os dados foram coletados diariamente; Para maior clareza, apenas os dados de cada 10º dia são exibidos. Todos os vestígios foram feitos durante os períodos de imobilidade na gaiola domiciliar. Barra de escala: 1 mV, 2 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65228/65228fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65228/65228fig04.jpg"> Gráfico 4. Estabilidade dos registros crônicos. Um camundongo p20 foi implantado com um micro-drive, como descrito acima. A partir de p21 e, posteriormente, por 4 semanas, o camundongo foi acoplado ao aparelho de registro, e a atividade neural foi registrada por pelo menos 1 h. São mostrados dados dos tetrodos visando o CA1 do hipocampo dorsal. (A) LFP bruto (superior) e filtrado por ondulação (inferior) para eventos de ondulação identificados em p21, p30 e p40. Para identificar eventos de ripple, o LFP bruto foi filtrado passa-banda entre 125 Hz e 300 Hz, e os eventos de ripple foram identificados como aumentos transitórios na potência da banda ripple maiores que 3 desvios padrão acima da média. O início e o fim de cada ondulação foram definidos como o ponto em que a potência da banda de ondulação retornou à média. As ondulações identificadas são mostradas em vermelho. Barra de escala: 100 ms, de cima para baixo: 1.000 μV, 140 μV, 1.800 μV, 180 μV, 9.000 μV, 1.200 μV, 10.000 μV, 1.000 μV. (B) Uma única unidade representativa de cada dia do tetrodo alvo CA1 para as gravações no painel A. Todas as formas de onda brutas em cada eletrodo são mostradas em preto; a média está em vermelho. Barra de escala 0,2 ms, de cima para baixo: 50 μV, 100 μV, 100 μV. (C) Autocorrelograma de todas as pontas para unidades individuais no painel B. Esses dados demonstram a colocação estável de eletrodos dentro da camada piramidal hipocampal ao longo de várias semanas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65228/65228fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65228/65228fig05.jpg"> Figura 5: Histologia representativa e impacto no desenvolvimento craniano. Um camundongo p20 foi implantado com um micro-drive, como descrito acima. Após o último dia de registro em p60, lesões eletrolíticas foram produzidas nos locais de registro, e o cérebro foi perfundido com paraformaldeído a 4%. Para identificar os locais de registro, cortes de 50 μm foram produzidos. (A) Lesões em CA1 e CA3 do hipocampo. A ponta de seta indica o local de registro do CA3; a ponta de seta dupla indica o local de gravação CA1. Barra de escala: 0,5 mm. (B) Lesões no CAC bilateral. As pontas de seta indicam os locais de gravação do ACC. Barra de escala: 0,5 mm. (C) Medidas do tamanho do crânio e da massa cerebral de camundongos p62 implantados com um micro-drive em p20 (cinza) e ninhadas não implantadas (branco). O valor de p do teste da soma de postos de Wilcoxon é relatado para cada medida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65228/65228fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, descrevemos um projeto de micro-unidade, procedimento de implante cirúrgico e estratégia de recuperação pós-cirurgia que permitem gravações crônicas de campo e unidade única de várias regiões cerebrais simultaneamente em camundongos jovens e adolescentes através de uma janela crítica de desenvolvimento do dia pós-natal 20 (p20) ao dia pós-natal 60 (p60) e além.

Um implante de acionamento leve para gravações crônicas de tetrodo em camundongos juvenis

In vivo electrophysiology provides unparalleled insight into the sub-second-level circuit dynamics of the intact brain and represents a method of ...

Estamos interessados em entender como o cérebro opera em nível de rede. Este método é nossa tentativa de explorar o desenvolvimento de redes cerebrais para identificar alterações no desenvolvimento em doenças dependentes da idade como autismo, esquizofrenia ou transtorno bipolar. A tecnologia de sonda de silício fornece um método mais simples e consistente para registrar a atividade da rede in vivo.Mas, apesar disso, as gravações tetra crônicas oferecem algumas vantagens sobre as sondas de silício, como a gravação simultânea sobre uma distribuição espacial mais ampla de regiões cerebrais. Os registros crônicos representam um desafio único para a eletrofisiologia in vivo devido a vários fatores, incluindo gliose nos locais de registro, movimento do local de registro ao longo do tempo ou falha do método de fixação. Nosso trabalho recente demonstrou que as varreduras codificadas pela oscilação do hipocampo durante o movimento ativo do animal a cada cem milissegundos ou mais alternam iterativamente para frente, avaliando prospectivamente possíveis estados futuros e retrospectivamente avaliando ações anteriores.Realizar esses registros in vivo em camundongos juvenis apresenta vários desafios de engenharia devido ao pequeno tamanho dos camundongos, sua relativa fraqueza e a falta de desenvolvimento em seu crânio. Nossa metodologia supera essas limitações e nos permite registrar cronicamente a atividade diária em nível de rede no cérebro de camundongos em desenvolvimento. Além de registrar cronicamente em camundongos juvenis, nosso método nos permite registrar até 16 regiões cerebrais bilaterais distintas, independentemente da relação espacial dessas regiões.Esses desenvolvimentos nos permitirão identificar como as redes estabelecem a comunicação funcional entre os desenvolvimentos, tanto no cérebro saudável quanto em modelos de camundongos de transtornos do neurodesenvolvimento, como os transtornos do espectro do autismo.

a-lightweight-drive-implant-for-chronic-tetrode-recordings-juvenile

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neste protocolo, demonstramos como fabricar uma matriz de unidade de micro-crônica para gravações eletrofisiológicas em ratos.

Micro-drive Array para Crônica In vivo</emGravação>: Fabricação Unidade

Neste protocolo, demonstramos como fabricar e tetrodes condição para uso com uma matriz de micro-drive, que foi projetada para gravações eletrofisiológicas crônica em ratos. Além disso, ilustram as fases finais do micro-drive de construção da matriz, que inclui a instalação de fios de aterramento e um cone de proteção.

Micro-drive Array para Crônica In vivo</emGravação>: Assembléia Tetrodo

O desenho, fabrico e montagem de um ultra-leve motorizado microdrive é descrito. O dispositivo fornece uma solução de custo eficaz e fácil de usar para gravações de crônicas de unidades individuais em pequenos animais se comportando.

Concepção e montagem de um Microdrive Ultra-leve motorizada para doenças crônicas Recordings Neurais em Pequenos Animais

A concepção e montagem de microdrives no registros eletrofisiológicos in vivo de sinais do cérebro do rato é descrito. Anexando pacotes de microeletrodos para portadores de driveable resistentes, estas técnicas permitem gravações neurais de longo prazo e estável. O design leve permite o desempenho comportamental irrestrito pelo animal após a implantação da unidade.

Construção de Matrizes Microdrive para gravações Neurais crônica na Awake Mice comportam

Apresentamos a construção de um hyperdrive 3D-printable com dezoito tetrodes independentemente ajustáveis. O hiperpropulsor é projetado para gravar a atividade cerebral em livremente se comportando ratos durante um período de várias semanas.

Construção de um Hyperdrive melhorado de multi Tetrode para gravação Neural em grande escala em comportar-se ratos

Este protocolo descreve a construção de uma matriz híbrida do Microdrive que permita a implantação de nove tetrodes independentemente ajustáveis e uma ponta de prova ajustável do opto-silicone em duas regiões do cérebro em ratos livremente moventes. Também é demonstrado um método para recuperar e reusar com segurança a sonda opto-silício para múltiplos propósitos.

Sistema híbrido do Microdrive com a ponta de prova recuperável do opto-silicone e tetrode para a gravação high-density do duplo-local em ratos livremente moventes

Aqui, apresentamos um implante exclusivo e imprimível em 3D para ratos, denominado TD Drive, capaz de gravações bilaterais simétricas de eletrodos de fio, atualmente em até dez áreas cerebrais distribuídas simultaneamente.

O TD Drive: um implante paramétrico de código aberto para registros eletrofisiológicos de várias áreas em ratos que se comportam e dormem

Aqui, apresentamos um sistema de implante de sonda leve e econômico para eletrofisiologia crônica em roedores otimizado para facilidade de uso, recuperação de sonda, versatilidade experimental e compatibilidade com o comportamento.

O implante DREAM: um sistema de implante leve, modular e econômico para eletrofisiologia crônica em camundongos com cabeça fixa e comportamento livre

A preparação de fatias cerebrais agudas de isolado hipocampo, assim como as gravações simultâneas electrofisiológicas de astrócitos e neurónios...

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Descrevemos o projeto e montagem de fones de ouvido miniaturizados adequados para a substituição de um feedback do Songbird auditiva natural com um sinal acústico manipulado. Hardware de processamento on-line de som é usado para manipular a saída música, introduzir em tempo real erros no feedback auditivo através dos fones de ouvido, e dirigir a aprendizagem motora vocal.

Um leve, sistema de fones baseado para manipular feedback auditivo em Songbirds

Aprenda a realizar gravações crônicas de tetrodo em camundongos juvenis usando um micro-drive de acionamento leve. Este método permite registrar atividade neural em múltiplas regiões cerebrais simultaneamente.

Um implante de acionamento leve para gravações crônicas de tetrodo em camundongos juvenis

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