Modelos aprimorados de lipofuscina e quantificação da capacidade de fagocitose do segmento externo em culturas epiteliais pigmentares da retina humana altamente polarizadas
April 14th, 2023
Este protocolo descreve um modelo de acúmulo de lipofuscina em culturas altamente diferenciadas e polarizadas do epitélio pigmentado da retina humana (EPR) e um ensaio melhorado de fagocitose do segmento externo (EO) para detectar o consumo/capacidade de degradação total do EPR. Esses métodos superam as limitações de modelos anteriores de lipofuscina e ensaios clássicos de fagocitose do segmento externo de perseguição de pulso.
Embora a lipofuscina se acumule universalmente no EPR com o envelhecimento, discernir sua toxicidade tem sido difícil. Aqui, desenvolvemos protocolos que nos permitem desenvolver acúmulo de lipofuscina-símile em culturas de EPR altamente polarizadas e maduras para ajudar a discernir os efeitos da lipofuscina na fisiologia do EPR. O estudo da toxicidade da lipofuscina em humanos é confundido pelo fato de que a lipofuscina diminui à medida que o EPR morre.
Modelos animais de toxicidade por lipofuscina têm apresentado resultados muito díspares. Criamos cuidadosamente modelos in vitro de acúmulo de material semelhante à lipofuscina para facilitar o estudo da toxicidade da lipofuscina. A chave para o sucesso de nossos modelos é a manutenção de culturas altamente diferenciadas enquanto induz a gênese da lipofuscina através do mesmo processo que desencadeia a lipofuscina in vivo, ou seja, a fagocitose dos segmentos externos dos fotorreceptores.
Nosso protocolo in vitro é único em que o material semelhante à lipofuscina se acumula em culturas de EPR que são altamente diferenciadas para mimetizar fielmente o EPR in vivo. Nessas circunstâncias, observamos que as culturas de EPR são altamente resistentes ao acúmulo de lipofuscina e ao efeito tóxico da lipofuscina. Além disso, no processo de determinação de fenótipos induzidos pelo acúmulo de lipofuscina-símile em nossas culturas de EPR, criamos um novo tipo de ensaio de fagocitose denominado capacidade consumptiva total.
Este ensaio nos permite determinar toda a capacidade do EPR de fagocitar segmentos externos, evitando algumas das interpretações confusas que vêm com os ensaios clássicos de fagocitose de perseguição de pulso. Estamos entusiasmados em utilizar este modelo de acúmulo de material semelhante à lipofuscina para entender melhor quais estressores do EPR podem levar a lipofuscina normalmente inerte a um papel mais patológico na morte celular do EPR.
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Visão geral
Esta pesquisa concentra-se nos efeitos do acúmulo de lipofuscina em culturas altamente diferenciadas de epitélio pigmentar da retina humana (RPE), fornecendo insights sobre a toxicidade da lipofuscina e sua relação com a fisiologia do RPE. O estudo introduz novos protocolos que melhoram o estudo dos efeitos da lipofuscina, utilizando um ensaio de fagocitose inovador para avaliar a capacidade total de consumo de segmento externo do RPE.
Componentes principais do estudo
Área de pesquisa
- Biologia celular
- Fisiologia da retina
- Degeneração retiniana relacionada à idade
Fundamentos
- O acúmulo de lipofuscina ocorre no RPE com a idade, complicando a avaliação da toxicidade.
- Modelos in vitro replicam o acúmulo semelhante à lipofuscina para estudos de toxicidade.
- Manter culturas de RPE diferenciadas é crucial para modelagem precisa.
Métodos utilizados
- Acúmulo in vitro de material semelhante à lipofuscina em culturas de RPE maduras.
- Modelos de células epiteliais do pigmento da retina humana.
- Ensaio de fagocitose de capacidade consumtiva total.
Principais resultados
- Desenvolvidas culturas de RPE altamente diferenciadas que resistem à toxicidade da lipofuscina.
- Novo ensaio permite reavaliação da eficácia da fagocitose do segmento externo.
- Identificadas condições sob as quais a lipofuscina se torna patogênica.
Conclusões
- O estudo demonstra o potencial dos modelos in vitro para estudar estressores do RPE ligados à lipofuscina.
- Os resultados contribuem para a compreensão dos mecanismos de degeneração retiniana e potenciais alvos terapêuticos.
Perguntas frequentes
Chapters in this video
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Introduction
2:42
Preparation of Photo‐Oxidized Outer Segment Tips and Fragments
6:27
Characterization of the Lipofuscin‐Like Granule Spectrum and Composition
8:26
Assessing the Effects of Lipofuscin‐Like Granules on RPE Phagocytosis: Total Consumptive Capacity
