Name: Um Método Preciso e Quantificável para Coleta de Hemolinfa de Pequenos Artrópodes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 39 s
Description: Aprenda um método preciso de coleta de hemolinfa em pequenos artrópodes usando a cigarrinha-do-arroz. Esta técnica simples e econômica permite quantificação exata para estudos de arbovírus e interações vetor-vírus.

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Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (No. 2022YFD1401700) e pela National Science Foundation of China (No. 32090013 e No. 32072385).

1. Criação de insetos
<ol><li>Elevar os PBPs utilizados neste experimento em mudas de arroz (Oryza sativa cv. Nipponbare). Plantar 20 mudas de arroz em estufa (65 mm x 200 mm) e crescer a 25 °C sob fotoperíodo de 16 h claro/8 h escuro.</li>
</ol>2. Dissecção das SBPHs para coleta de hemolinfa
<ol><li>Coloque os SBPHs em um tubo de centrífuga e coloque-os em um banho de gelo por 10-30 min. NOTA: Não coloque os SBPHs no banho de gelo por menos de 10 min, ou os insetos podem reviver.</li>
	<li>Coloque um SBPH congelado em uma lâmina de vidro (ver Tabela de Materiais) sob um estereomicroscópio (ver Tabela de Materiais) com seu abdômen voltado para cima. Ajuste o foco nas seis pernas do inseto.</li>
	<li>Prepare duas pinças de alta precisão (consulte Tabela de Materiais) com pontas ultrafinas. Use uma pinça para pressionar o corpo do inseto para mantê-lo no lugar e use a outra para puxar cuidadosamente uma das pernas do inseto. NOTA: Para insetos com uma casca dura, um bisturi oftálmico pode ser usado para cortar uma das pernas.</li>
	<li>Pressione suavemente o peito do inseto com uma pinça para fazer a hemolinfa fluir para fora através da ferida. NOTA: A hemolinfa apresenta-se como gotículas transparentes sem qualquer flocula branca visível. Descarte o lipídio se houver algum flocículo branco, que representa contaminação do corpo gorduroso.</li>
</ol>3. Coleta de hemolinfa utilizando micropipetas
<ol><li>Prepare uma micropipeta. Coloque um tubo capilar (ver Tabela de Materiais) com um volume de 1 μL no bulbo da pipeta (ver Tabela de Materiais). Para medições precisas, certifique-se de que a linha da escala esteja visível. NOTA: É necessário um pequeno orifício na parte superior da lâmpada da pipeta.</li>
	<li>Ao coletar a hemolinfa, segure o bulbo da pipeta da micropipeta e coloque o tubo capilar próximo à ferida do inseto. Coletar a hemolinfa exsudada da ferida simplesmente tocando a ponta do capilar para a hemolinfa.</li>
	<li>Bloqueie ligeiramente o pequeno orifício na parte superior do bulbo da pipeta com o dedo para interromper o processo de absorção quando o líquido dentro do tubo capilar atingir a linha de escala desejada. NOTA: Coletar uma amostra de 1 μL de hemolinfa incessante e rapidamente para evitar contaminação lipídica e tamponamento do tubo.</li>
	<li>Pressione o bulbo da pipeta para descarregar a hemolinfa coletada em 100 μL de tampão PBS (NaCl 137 mmol/L, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/L Na 2 HPO 4, 1,4 mmol/L KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4). NOTA: O tubo capilar é inserido no tampão PBS.</li>
	<li>Mudança para um novo tubo capilar ao coletar outra amostra de 1 μL de hemolinfa.</li>
</ol>4. Coloração Coomassie Blue
<ol><li>Coletar 3 amostras de hemolinfa com o mesmo volume (1 μL) de larvas de 3º estágio de acordo com os protocolos descritos na etapa 3, e descarregar a hemolinfa coletada no tampão PBS para totalizar um volume de 100 μL.</li>
	<li>Adicionar 25 μL de tampão de carga proteico 5x (250 mmol/L Tris-HCI [pH 6,8], 10% P/V SDS, 0,05% P/V Azul de Bromofenol, 50% P/V glicerol, 5% P/V β-mercaptoetanol) em 100 μL das amostras diluídas de hemolinfa e aquecer para desnaturar as proteínas.</li>
	<li>Carregar 20 μL das amostras fervidas num gel proteico SDS-PAGE a 10% (ver Tabela de Materiais) para separar as proteínas.</li>
	<li>Manchar o gel numa solução de Coomassie Blue (misturar 1 g de Coomassie Brilliant Blue R-250 com 250 ml de isopropanol, 100 ml de ácido acético glacial e 650 ml de ddH2O, e filtrar quaisquer partículas utilizando papel de filtro) durante 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, descolorir o gel durante 1 h com solução descolorante (100 ml de ácido acético, 400 mL de metanol, 500 mL de ddH2O).</li>
</ol>5. Determinação da concentração de proteínas
<ol><li>Diluir 10 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) para 5 mg/mL, 2,5 mg/mL, 1,25 mg/mL, 0,625 mg/mL e 0,3125 mg/mL com tampão PBS usando o método de diluição dupla.</li>
	<li>Aspirar 5 μL de tampão PBS e cada concentração de soluções BSA na etapa 5.1, adicionar 1 mL de 1x reagente corante Bradford (ver Tabela de Materiais) e incubar por 5 min à temperatura ambiente. Use buffer PBS no reagente de corante Bradford como controle, e zero em OD = 595 nm. Meça os valores de absorbância de cada uma das concentrações de proteína restantes e faça uma curva padrão.</li>
	<li>Adicionar 1 μL de hemolinfa de SBPHs larvais, fêmeas ou machos em 100 μL de tampão PBS e, em seguida, centrifugar as amostras a 1.000 x g por 10 min a 4 °C para remover os hemócitos.</li>
	<li>Aspirar 90 μL de sobrenadante para um novo tubo de centrifugação e medir os valores de absorbância do sobrenadante de acordo com as instruções do passo 5.2.</li>
	<li>Calcular as concentrações proteicas das amostras de hemolinfa de acordo com a equação de regressão da curva padrão. Incluir três réplicas biológicas com três réplicas técnicas nos experimentos.</li>
</ol>6. Detecções microscópicas
<ol><li>Use micropipetas para coletar hemolinfa de 10-15 SBPHs em diferentes estágios de desenvolvimento. Adicionar a hemolinfa coletada em um tubo contendo 20 μL de solução de paraformaldeído a 4% (ver Tabela de Materiais). Incubar a mistura à temperatura ambiente por 30 min para fixar a hemolinfa.</li>
	<li>Pipetar 20 μL de hemócitos fixos para o centro de uma lâmina revestida com silano (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Seque a gota em uma prateleira de secagem de lâmina. OBS: Evite secagem excessiva.</li>
	<li>Cobrir a amostra com o reagente antifade de ouro 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (ver Tabela de Materiais) e inspecionar a lâmina sob um microscópio invertido (ver Tabela de Materiais).</li>
</ol>7. Quantificação celular
<ol><li>Coletar 1 μL de hemolinfa das SBPHs com uma micropipeta e dissolvê-la em 20 μL de tampão PBS.</li>
	<li>Diluir as amostras de hemolinfa cinco vezes com tampão PBS.</li>
	<li>Pipetar 20 μL de solução de hemolinfa para o centro da câmara de contagem de células (ver Tabela de Materiais). Cubra a gota com uma lamínula (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Contar as células nos cinco quadrados da câmara de contagem de células (Figura 1 Suplementar), em microscópio invertido (ver Tabela de Materiais). Incluir três réplicas biológicas com três réplicas técnicas em cada um dos experimentos. Células/μL = contagem total de cinco quadrados médios × fator de diluição de 5 × × 104</li>
</ol>8. Análise estatística
<ol><li>Realizar análises estatísticas com o software correspondente (ver Tabela de Materiais). Crie um novo arquivo, selecione a coluna, importe os dados e gere um gráfico de dispersão com uma barra.</li>
	<li>Calcule a média e o DP para cada grupo de dados usando estatísticas de coluna e use uma ferramenta ANOVA unidirecional para avaliar a significância das diferenças entre os grupos. Determinar a média e o DP a partir de três réplicas biológicas com três experimentos independentes.</li>
</ol>

Coletando hemolinfa de pequenos artrópodes

<ol><li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li>
<li>Ray, S., Casteel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector-mediated+plant-virus-vector+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Effector-mediated plant-virus-vector interactions.</a> Plant Cell. 34 (5), 1514-1531 (2022).</li>
<li>Islam, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-insect+vector-virus+interactions+under+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Plant-insect vector-virus interactions under environmental change.</a> Science of the Total Environment. 701, 135044(2020).</li>
<li>Cory, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+virus+transmission%3A+Different+routes+to+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Insect virus transmission: Different routes to persistence.</a> Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).</li>
<li>Wang, X. W., Blanc, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+transmission+of+plant+single-stranded+DNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses.</a> Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).</li>
<li>Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+antimicrobial+peptides+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Insect antimicrobial peptides and their applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).</li>
<li>Liu, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+interaction+between+a+plant+virus+and+its+vector+insect+reveals+new+functions+of+hemipteran+cuticular+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).</li>
<li>Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bee+hemolymph+metabolome%3A+A+window+into+the+impact+of+viruses+on+bumble+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees.</a> Viruses. 13 (4), 600(2021).</li>
<li>Jia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+mediated+transmission+of+persistently+transmitted+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses.</a> Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).</li>
<li>Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+and+vertical+transmission+of+West+Nile+Virus+by+Aedes+vexans+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).</li>
<li>Gadhave, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+frequency+of+horizontal+and+vertical+transmission+of+cucurbit+leaf+crumple+virus+in+whitefly+Bemisia+tabaci+Gennadius%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius.</a> Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).</li>
<li>Logan, R. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+and+horizontal+transmission+of+cell+fusing+agent+virus+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti.</a> Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222(2022).</li>
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<li>Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+dengue+virus+circumvents+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">How dengue virus circumvents innate immunity.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2860(2018).</li>
<li>Gilliam, M., Shimanuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+of+hemolymph+of+the+larval+honey+bee+%28Apis+mellifera+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L).</a> Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).</li>
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<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant+virus+ensures+viral+stability+in+the+hemolymph+of+vector+insects+through+suppressing+prophenoloxidase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation.</a> mBio. 11 (4), e01453(2020).</li>
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</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

A hemolinfa é o meio do sistema circulatório nos artrópodes, e os arbovírus só podem invadir outros tecidos dos artrópodes se forem capazes de sobreviver ao ambiente hostil da hemolinfa. A coleta de uma amostra de hemolinfa de alta qualidade é o primeiro passo para estudar as interações vetor-vírus que ocorrem na hemolinfa. Tem sido relatado que a hemolinfa do inseto pode ser obtida de vários locais do corpo do inseto, incluindo uma ferida na perna dianteira, uma pequena incisão na área da cabeça ou uma ferida lacrimal n...

Tanto os vírus animais quanto os vegetais podem ser transmitidos por artrópodes, e esses vírus representam uma grave ameaça à saúde humana e causam enormes perdas econômicas na agricultura 1,2,3. É importante ressaltar que a hemolinfa dos artrópodes, que serve como sistema circulatório e um elemento vital do sistema imunológico nos artrópodes, desempenha um papel importante na regulação da transmissão das arbovirais. Os vírus adquiridos através do intestino dos artrópodes são transportados para outros tecidos somente após escaparem com sucesso do ambiente adverso da hemolinfa 4,5,6,7. O ciclo de vida dos vírus na hemolinfa dos artrópodes envolve a sobrevivência do vírus no plasma fluido, a entrada no hemócito e o transporte para outros tecidos, e vários mecanismos de interação vírus-vetor ocorrem na hemolinfa 8,9,10,11,12. Por exemplo, a transmissão vertical do VSR pelo SBPH é dependente de uma interação molecular entre a proteína vitelogenina SBPH e a proteína capsídeo do VSR (rice stripe virus)13,14. Alguns vírus podem escapar da resposta imune da hemolinfa ligando-se a fatores vetoriais específicos15,16,17,18. Portanto, investigar as interações vetor-vírus na hemolinfa de artrópodes é importante para o melhor entendimento da transmissão de arbovírus.
A hemolinfa de alguns pequenos insetos, como cigarrinhas, cigarrinhas e alguns mosquitos, é difícil de coletar devido ao seu tamanho. Para resolver essa questão, vários métodos foram desenvolvidos para coletar hemolinfa, incluindo a inserção de uma agulha de seringa diretamente no corpo do inseto para extrair um microvolume da hemolinfa, coleta de exsudato do local da ferida com pinça de ponta fina e centrifugação direta. Esses métodos têm possibilitado a mensuração dos níveis relativos de expressão gênica e dos títulos virais dentro da hemolinfa 19,20,21. No entanto, um método eficaz para quantificar o volume da hemolinfa, necessário para contagem de hemócitos, quantificação de proteínas e análise da atividade enzimática, não está atualmente disponível para esses pequenos insetos.
O SBPH (pequena cigarrinha marrom) é um tipo de pequeno inseto vetor com um comprimento do corpo de cerca de 2-4 mm. O SBPH é capaz de transmitir uma variedade de vírus de plantas, incluindo o VSR, o vírus da anã áspera do milho e o vírus da anã estriada preta do arroz22,23,24. A interação entre o SBPH e o VSR tem sido estudada em profundidade na última década. Para facilitar o trabalho com SBPHs, desenvolvemos um método novo e simples de coleta de hemolinfa. Este método, que se baseia no princípio das forças capilares, utiliza um capilar com uma marca de escala para adquirir a hemolinfa do inseto de forma precisa e quantificável. Isso nos permite coletar um volume específico de hemolinfa de pequenos insetos de forma eficiente e estudar o ambiente da hemolinfa de pequenos vetores com mais detalhes.

<table><tbody><tr><td>10% de gel de proteína SDS-PAGE</td><td>Bio-rad</td><td>4561035</td><td>Separação e detecção</td></tr><tr><td>de proteínas 4% de paraformaldeído</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td>Para fixação das células ou tecidos&nbsp;</td></tr><tr><td>Reagente corante Bradford</td><td>Bio-rad</td><td>5000205</td><td>Detecção da concentração de proteínas</td></tr><tr><td>Capilar</td><td>Hirschmann</td><td>9000101</td><td>Para recolha de hemolinfa</td></tr><tr><td>Câmara de contagem de células</td><td>ACMEC</td><td>AYA0810</td><td>Contagem de hemócitos</td></tr><tr><td>Lâmina de vidro</td><td>Gitoglas</td><td>10127105A</td><td>Para segurar insectos</td></tr><tr><td>Lâmina de vidro revestida com silano</td><td>Sigma</td><td>S4651-72EA</td><td>Para a realização de amostras</td></tr><tr><td>de microscópio Reagente antidesvanecimento de ouro com DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>Coloração do núcleo</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura do microscópio</td><td>Gitoglas</td><td>10212424C</td><td>Para observação microscópica</td></tr><tr><td>Bulbo de pipeta</td><td>Hirschmann</td><td>9000101</td><td>Para coleta de hemolinfa</td></tr><tr><td>Software Prism 8.0</td><td>Software GraphPad</td><td>/</td><td>Análises estatísticas</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td> para pinças de <td>dissecação de insetos</td></tr><tr><td></td><td>Tianld</td><td>P5622</td><td>Para dissecação de insetos</td></tr><tr><td>Zeiss microscópio invertido</td><td>Zeiss</td><td>Observer Z1</td><td>Observação de hemócitos</td></tr></tbody></table>

um método preciso e quantificável para coleta de hemolinfa de pequenos artrópodes

A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods

Os artrópodes são conhecidos por transmitir uma variedade de vírus de importância médica e agrícola através de sua hemolinfa, que é essencial para a transmissão do vírus. A coleta de hemolinfa é a tecnologia básica para o estudo das interações vírus-vetor. Aqui, descrevemos um método novo e simples para a coleta quantitativa de hemolinfa de pequenos artrópodes usando Laodelphax striatellus (a cigarrinha marrom pequena, SBPH) como modelo de pesquisa, já que este artrópode é o principal vetor do vírus da listra de arroz (VSR). Neste protocolo, o processo começa beliscando suavemente uma perna do artrópode congelado com pinças de ponta fina e pressionando a hemolinfa para fora da ferida. Em seguida, uma micropipeta simples composta por um capilar e um bulbo de pipeta é usada para coletar a hemolinfa transudativa da ferida de acordo com o princípio das forças capilares. Finalmente, a hemolinfa coletada pode ser dissolvida em um tampão específico para estudo posterior. Este novo método de coleta de hemolinfa de pequenos artrópodes é uma ferramenta útil e eficiente para futuras pesquisas sobre arbovírus e interações vetor-vírus.

Modelo de micropipeta e coleta de hemolinfa Desenvolvemos uma micropipeta simples cuja ação é baseada nas forças capilares do tubo capilar. A micropipeta é composta por um tubo capilar e um bulbo de pipeta (Figura 1A). Os tubos capilares estão disponíveis em diferentes tamanhos de volume, variando de 1 μL a 20 μL, e os volumes dos tubos capilares são selecionados de acordo com as necessidades. Tubos capilares com volumes menores não são sugeridos, pois as aberturas extraf...

Descrevemos um método para coletar hemolinfa quantificável eficientemente de pequenos artrópodes para posterior análise.

Um Método Preciso e Quantificável para Coleta de Hemolinfa de Pequenos Artrópodes

Arthropods are known to transmit a variety of viruses of medical and agricultural importance through their hemolymph, which is essential for virus ...

Nossa pesquisa se concentra em arbovírus, insetos e interações com plantas. A obtenção de amostras de hemolinfa de pequenos artrópodes representa um desafio técnico para a pesquisa de doenças transmitidas por insetos. Este protocolo mostra uma técnica precisa e quantificável para combater essa questão.Recentes desenvolvimentos de pesquisa na transmissão de arbovírus descobriram que os vírus podem manipular vários fatores vetoriais importantes para romper a barreira do hospedeiro. Este protocolo é uma técnica simples, custo-efetiva e valiosa que permite a quantificação precisa da hemolinfa. Este método também oferece tecnologia valiosa para iniciar as interações entre vírus e vetores.Nossa pesquisa futura se concentrará na compreensão dos mecanismos moleculares de transmissão de vírus por insetos vetores, enquanto explora e aprimora novas técnicas operacionais.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O caranguejo-ferradura americano, Limulus polyphemus, é sem dúvida a fonte mais conveniente para grandes quantidades de sangue de invertebrados. O sangue é simples na composição, com apenas um tipo celular na circulação geral, o Amebocyte granular, e apenas três proteínas abundante no plasma, hemocianina, as proteínas C-reativa e α2-macroglobulina. O sangue é coletado a partir do coração e as células de sangue e plasma são separados por centrifugação.

Coleta de sangue do caranguejo em ferradura americano, Limulus Polyphemus

Sinalização da insulina conservada caminhos encontrados na mosca da...

Injeção de insulina e Extração de hemolinfa para medir a sensibilidade à insulina em adultos Drosophila melanogaster</em

A simplificada ainda método preciso para coletar e mancha hemócitos mosquito é descrito. Nosso método combina a simplicidade de perfusão com a precisão das técnicas de injecção de alta para isolar os preparativos limpa de hemócitos em mosquitos Aedes. Este método facilita os estudos que exigem conhecimento dos tipos de hemócitos e sua abundância.

Um Protocolo de Coleta e coloração Hemócitos do mosquito da febre amarela Aedes aegypti</em

Hemócitos de insetos realizar muitas funções importantes, tanto imunes e não-imunes, em todas as fases do desenvolvimento do inseto. Nosso conhecimento atual de tipos de hemócitos e função vem de estudos sobre insetos modelos genéticos. Aqui, apresentamos um método para extrair, quantificar e visualizar hemócitos de lagartas selvagens.

Um protocolo simples para extrair Hemócitos de Lagartas selvagens

A hemolinfa da Drosophila serve como sangue e fluido intersticial, circulando por todo o corpo durante os estágios larva e adulto. Este vídeo descreve um protocolo de coleta de hemolinfa larval para quantificar as células circulantes.

Ruptura da cutícula: um método para coletar hemolinfa de larvas de Drosophila

Este vídeo demonstra o ensaio de distúrbio de hemócitos, avaliando a readesão de hemócitos nas bolsas hematopoiéticas de larvas de Drosophila. O distúrbio mecânico libera hemócitos residentes, elevando a contagem de hemócitos circulantes. Após a recuperação, a readesão dos hemócitos residentes é confirmada, ilustrando a reversibilidade.

Um ensaio de distúrbio de hemócitos para avaliar a readesão de hemócitos a bolsas hematopoiéticas

As células sanguíneas de Drosophila, ou hemócitos, circulam entre os locais residentes e a circulação.  Na larva, os hemócitos residentes (sésseis) localizam-se em microambientes indutivos, as bolsas hematopoiéticas, enquanto os hemócitos circulantes se movem livremente na hemolinfa. O objetivo deste protocolo é o isolamento e quantificação padronizados dessas duas populações de hemócitos comportamentalmente distintas, mas intercambiáveis.

Ensaiando populações de células do sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Sistemas hematopoiéticas de mamífero Drosophila e compartilham muitas características comuns, tornando Drosophila um modelo genético atraente para estudar hematopoiese. Aqui demonstramos dissecção e montagem do principal órgão hematopoiético larval para imuno-histoquímica. Descrevemos também métodos para ensaiar vários compartimentos hematopoiéticos larvais incluindo hemócitos circulantes e células de cristal sésseis.

Métodos para examinar a linfa Gland e Hemócitos em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Este método demonstra como visualizar a invasão do patógeno em células de inseto com modelos tridimensionais (3D). Hemócitos de larvas de Drosophila foram infectados com patógenos virais ou bacterianos, ou ex vivo ou no vivo. Hemócitos infectados foram, em seguida, fixa e manchados para a imagem latente com um microscópio confocal e subsequente reconstrução celular 3D.

Extração de hemócitos de larvas de Drosophila melanogaster para infecção microbiana e análise

A análise da hemolinfa de carrapato representa uma importante fonte de informações sobre como alguns patógenos causam doenças e como os carrapatos respondem imunologicamente a essa infecção. O presente estudo demonstra como inocular propágulos fúngicos e coletar hemolinfas de fêmeas de Rhipicephalus MICROPLUS ingurgizadas.

Divulgando a coleta de Hemolinfas e a inoculação de blastósporos de Metarhizium em carrapatos de Rhipicephalus MICROPLUS para estudos de patologia de invertebrados

Este protocolo descreve um ensaio in vivo da fagocitose utilizado para avaliar e quantificar a capacidade dos hemócitos de melanogaster de Drosophila jovens e envelhecidos para bactérias fagocitose..

Avaliando a Habilidade Fagocítica Específica da Idade dos Hemócitos de Melanogaster Drosophila Adulto usando um Ensaio de Faagocitose In Vivo

Aprenda um método preciso de coleta de hemolinfa em pequenos artrópodes usando a cigarrinha-do-arroz. Esta técnica simples e econômica permite quantificação exata para estudos de arbovírus e interações vetor-vírus.

Um Método Preciso e Quantificável para Coleta de Hemolinfa de Pequenos Artrópodes

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