Name: Avaliação do Tamanho e Fusão de Gotículas Lipídicas em Células Hepáticas Bovinas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a avaliar o tamanho e a fusão de gotículas lipídicas em células hepáticas bovinas usando coloração com Oil Red O e imagem de células vivas. Este método oferece uma abordagem simples e reprodutível para analisar a dinâmica do metabolismo lipídico.

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Esta pesquisa foi apoiada conjuntamente pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (U1904116).

Todos os procedimentos foram aprovados e realizados de acordo com os padrões éticos do Comitê de Cuidados com Animais da Universidade Agrícola de Henan (Província de Henan, China).
1. Cultura de células de hepatócitos bovinos
<ol><li>Descongelar as células primárias do hepatócito17 e centrifugar 400 x g por 4 min à temperatura ambiente. NOTA: As células primárias dos hepatócitos foram cultivadas e mantidas seguindo um relato previamente publicado17.</li>
	<li>Eliminar a solução de armazenamento congelado com pipeta e suspendê-la com 1 mL de meio contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) e meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). Em seguida, use uma câmara de contagem de células para calcular o número de células por mililitro e, em seguida, calcular a concentração da suspensão celular acima e ajustar a concentração celular para 1 x 107 células/mL.<ol><li>Adicionar a suspensão celular numa placa de cultura celular de 60 mm contendo 3 ml do meio acima. Cultivar as células e incubá-las a 37 °C e 5% CO2 por 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Quando as células crescerem até 80%, descarte o meio e enxágue com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, adicione 750 μL de tripsina a 0,25% para digerir as células. Incubar as células a 37 °C durante 3 minutos e, em seguida, neutralizá-las com a mesma quantidade de FBS a 10%. Recolher a suspensão celular para centrifugar a 200 x g durante 4 minutos à temperatura ambiente.</li>
</ol>2. Coloração de óleo vermelho O
<ol><li>Adicionar 800 μL de meio de cultura contendo 10% de FBS e DMEM em cada poço da placa de cultura celular de 24 poços contendo lamínulas de vidro. Tomar 50 μL da suspensão celular (obtida no passo 1.3) e adicioná-la a 950 μL de PBS para misturar. Use uma câmara de contagem de células para calcular o número de células por mililitro e, em seguida, calcular a concentração da suspensão de células acima. Finalmente, ajustar a concentração celular para 4 x 104/mL em cada poço e incubar a 37 °C e 5% CO2 por 24 h.</li>
	<li>Após 24 h, descartar o meio de cultura e lavar com PBS. Suspender com 800 μL de meio de indução DMEM contendo 1 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA).</li>
	<li>Dissolver um total de 100 μL de AL (ver Tabela de Materiais) em 900 μL de etanol anidro e preparar uma solução-padrão (100 mmol/L). Adicione um gradiente de 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L e 200 μmol/L LA na placa de 24 poços. Repita cada tratamento quatro vezes. Incubar a 37 °C e 5% CO2 durante 24 h.</li>
	<li>Retire o meio de cultura e lave as células com PBS três vezes. Fixar com 400 μL de paraformaldeído a 4% por 20 min. Descarte a solução fixadora e lave-a com PBS três vezes.</li>
	<li>Incubar as células com álcool isopropílico a 60% por 5 min e descartá-las. Adicione a solução de trabalho vermelha O de óleo recém-preparada (consulte a Tabela de Materiais) (proporção 3:2 de óleo vermelho O:água) por 20-30 min e descarte a solução corante. Lave as células com PBS duas a cinco vezes até que não haja excesso de solução de corante.</li>
	<li>Adicionar 300 μL de solução corante de hematoxilina (relação hematoxilina:água de 1:10) e re-corar o núcleo por 1-2 min. Descarte a solução corante e lave as células com PBS de duas a cinco vezes. Retire as lamínulas de vidro da placa de 24 poços e coloque-as em lâminas microscópicas (o lado com as células viradas para baixo) depois de cair 10 μL de selante de comprimido (ver Tabela de Materiais) na lâmina.</li>
	<li>Após a selagem, observe e obtenha imagens dos LDs das células sob a lente de óleo do microscópio óptico (ver Tabela de Materiais). Meça o diâmetro dos LDs pelo software cellSens e analise o número e o tamanho dos LDs.</li>
</ol>3. Medição do tamanho e número de DLs
<ol><li>Capturar imagens: Ligue o interruptor do computador e do microscópio sucessivamente, coloque a lâmina na plataforma de carregamento, abra o software de análise de imagem (consulte Tabela de Materiais) e conecte o computador para visualizar a imagem.<ol><li>Encontre as imagens em baixa potência e pinge uma quantidade apropriada de óleo de cedro na lâmina de imagem. Ajuste o fator de observação para 100x, defina a exposição automática e capture as imagens ajustando o campo de visão apropriado. Selecione três lâminas de células coradas para cada grupo para geração de imagens.</li>
	</ol></li>
	<li>Medição de diâmetro: Selecione aleatoriamente 60 LDs para cada imagem para medir os diâmetros. Após a medição de cada imagem, salve as imagens e envie os resultados da medição em uma tabela para a análise subsequente do tamanho médio e da razão de distribuição dos LDs.</li>
	<li>Medição de quantidade: Selecione três imagens para cada lâmina corada e fotografada e selecione aleatoriamente três células para medição de quantidade em cada imagem. Conte e analise o número de LDs ao redor da célula e calcule o número médio de LDs na célula.</li>
</ol>4. Observação dinâmica da fusão de DL
<ol><li>Siga as etapas de cultura de células conforme mencionado nas etapas 1.1-1.3. Quando as células crescerem até 80%, descarte o meio e enxágue com PBS, depois digeri-las com 750 μL de tripsina por 3 min. Em seguida, adicionar 750 μL do meio, centrifugar a 200 x g por 4 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Suspender as células em 1 mL de meio de cultura, contar e ajustar a concentração celular para 5 x 105 células/mL em uma placa de 35 mm. Cultura a 37 °C e 5% CO2 por 24 h.</li>
	<li>Quando as células tiverem crescido até 80%, trocar o meio para DMEM + 150 μmol/L LA por 24 h e continuar a cultura em estufa a 37 °C e 5% CO2 para acumular os LDs.</li>
	<li>Após 24 h, retirar o meio de cultura. Lavar as células aderentes com PBS e incubá-las com sonda fluorescente neutra BODIPY 493/503 de 10 μg/mL (ver Tabela de Materiais) no escuro por 30 min. Após a incubação, lavar as células na placa de cultura com PBS três vezes e adicionar DMEM + 150 μmol/L LA. NOTA: Evitar exposição à luz durante e após a coloração de 10 μg/mL de BODIPY; 1 mg/mL de BODIPY foi diluído com PBS (1:100).</li>
	<li>Coloque a placa de cultura no sulco do microscópio da estação de células vivas (ver Tabela de Materiais) para observar as mudanças dinâmicas dos LDs. Ligue a energia da estação de trabalho de células vivas de acordo com a sequência de partida e evite a luz.<ol><li>Ligue a energia, a fonte de luz de transmissão, a fonte de alimentação do microscópio, a fonte de luz fluorescente da lâmpada de mercúrio, a fonte de alimentação da câmera do dispositivo acoplado à carga (CCD), a fonte de alimentação do host do computador, a válvula de CO 2 e a incubadora de CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Adicione água destilada ao sulco da plataforma de carga, garantindo que não ultrapasse a saída de ar.</li>
	<li>Ligue o computador e execute "NIS-Elements". Primeiro, encontre o campo de visão apropriado na lente objetiva 4x e, em seguida, ajuste-o para a lente objetiva 40x sucessivamente. Selecione E100 para observar a amostra no microscópio e L100 para visualizar e fotografar a amostra no computador. NOTA: E100 e L100 são botões de ajuste do microscópio na estação de trabalho da célula viva (ver Tabela de Materiais), representando a ocular e a tela do computador, respectivamente.</li>
	<li>Projete os parâmetros como canal de fluorescência (por exemplo, Ph-40x, isotiocianato de fluoresceína [FITC], obturador) e tempo de filmagem esperado para o experimento. Defina o tempo de filmagem no tempo, incluindo o tempo de intervalo de disparo de 5 min entre cada duas imagens e um tempo total de filmagem de 6 h. NOTA: A filmagem de longa duração precisa usar a função de estabilização de foco do sistema de foco perfeito (PFS). Para isso, primeiro ajuste o campo de visão e o comprimento do foco, depois clique em PFS na tela do computador e, finalmente, ajuste a espiral de foco fino.</li>
	<li>Selecione diferentes modos de canal, canal único ou todos, selecione um campo de visão diferente, clique em visualizar, ajuste o campo de visão, defina esses parâmetros e clique em iniciar execução para começar a filmar. Faça um teste por 5 minutos primeiro; Pode levar muito tempo depois que a operação é normal.</li>
	<li>Depois que a gravação for executada, escolha Arquivo > Salvar como > Salvar tipo > formato avi para exportar os dados para um vídeo no formato 'avi'. Use o formato de imagem '.nd2' para salvar o programa de dados e exportar as fotos.</li>
	<li>Para desligar a máquina, desligue-a na ordem inversa.</li>
</ol>5. Estatística e análise dos resultados
<ol><li>Analise os dados usando ANOVA unidirecional. Relate os resultados como média ± erro padrão.</li>
</ol>

Imagem de células vivas do tamanho e fusão de gotículas lipídicas usando óleo vermelho O e BODIPY

<ol><li>Fujimoto, T., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+just+fat%3A+the+structure+and+function+of+the+lipid+droplet%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Not just fat: the structure and function of the lipid droplet.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838(2011).</li>
<li>Grasselli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+potential+translational+value%3A+The+effects+of+3%2C5-L-diiodothyronine%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine.</a> Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).</li>
<li>Herdt, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruminant+adaptation+to+negative+energy+balance%3A+Influences+on+the+etiology+of+ketosis+and+fatty+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinics+of+North+America%3A+Food+Animal+Practice%22%5BJournal%5D)">Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).</li>
<li>Pino-de la Fuente, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+regulation+of+hepatic+lipid+droplet+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism.</a> Life Sciences. 298, 120522(2022).</li>
<li>O'Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mega-stokes+pyrene+ceramide+conjugates+for+STED+imaging+of+lipid+droplets+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells.</a> Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).</li>
<li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lipid+droplet+fusion+and+growth+by+CIDE+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29.+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).</li>
<li>Tütüncü Konyar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+insoluble+polysaccharides+and+neutral+lipids+in+the+developing+anthers+of+an+endangered+plant+species%2C+Pancratium+maritimum%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Systematics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum.</a> Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).</li>
<li>Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+BODIPY+%28493%2F503%29+to+visualize+intramuscular+lipid+droplets+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358(2011).</li>
<li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+neutral+lipids+by+oil+red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).</li>
<li>Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+characterization+of+intracellular+lipids+in+situ+by+Nile+Red+red%2Fyellow+emission+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio.</a> Micron. 39 (7), 819-824 (2008).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthesis+of+polarity-sensitive+fluorescent+dyes+based+on+the+BODIPY+chromophore%5BTitle%5D)+AND+%22Dyes+and+Pigments%22%5BJournal%5D)">The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore.</a> Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).</li>
<li>Rumin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+Nile+red+and+BODIPY+for+lipid+measurement+in+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, 42(2015).</li>
<li>Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+fluorescent+probes+for+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets.</a> Materials. 11 (9), 1768(2018).</li>
<li>Raboisson, D., Mounié, M., Maigné, É <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diseases%2C+reproductive+performance%2C+and+changes+in+milk+production+associated+with+subclinical+ketosis+in+dairy+cows%3A+A+meta-analysis+and+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review.</a> Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).</li>
<li>Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+elevated+nonesterified+fatty+acids+and+%CE%B2-hydroxybutyrate+concentrations+with+early+lactation+reproductive+performance+and+milk+production+in+transition+dairy+cattle+in+the+northeastern+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Associations of elevated nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States.</a> Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).</li>
<li>Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+experimental+steatosis+in+vitro%3A+hepatocyte+cell+culture+in+lipid+overload-conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62543(2021).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nonesterified+fatty+acids+on+the+synthesis+and+assembly+of+very+low+density+lipoprotein+in+bovine+hepatocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro.</a> Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).</li>
<li>Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+and+their+interactions+with+other+organelles+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937(2021).</li>
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</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Dependendo dos estados patológicos, os LDs hepáticos sofrem tremendas mudanças em seu tamanho e número. Os DLs estão amplamente presentes nas células dos hepatócitos e desempenham um papel fundamental na saúde e doençahepática18. A quantidade e o tamanho dos DLs são a base da pesquisa atual sobre a biogênese dos DLs19. O tamanho e o número de LDs para células e tecidos refletem sua capacidade de armazenar e liberar energia. As alterações dinâmicas dos GDs mantêm a estabilid...

O acúmulo de gotículas lipídicas (DL) nos hepatócitos é a característica típica da doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA), que pode evoluir para fibrose hepática e carcinoma hepatocelular. Verificou-se que a manifestação mais precoce da doença hepática gordurosa é a esteatose, caracterizada pelo acúmulo de DL no citoplasma do hepatócito1. A esteatose hepática está invariavelmente associada ao aumento do número e/ou expansão do tamanho dosDLs2. Acredita-se que os LDs sejam gerados a partir do retículo endoplasmático (RE), consistindo de triglicerídeos (TG) como núcleo, e são circundados por proteínas e fosfolipídios3. Como organela subcelular responsável pelo armazenamento de TG, os LDs apresentam características diferentes quanto ao tamanho, número, composição lipídica, proteínas e interação com outras organelas, o que afeta a homeostase energética celular4. O nível de TG correlaciona-se positivamente com o tamanho dos GDs, e um maior conteúdo intracelular de TG poderia formar maiores DLs5. Os LDs aumentam de tamanho através da síntese local de TG, incorporação lipídica no RE e fusão de múltiplos DLs6. As células (adipócitos, hepatócitos, etc.) que contêm grandes DLs têm um mecanismo especial para aumentar eficientemente o armazenamento de lipídios por fusão de DL. As mudanças dinâmicas dos LDs refletem os diferentes estados do metabolismo energético da célula. É crucial desenvolver metodologias que permitam a observação e análise das várias DLs hepáticas em células saudáveis e anormais.
Os principais corantes não fluorescentes para LDs são Sudan Black B e oil red O. Sudan Black B cora lipídios neutros, fosfolipídios e esteroides7. O óleo vermelho O é usado principalmente para coloração de LDs de músculo esquelético, cardiomiócitos, tecido hepático, células adiposas, etc8., sendo considerado uma ferramenta padrão para a detecção quantitativa de esteatose hepática em camundongos e humanos9. A mudança dinâmica dos LDs é realizada principalmente pelo tingimento por fluorescência. O vermelho do Nilo e o BODIPY são corantes lipídicos fluorescentescomumente utilizados 10,11. Comparado com o vermelho do Nilo, o BODIPY tem maior permeabilidade tecidual e liga-se melhor aos DLs12. LDs marcadas com BODIPY podem ser usadas para coloração de células vivas e colocalização com outras organelas13.
A incidência de doença hepática gordurosa é significativamente maior em ruminantes do que em monogástricos14. Durante o período de transição, as vacas leiteiras experimentam um estado de balanço energético negativo3. Grandes quantidades de ácidos graxos não esterificados (ácido palmítico, ácido oleico, ácido linoleico, etc.) são sintetizados em TGs em hepatócitos bovinos, o que leva a anormalidades funcionais hepáticas e reduz sobremaneira a qualidade dos produtos lácteos e a eficiência produtiva15. O presente estudo tem como objetivo fornecer um protocolo para analisar o tamanho e o número de DLs, bem como monitorar a dinâmica de fusão de DL. Construímos um modelo de formação de LD adicionando diferentes concentrações de ácido linoleico (LA) em hepatócitos16 e observamos as mudanças no tamanho e no número de LDs durante o processo pela coloração de LDs com óleo vermelho O. Além disso, o processo de fusão rápida dos LDs também foi observado pela coloração com BODIPY 493/503.

<table><tbody><tr><td>0,25% de tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>reagente</td></tr><tr><td>4% de paraformaldeído</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td>reagente</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>invitrogen</td><td>2295015</td><td></td></tr><tr><td>reagente Cedar óleo</td><td>Solarbio</td><td>C7140</td><td>reagente</td></tr><tr><td>câmara de contagem de</td><td></td><td></td> células <td></td></tr><tr><td>equipamento placa de cultura de células</td><td>Corning</td><td>353002</td><td>material</td></tr><tr><td>cell sens software&nbsp;</td><td>Olympus IX73</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>equipamento</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01</td><td>reagente</td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino</td><td>Gibco</td><td>2492319</td><td>reagente</td></tr><tr><td>hematoxilina</td><td>DingGuo</td><td>AR0712</td><td>reagente</td></tr> Imagem <tr><td>ver</td><td></td><td></td><td>imagem análise sodtware</td></tr><tr><td>ácido linoleico</td> Estação de Célula Viva de <td>Reagente</td> <td>Solarbio</td><td>SL8520</td></tr><tr><td></td><td>Nikon A1 HD25</td><td></td><td>equipamento</td></tr><tr><td>NIS-Elements&nbsp;</td>Equipamento vermelho <td></td><td>Olympus</td> IX73 do microscópio ótico do reagente de O Solarbio G1260 do óleo do software de Nikon <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>Penicilina &<td></td></tr><tr><td> Estreptomicina 100 vezes;</td><td>NCM Biotech</td><td>CLOOC5</td><td>reagente</td></tr><tr><td>Fosfato Tampolado</td><td>Solução salina HyClone</td><td>SH30258.01</td><td>reagente</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Equipamento Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agente de vedação</td><td>Reagente Solarbio</td><td>S2150</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação do tamanho e fusão de gotículas lipídicas em células hepáticas bovinas

Evaluation of Lipid Droplet Size and Fusion in Bovine Hepatic Cells

As gotículas lipídicas (DLs) são organelas que desempenham um papel importante no metabolismo lipídico e no armazenamento neutro de lipídios nas células. Eles estão associados a uma variedade de doenças metabólicas, como obesidade, doença hepática gordurosa e diabetes. Nas células hepáticas, os tamanhos e o número de DLs são sinais de doença hepática gordurosa. Além disso, a reação de estresse oxidativo, a autofagia celular e a apoptose são frequentemente acompanhadas por mudanças nos tamanhos e números de DLs. Como resultado, as dimensões e a quantidade de DLs são a base da pesquisa atual sobre o mecanismo de biogênese da DL. Aqui, em células hepáticas bovinas induzidas por ácidos graxos, descrevemos como usar o óleo vermelho O para corar LDs e investigar os tamanhos e números de LDs. A distribuição de tamanho dos GDs é analisada estatisticamente. O processo de fusão de pequenos LDs em grandes LDs também é observado por um sistema de imagem de células vivas. O presente trabalho fornece uma maneira de observar diretamente a tendência de mudança de tamanho dos DLs sob diferentes condições fisiológicas.

A coloração dos LDs celulares é mostrada na Figura 1. Os pontos vermelhos refletem os LDs das células, e os pontos azuis refletem os núcleos. Pode-se observar que o tamanho e o número de DLs em cada quadro são diferentes no tratamento do AL.
Com o aumento da dosagem de AL, o diâmetro médio e o número de DLs apresentaram tendência de aumento significativo, dependendo da concentração de AE (Figura 2). Como mostrado na <strong class="xfi...

O presente protocolo descreve como usar óleo vermelho O para tingir gotículas lipídicas (DLs), calcular o tamanho e o número de DLs em um modelo de hepatócitos gordurosos induzidos por ácidos graxos e usar BODIPY 493/503 para observar o processo de fusão de pequenas LDs em grandes LDs por imagem de células vivas.

Avaliação do Tamanho e Fusão de Gotículas Lipídicas em Células Hepáticas Bovinas

Lipid droplets (LDs) are organelles that play an important role in lipid metabolism and neutral lipid storage in cells. They are associated with a variety ...

Nossa pesquisa se concentra no número de gotículas lipídicas e no tamanho induzido pelo ácido linoleico em células hepáticas. Além disso, pretendemos fornecer informações sobre o mecanismo do fígado gorduroso. Avanços recentes neste campo de pesquisa, sugerem que colina, CCT alfa, estabelecida autofagia induzida, pode regular o tamanho de gotículas lipídicas em células hepáticas bovinas.Além disso, observações em estações de trabalho de células vivas mostraram que os fosfolipídios têm um efeito considerável na fusão de gotículas lipídicas. Atualmente, auxílio gênico, fluorescência, cromatografia líquida, análise ômica, cromatografia única, citometria de fluxo e outras tecnologias estão sendo usadas para agrupar a vasta pesquisa neste campo. O método experimental apresenta algumas limitações.Por exemplo, o fenômeno de campos limitados só pode ser observado para campos de gotículas lipídicas e sob um certo voo de resíduos. A coloração Oil Red O é mais conveniente, menos dispendiosa e mais amplamente utilizada para medir o tamanho aparente das gotículas lipídicas do que a coloração por fluorescência de gotículas lipídicas. É simples de operar e requer menos equipamentos.Além disso, ob

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Duas técnicas de isolamento de gotículas lipídicas celulares a partir de 1) células de levedura e 2) placentas humanas estão apresentadas. A peça central de ambos os processos é a centrifugação de gradiente de densidade, onde a camada flutuante resultante contendo as gotículas podem ser facilmente visualizadas por olho, extraiu-se, e quantificada por análise de Western Blot quanto à pureza.

Isolamento de celulares lipídicas Gotas: Duas técnicas de purificação Começando a partir de células de levedura e placentas humanas

De novo a lipogênese e oxidação do ácido β-gordo constituem vias metabólicas importantes em hepatócitos, caminhos que são perturbados em vários distúrbios metabólicos, incluindo a doença de fígado gordo. Aqui demonstramos isolamento de hepatócitos primários de rato e descrever quantificação da oxidação de ácidos graxos e β-lipogênese.

Determinação da oxidação de ácidos gordos e Lipogênese em Rato Os hepatócitos primária

gotículas lipídicas são organelos importantes para a replicação de vários agentes patogénicos, incluindo o vírus da hepatite C (HCV). Descreve-se um método para isolar gotículas lipídicas para a espectrometria de massa quantitativa de proteínas associadas; ele pode ser utilizado sob uma variedade de condições, tais como infecção por vírus, stress ambiental, ou tratamento com droga.

Isolamento de gotículas de gordura para análise quantitativa Espectrometria de Massa

Este protocolo estabelece um novo método de isolamento de gotículas lipídicas e purificação do fígado de rato, usando um kit de isolamento bem-estabelecida retículo endoplasmático.

Protocolo de isolamento gota lipídica rápida usando um Kit de isolamento organela bem estabelecidas

Neste estudo, nós descrevemos um protocolo detalhado para induzir o esteatose vesicular do fígado em pilhas diferenciadas de HepaRG com o oleato do sódio do sal do ácido gordo e empregamos métodos para a deteção e a quantificação da acumulação do lipido, incluindo anti-Stokes coerente Microscopia do espalhamento de Raman (carros), análise cytofluorimetric, mancha vermelha O do óleo, e qPCR.

Induzir e caracterizar a esteatose vesicular em células HepaRG diferenciadas

Neste artigo, demonstramos um protocolo otimizado baseado em fluorescência BODIPY 493/503 para caracterização de gotículas lipídicas em tecido hepático. Através do uso de projeções ortogonais e reconstruções 3D, o fluoróforo permite o sucesso da discriminação entre esteatose microvesicular e macrovesicular e pode representar uma abordagem complementar aos protocolos histológicos clássicos para avaliação da esteatose hepática.

Análise de Gotículas Lipídicas Coradas por Fluorescência com Reconstrução 3D para Avaliação da Esteatose Hepática

Este artigo descreve o uso de células HepG2 induzidas por ácido oleico como modelo para doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica.

Modelagem in vitro da deposição de gordura na doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica

Esse protocolo permite a visualização reprodutível de gotículas lipídicas e a dinâmica dos organelos durante a mitose usando células hepatomáticas sincronizadas.

Um método baseado em fluorescência para visualizar a dinâmica de gotículas lipídicas e organelos durante a mitose em células hepatomáticas

Hepatócitos primários proporcionar uma ferramenta valiosa para avaliar as funções bioquímicas, moleculares, e metabólicas em um sistema fisiologicamente relevante experimental. Nós descrevemos um protocolo confiável para rato em perfusão de fígado in situ, que sempre gera hepatócitos viáveis ​​até to1.0 ×...

Isolamento e cultura primária de células hepáticas de ratos

Nós desenvolvemos um ensaio de fusão de células que quantifica SNARE mediadas por eventos de fusão da membrana por expressão activada de β-galactosidase.

Análise de SNARE mediada por fusão de membrana usando um ensaio de fusão celular enzimática

Aprenda a avaliar o tamanho e a fusão de gotículas lipídicas em células hepáticas bovinas usando coloração com Oil Red O e imagem de células vivas. Este método oferece uma abordagem simples e reprodutível para analisar a dinâmica do metabolismo lipídico.

Avaliação do Tamanho e Fusão de Gotículas Lipídicas em Células Hepáticas Bovinas

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