Name: Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Aprenda o isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal de tecido adiposo branco murino usando um dissociador de tecido. Este protocolo melhora a reprodutibilidade para diferenciação de adipócitos em pesquisa metabólica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer a Takahito Wada e Saiko Yoshida (Universidade de Tóquio, Tóquio, Japão) por sua assistência experimental. Este trabalho foi financiado pelas seguintes bolsas para Y.H.: bolsa de pesquisa do Programa de Jovens Pesquisadores Excelentes da Universidade de Tóquio; Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, bolsa número 19K17976; bolsa para o Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) da Japan Foundation for Applied Enzymology, bolsa número 17F005; bolsa da Fundação de Pesquisa Farmacológica; bolsa da Fundação Memorial Mochida para Pesquisa Médica e Farmacêutica; bolsa da MSD Life Science Foundation; bolsa da Daiwa Securities Health Foundation; bolsa da Fundação de Pesquisa Bioquímica de Tóquio; Bolsa de Pesquisa em Ciências da Vida da Takeda Science Foundation; e bolsa da SENSHIN Medical Research Foundation.

Todos os experimentos com animais descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Tóquio e realizados de acordo com as diretrizes institucionais da Universidade de Tóquio.
1. Preparação da solução enzimática e do meio
<ol><li>Colocar ambos os lados do tecido adiposo branco inguinal (lado direito e esquerdo, aproximadamente 150 mg) de um camundongo de 7-8 semanas de idade e 2,5 mL de solução enzimática no tubo C do dissociador.</li>
	<li>Reconstituir a Enzima D com 3 mL de meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 sem soro fetal bovino (SFB) ou antibióticos, a Enzima R com 2,7 mL de DMEM/F12 sem SFB ou antibióticos e a Enzima A com 1 mL de tampão A.</li>
	<li>Preparar 2,5 mL de solução enzimática adicionando 100 μL de Enzima D, 50 μL de Enzima R, 12,5 μL de Enzima A e 2,35 mL de DMEM/F12 sem SFB ou antibióticos no tubo C. Coloque o tubo C com solução enzimática no gelo.</li>
</ol>2. Isolamento do tecido adiposo
<ol><li>Eutanásia de camundongos C57BL/6J machos de 7-8 semanas de idade (aproximadamente 20 g) por deslocamento cervical.</li>
	<li>Em um banco limpo, para isolar o tecido adiposo branco inguinal, corte a pele com tesoura romba/afiada no abdômen e em direção aos membros inferiores. Isole o tecido adiposo do interior das coxas usando uma tesoura afiada. Um lado do tecido adiposo inguinal wieghs ~75 mg.</li>
	<li>Coloque o tecido adiposo isolado no tubo C com solução enzimática sobre gelo e mantenha o tubo dentro da bancada limpa para manter a esterilidade.</li>
</ol>3. Picagem e digestão do tecido adiposo
<ol><li>No banco limpo, adicionar 2,5 mL de solução enzimática ao tubo C.</li>
	<li>Pique o tecido adiposo em pequenos pedaços cortando com tesoura afiada/afiada 50 vezes. Corte o tecido adiposo em ~2 mm2 pedaços.</li>
	<li>Feche firmemente a tampa do tubo C, vire o tubo de cabeça para baixo e prenda-o à manga do dissociador de tecido com a tampa. Em seguida, digerir a amostra por ~40 min a 37 °C. NOTA: Este estudo utilizou o suave MACS Octo Dissociator with Heaters (Miltenyi Biotec 130-096-427), e o programa pré-instalado "37C_mr_ATDK_1" foi seguido.</li>
</ol>4. Filtração da suspensão celular
<ol><li>DMEM/F12 pré-aquecido contendo 10% de SFB e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C.</li>
	<li>Retirar o tubo C do dissociador tecidual e interromper a digestão adicionando 5 mL de DMEM/F12 contendo 10% de SFB e 1% de penicilina-estreptomicina e pipetando suavemente quatro vezes.</li>
	<li>Centrifugar a 700 x g durante 10 min a 20 °C.</li>
	<li>Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular.</li>
	<li>Ressuspender o pellet adicionando 10 mL de DMEM/F12 contendo FBS a 10% e penicilina-estreptomicina a 1% e pipetando suavemente cinco vezes.</li>
	<li>Filtrar a suspensão celular através de um filtro celular de 70 μm de diâmetro colocado em um novo tubo de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar a 250 x g por 5 min e ressuspender o pellet em 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).</li>
</ol>5. Revestimento celular
<ol><li>Centrifugar a 500 x g por 5 min.</li>
	<li>Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet adicionando 10 mL de DMEM/F12 contendo FBS a 10% e penicilina-estreptomicina a 1% e pipetando dez vezes.</li>
	<li>Colocar a suspensão celular em uma placa revestida com colágeno de 10 cm e colocar as placas em uma incubadora de cultura celular (37 °C, 5% CO 2) por1-2 h. NOTA: Pratos revestidos de colágeno não são absolutamente necessários. No entanto, com base na experiência, as placas revestidas de colágeno ajudam na aderência dos pré-adipócitos e, assim, aumentam a sobrevivência das células.</li>
	<li>Aspirar o meio e lavar as células duas vezes com 3 mL de PBS por lavagem.</li>
	<li>Adicionar 10 mL de DMEM/F12 contendo FBS a 10% e penicilina-estreptomicina a 1% e retornar os pratos à incubadora de cultura celular (37 °C, 5% CO2).</li>
</ol>6. Passagem de pré-adipócitos
<ol><li>No dia seguinte, aspirar o meio (as células estarão aderentes e, portanto, o meio poderá ser aspirado), lavar as células duas vezes com 3 mL de PBS por lavagem e adicionar 10 mL de DMEM/F12 contendo FBS a 10% e penicilina-estreptomicina a 1%.</li>
	<li>Quando as células atingem 80% de confluência (geralmente 4 dias após o isolamento da FVS), dividem-se as células em quatro placas revestidas de colágeno de 10 cm.<ol><li>Especificamente, aspirar o meio, lavar as células com PBS (temperatura ambiente [TR]), adicionar 1 mL de tripsina 0,05% pré-aquecida e incubar por 5 min na incubadora de cultura celular.</li>
		<li>Adicionar 10 mL de DMEM/F12 contendo FBS a 10% e penicilina-estreptomicina a 1% para apagar a atividade da tripsina. Após a pipetagem, centrifugar a 440 x g por 5 min.</li>
		<li>Aspirar o sobrenadante, ressuspender as células adicionando 40 mL de DMEM/F12 contendo FBS a 10% e penicilina-estreptomicina a 1% e plaquear as células em quatro placas revestidas com colágeno de 10 cm.</li>
	</ol></li>
	<li>Passar as células novamente quando elas atingirem 80% de confluência.</li>
</ol>7. Preparação do retrovírus expressando o antígeno T SV40 grande para imortalização de pré-adipócitos (opcional)
<ol><li>Pelo menos 3 dias antes da imortalização, a placa Platinum-E (Plat-E) embala as células29 a uma densidade de 3,0 x 105 células/mL em 2 mL de DMEM com SFB a 10% sem antibióticos. Use um hemacitômetro para contar as células.</li>
	<li>No dia seguinte, transfect 4 μg de pBABE-neo largeTcDNA (adicionar gene plasmid #1780) usando Lipofectamine 2000, de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Após 24 h, aspirar o meio e adicionar 2 mL de DMEM com SFB a 10% e penicilina-estreptomicina a 1%.</li>
	<li>No dia seguinte, colher o sobrenadante retroviral. O retrovírus pode ser usado para imortalização imediatamente ou armazenado a -80 °C.</li>
</ol>8. Imortalização de pré-adipócitos com antígeno T SV40 grande (opcional)
<ol><li>Passar e expandir os pré-adipócitos duas vezes após o isolamento da FVS.</li>
	<li>Plaquear as células em placas de 6 poços a uma densidade de 0,5-1,0 x 104 células/mL em 2 mL de DMEM/F12 com SFB a 10% e penicilina-estreptomicina a 1%. Use um hemacitômetro para contar as células.</li>
	<li>No dia seguinte, preparar 250 μL de retrovírus fresco ou descongelado expressando o antígeno T SV40 grande por poço das placas de 6 poços. Centrifugar a 440 x g por 5 min e colocar o sobrenadante em um tubo novo.</li>
	<li>Adicionar 750 μL de DMEM/F12 contendo 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina e 1 μL de polibreno por 250 μL de sobrenadante retroviral para tornar o vírus funcional.</li>
	<li>Aspirar o meio e adicionar 1.000 μL do retrovírus de trabalho a cada poço contendo pré-adipócitos.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de DMEM/F12 com SFB a 10% e penicilina-estreptomicina a 1% 4 h depois.</li>
	<li>No dia seguinte, separar os pré-adipócitos infectados em uma placa de 10 cm e selecionar as células infectadas com DMEM/F12 contendo SFB a 10%, penicilina-estreptomicina a 1% e neomicina a 500 μg/mL. Para monitorar a seleção de antibióticos, prepare um prato de células não infectadas com neomicina.</li>
	<li>Continue a passar as células infectadas com neomicina até que todas as células não infectadas na placa de monitoramento estejam mortas.</li>
</ol>9. Diferenciação dos adipócitos
<ol><li>Plaquear as células. Para placas de 12 poços, plaquear as células a uma densidade de 4,0 x 104 células/mL em 1 mL de DMEM/F12 contendo 10% de SFB e 1% de penicilina-estreptomicina.</li>
	<li>Quando os pré-adipócitos se tornarem confluentes (48-72 h após o plaqueamento), aspirar o meio e substituí-lo por meio de diferenciação (ver Tabela 1 para composição).</li>
	<li>No dia 2 de diferenciação (ou seja, 48 h após a indução da diferenciação), substitua o meio pelo meio de manutenção (ver Tabela 1 para composição). Depois, troque o meio de manutenção a cada 2 dias. A diferenciação terminal é alcançada no dia 7 da diferenciação.</li>
	<li>Coloração vermelha do óleo<ol><li>Para coloração de óleo vermelho, aspirar o meio e enxaguar as células com 1 mL de PBS por poço. Fixar as células adicionando 1 mL de formaldeído a 4% por poço e incubar as células por 15 min na RT.</li>
		<li>Durante a incubação, diluir a solução estoque de 0,5% de óleo vermelho o (em álcool isopropílico) para 0,3% usando ddH2O e filtrar a solução de trabalho usando um papel de filtro.</li>
		<li>Após os 15 min de incubação, retirar o formaldeído, enxaguar as células com álcool isopropílico a 60%, adicionar 1 mL de óleo filtrado vermelho o solução de trabalho e incubar por 1 h em TR.</li>
		<li>Após a incubação, lave as células com água corrente. Em seguida, observar adipócitos carregados de lipídios em microscópio invertido (aumento: objetiva de 20x e ocular de 10x).</li>
	</ol></li>
	<li>Análise da expressão de RNAm NOTA: Consulte a Tabela 2 para obter a lista de primers utilizados neste estudo.<ol><li>Aspirar o meio e adicionar 1 mL/poço de trizol ao poço.</li>
		<li>Incubar por 15 min em TR, separar as células por pipetagem e coletar as amostras em tubos de 1,5 mL. As amostras podem ser armazenadas a -80 °C até a extração do RNA.</li>
		<li>Descongelar a amostra congelada para RT, adicionar 200 μL de clorofórmio à amostra e agitar vigorosamente durante 15 s.</li>
		<li>Incubar a amostra em TR durante 3 min e, em seguida, girar a 20.000 x g durante 15 min a 4 °C.</li>
		<li>Retire cuidadosamente a fase aquosa (superior, incolor) e transfira para novos tubos. Nunca transfira a fase proteica (média, branca) ou a fase fenol/clorofórmio (fundo, rosa).</li>
		<li>Adicione lentamente um volume igual de 70% de EtOH e misture delicadamente. Não vórtice.</li>
		<li>Coloque a amostra (até 700 μL) em uma coluna de spin de RNA assentada em um tubo de coleta. Certifique-se de incluir qualquer precipitado que possa ter se formado.</li>
		<li>Gire a 9.000 x g por 30 s a 4 °C e, em seguida, descarte o fluxo.</li>
		<li>Adicionar 700 μL de tampão RW1, girar a 9.000 x g durante 30 s a 4 °C e, em seguida, eliminar o fluxo.</li>
		<li>Transfira a coluna para um novo tubo de coleta e adicione 500 μL de PSE tampão.</li>
		<li>Gire a 9.000 x g por 30 s a 4 °C e, em seguida, descarte o fluxo.</li>
		<li>Adicionar 500 μL de PSE tampão, girar a 9.000 x g durante 2 minutos a 4 °C e, em seguida, eliminar o fluxo.</li>
		<li>Transfira a coluna para um novo tubo de coleta e gire (colunas sem tampão) a 9.000 x g por 1-2 min a 4 °C.</li>
		<li>Transfira a coluna para um novo tubo de coleta de 1,5 mL e adicione 30 μL de água livre de RNase diretamente na membrana da coluna.</li>
		<li>Incubar a amostra em TR por 1-2 min. Em seguida, gire a 9.000 x g por 1 min a 4 °C para eluir o RNA.</li>
		<li>Verifique a concentração de RNA usando um fluoroespectrômetro. NOTA: Recomenda-se alinhar a concentração aqui.</li>
		<li>Execute a transcrição reversa usando ~200 ng de modelo de RNA. Use um kit comercial quantitativo de reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR-RT) e siga o protocolo do fabricante. Após a reação, diluir o cDNA 20 vezes para 200 μL.</li>
		<li>Adicionar 2,0 μL de cDNA, 3,0 μL de Power Sybr Green Master Mix, 0,018 μL de 100 μM de primer direto qPCR, 0,018 μL de primer reverso qPCR 100 μM e 0,96 μL de ddH2O a cada poço de uma placa de 384 poços.</li>
		<li>Execute um qPCR (segure o estágio: 50°C por 2 min e 95 °C por 2 min; Estágio de PCR: 40 ciclos de 95 °C por 15 s e 60 °C por 1 min; estágio da curva de fusão: 95 °C por 15 s, 60 °C por 1 min e 95 °C por 15 s). Use o método de curva padrão para quantificação.</li>
	</ol></li>
</ol>

Isolamento Semi-Automatizado de Tecido Adiposo Branco Murino

<ol><li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li>
<li>Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+expression+of+tumor+necrosis+factor-alpha%3A+direct+role+in+obesity-linked+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance.</a> Science. 259 (5091), 87-91 (1993).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+of+the+mouse+obese+gene+and+its+human+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue.</a> Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).</li>
<li>Kajimura, S., Saito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+in+brown+adipose+tissue+biology%3A+Molecular+control+of+brown+fat+development+and+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis.</a> Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150 (2), 366-376 (2012).</li>
<li>Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+obesity%3A+from+discovery+to+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of obesity: from discovery to biology.</a> Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).</li>
<li>Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bigger+picture+of+FTO-the+first+GWAS-identified+obesity+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene.</a> Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).</li>
<li>Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+obesity+variant-exercise+interaction+on+changes+in+body+weight+and+BMI%3A+The+Taiwan+biobank+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+activity+attenuates+the+genetic+predisposition+to+obesity+in+20%2C000+men+and+women+from+EPIC-Norfolk+prospective+population+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study.</a> PLoS Medicine. 7 (8), e1000332(2010).</li>
<li>Claussnitzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+obesity+variant+circuitry+and+adipocyte+browning+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).</li>
<li>Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+adipogenesis+in+fibroblasts+by+PPAR+gamma+2%2C+a+lipid-activated+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor.</a> Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+brown+fat+determination+by+PRDM16%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16.</a> Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM16+controls+a+brown+fat%2Fskeletal+muscle+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch.</a> Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).</li>
<li>Rajakumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBF2+determines+and+maintains+brown+adipocyte+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity.</a> Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).</li>
<li>Shapira, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBF2+transcriptionally+regulates+brown+adipogenesis+via+the+histone+reader+DPF3+and+the+BAF+chromatin+remodeling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex.</a> Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).</li>
<li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFIA+co-localizes+with+PPAR%CE%B3+and+transcriptionally+controls+the+brown+fat+gene+program%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program.</a> Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).</li>
<li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFIA+differentially+controls+adipogenic+and+myogenic+gene+program+through+distinct+pathways+to+ensure+brown+and+beige+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation.</a> PLoS Genetics. 16 (9), e1009044(2020).</li>
<li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFIA+determines+the+cis-effect+of+genetic+variation+on+Ucp1+expression+in+murine+thermogenic+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes.</a> iScience. 25 (8), 104729(2022).</li>
<li>Villanueva, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+subtype-selective+recruitment+of+TLE3+or+Prdm16+by+PPAR%CE%B3+specifies+lipid+storage+versus+thermogenic+gene+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs.</a> Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).</li>
<li>Pearson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+TLE3+promotes+the+mitochondrial+program+in+beige+adipocytes+and+improves+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism.</a> Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zfp423+maintains+white+adipocyte+identity+through+suppression+of+the+beige+cell+thermogenic+gene+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program.</a> Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).</li>
<li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublines+of+mouse+3T3+cells+that+accumulate+lipid%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid.</a> Cell. 1 (3), 113-116 (1974).</li>
<li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+established+preadipose+cell+line+and+its+differentiation+in+culture+II.+Factors+affecting+the+adipose+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion.</a> Cell. 5 (1), 19-27 (1975).</li>
<li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+heritable+changes+leading+to+increased+adipose+conversion+in+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells.</a> Cell. 7 (1), 105-113 (1976).</li>
<li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige%2Fbrite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).</li>
<li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+preadipocytes+from+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e62005(2021).</li>
<li>Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+culture%3A+a+simple%2C+reproducible%2C+efficient+and+economic+technique+for+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+adipose+tissue+and+lipoaspirate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).</li>
<li>Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+freshly+isolated+human+adipose+stromal+cells+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Aesthetic+Surgery+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications.</a> Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).</li>
<li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plat-E%3A+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).</li>
<li>Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meaningful+respirometric+measurements+of+UCP1-mediated+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 56-61 (2017).</li>
<li>Hiraike, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+with+mouse+adipocytes+using+hypotonic+buffer+to+enrich+nuclear+fraction+before+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation.</a> STAR Protocols. 4 (1), 102093(2023).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
</ol>

Nenhum dos autores tem interesse financeiro concorrente relacionado a este trabalho.

Neste trabalho, descrevemos um protocolo de isolamento da FVS do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de dissociador tecidual para digestão da colagenase diminuiu a variação experimental, diminuiu o risco de contaminação e aumentou a reprodutibilidade. Embora esse procedimento seja uma etapa crítica dentro do protocolo apresentado, o processo é altamente automatizado e a otimização não é necessária. No entanto, dependendo da idade do rato e do depósi...

A biologia do tecido adiposo tem atraído cada vez mais atenção devido à crescente prevalência de obesidade e diabetes tipo 2 em todo omundo1. Os adipócitos armazenam energia em excesso na forma de gotículas lipídicas, que são liberadas após a fome. Além disso, o tecido adiposo mantém a homeostase energética sistêmica por servir como órgão endócrino e se comunicar com outros tecidos 2,3. Curiosamente, tanto o excesso de tecido adiposo (obesidade) quanto a perda adiposa (lipodistrofia) estão ligados à resistência à insulina e ao diabetes1. Os adipócitos são divididos em três tipos: branco, marrom e bege1. Os adipócitos brancos armazenam principalmente o excesso de energia na forma de lipídios, enquanto os adipócitos marrom e bege dissipam energia na forma de calor via proteína desacopladora mitocondrial-1 (Ucp1)1,4. Notavelmente, adipócitos beges (também chamados de adipócitos marrons "induzíveis") aparecem no tecido adiposo branco em resposta à estimulação fria ou simpática e exibem padrões de expressão gênica que se sobrepõem, mas são distintos daqueles adipócitos marrons "clássicos"5. Recentemente, adipócitos marrons e beges têm sido antecipados como alvos potenciais de tratamentos antiobesidade e antidiabetes que visam "aumentar a dissipação de energia" em vez de "suprimir a ingestão de energia"4. De forma favorável, o alelo de risco da variante de obesidade FTO rs1421085 em humanos, que exibe a associação mais forte com maior índice de massa corporal (IMC) entre variantes comuns6,7 e exibe várias interações gene-ambiente 8,9, é relatado para regular negativamente a diferenciação e função de adipócitos beges10. O receptor ativado por proliferadores de peroxissoma γ (PPARγ) é conhecido como um regulador transcricional mestre da adipogênese, sendo necessário e suficiente para a diferenciação dos adipócitos11. Reguladores transcricionais, como o domínio homólogo PRD1-BF1-RIZ1 contendo 16 (PRDM16), o fator 2 inicial de células b (EBF2) e o fator nuclear I-A (NFIA), são cruciais para a diferenciação e função dos adipócitos marrom e bege 12,13,14,15,16,17,18. Por outro lado, a programação gênica do adipócito branco requer reguladores transcricionais, como a proteína intensificadora do tipo transducina 3 (TLE3) e a proteína dedo de zinco 423 (ZFP423)19,20,21.
Sistemas modelo in vitro permitem a realização de estudos moleculares que visam melhorar a compreensão do(s) mecanismo(s) subjacente(s) às funções e disfunções dos adipócitos. Emboraexistam linhagens celulares de pré-adipócitos publicamente disponíveis e imortalizadas, como 3T3-L1 e 3T3-F442A22,23,24, a cultura de pré-adipócitos primários e a diferenciação em adipócitos seriam um modelo mais adequado para o estudo da adipogênese in vivo. O isolamento da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino é um método bem conhecido para a obtenção de pré-adipócitos primários25,26. No entanto, a digestão do tecido adiposo pela colagenase, comumente realizada com agitador bacteriano com cremalheira, pode resultar em variação experimental e é propensa à contaminação27,28. Aqui, descrevemos um protocolo alternativo que usa um dissociador de tecido suave de triagem celular ativada por magnetismo (MACS) para digestão de colagenase para obter um isolamento mais fácil da SVF.

<table><tbody><tr><td>Prato de 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>prato de 12 poços</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Prato de 60 mm</td><td>IWAKI</td><td>3010-060</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Dissociação de Tecido Adiposo, camundongo e rato</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-808</td><td>conteúdo: Enzima D, Enzima R, Enzima A e Tampão A</td></tr><tr><td>Filtro de células 70 &micro; m</td><td>BD falcon</td><td>#352350</td><td></td></tr><tr><td>Pratos revestidos com colágeno, 100 mm</td><td>BD</td><td>#356450</td><td></td></tr><tr><td>Pratos revestidos com colágeno, 60 mm</td><td>BD</td><td>#354401</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de revestimento de colágeno I 6 poços</td><td>IWAKI</td><td>4810-010</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Wako</td><td>041-18861</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de dissecação</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>autoclave antes do uso</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação, autoclave sem corte/afiada</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>antes</td></tr><tr><td>do uso Tesoura de dissecação, afiada/afiada</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>autoclave antes do uso</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>N/</td><td>A N/</td>A <td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Milteny Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACSOcto Dissociador com Aquecedores</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Humulin R Injeção U-100</td><td>Eli Lilly</td><td>872492</td><td></td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Sigma</td><td>I7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>Isobutilmetilxantina (IBMX)</td> <td>Sigma</td><td>17018-1G</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Neomicina Sulfato</td><td>Fujifilm</td><td>146-08871&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>pBABE-neo largeTcDNA (SV40)</td><td>Add gene</td><td>#1780</td><td></td></tr><tr><td>PBS comprimidos</td><td>Takara</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Platinum-E (Plat-E) Embalagem Retroviral Linha Celular</td><td>biolab</td><td>celular RV-101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12996-81</td><td></td></tr><tr><td>Power Sybr Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>#FSQ-201</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Wako</td><td>180-02653</td><td></td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T2877-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal do tecido adiposo branco murino usando um dissociador de tecido

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

O estudo in vitro da diferenciação de adipócitos brancos, marrons e beges permite a investigação das funções autônomas celulares dos adipócitos e seus mecanismos. Linhagens celulares de pré-adipócitos brancos imortalizadas são publicamente disponíveis e amplamente utilizadas. No entanto, a emergência de adipócitos beges no tecido adiposo branco em resposta a pistas externas é difícil de recapitular em toda a extensão usando linhagens de células de adipócitos brancos disponíveis publicamente. O isolamento da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino é comumente realizado para obtenção de pré-adipócitos primários e diferenciação de adipócitos. No entanto, a picagem e digestão manual do tecido adiposo pela colagenase pode resultar em variação experimental e é propensa à contaminação. Apresentamos um protocolo semi-automatizado modificado que utiliza um dissociador tecidual para digestão da colagenase para facilitar o isolamento da FVS, com o objetivo de reduzir a variação experimental, reduzir a contaminação e aumentar a reprodutibilidade. Os pré-adipócitos e adipócitos diferenciados obtidos podem ser utilizados para análises funcionais e mecanísticas.

Este protocolo produz adipócitos totalmente diferenciados e carregados de lipídios 7 dias após a indução da diferenciação dos adipócitos. O grau de diferenciação dos adipócitos pode ser avaliado pela coloração vermelho óleo de triglicérides e lipídios (Figura 1A), ou análise da expressão de RNAm por meio de qPCR-RT de genes de adipócitos, como o regulador mestre da adipogênese Pparg e seu alvo Fabp4 (Figura 1B). Para induzir a diferenciação in ...

Este protocolo descreve o isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de um dissociador tecidual para digestão da colagenase reduz a variação experimental e aumenta a reprodutibilidade.

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

Estamos interessados nos subtipos marrom e bege de adipócitos que dissipam energia na forma de calor, enquanto os adipócitos brancos geralmente armazenam energia, pois Nosso objetivo é desenvolver um novo tratamento para obesidade e diabetes baseado na promoção do gasto energético, em vez da supressão da ingestão de energia. Identificamos um fator de transcrição, NFI, como um regulador crítico da diferenciação de adipócitos marrons por uma análise de cromatina aberta em todo o genoma. NFI e o regulador transcricional mestre da adipogênese, PPAR-gama, co-localizam como os potenciadores específicos de gordura marrom.No processo de isolamento da fração vascular estromal do tecido adiposo de camundongos, a picagem manual e a digestão da colagenase do tecido adiposo podem levar à variabilidade experimental e contaminação. Nosso método utiliza um dissociador tecidual para digestão da colagenase, o que facilita o isolamento da FVS, reduz a variabilidade experimental e a contaminação e melhora a reprodutibilidade. Experimentos com adipócitos diferenciados individualmente são indispensáveis para pesquisas em nosso meio.Nosso protocolo ofereceria isolamento fácil e reprodutível da FS para posterior diferenciação dos adipócitos e aceleraria a pesquisa em nossa comunidade. Atualmente, estamos investigando o papel do NFI do metabolismo de todos os corpos, como peso corporal e glicose, usando modelos de ganho e perda de função em camundongos. Também exploraremos outras ativações farmacológicas de NFI para cada via a jusante em um futuro próximo.

semi-automated-isolation-stromal-vascular-fraction-from-murine-white

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra uma técnica para isolar e cultivar células-tronco derivadas do tecido adiposo do arco periaórtico murino marcadas com fluorescência (ADSCs) do tecido adiposo do arco periaórtico murino. Após o isolamento, os NCADSCs são detectados, classificados usando classificação de células ativadas por fluorescência e, posteriormente, cultivados em uma placa, promovendo a proliferação celular.

Isolando células-tronco derivadas de tecido adiposo do tecido adiposo periaórtico murino

Principais pré-adipócitos brancos isolados de tecidos adiposos brancos em ratos podem ser diferenciadas em células bege / brite. Apresentado aqui é um sistema modelo celular fiável para estudar a regulação molecular de "escurecimento" da gordura branca.

Isolamento e diferenciação de células estromais vasculares para Células Bege / Brite

Em 2001, pesquisadores da UCLA descreveu o isolamento de uma população de células-tronco adultas, chamadas células-tronco derivadas de tecido adiposo ou ASC, a partir de tecido adiposo. Este artigo descreve o isolamento de ASC de lipoaspirates usando, um protocolo de digestão enzimática manual utilizando colagenase.

Isolamento manual de células-tronco adiposo-derivadas de Lipoaspirates Humanos

O tecido adiposo (TA) é um site de ativação imune celular intensa e interação. Quase todas as células do sistema imune estão presentes em AT e as suas proporções são alteradas pela obesidade. Isolamento adequado, quantificação e caracterização de populações de células imunes são fundamentais para a compreensão do seu papel na doença immunometabolic.

Isolamento de tecido adiposo de células imunes

Apresenta-se um protocolo para isolar fragmentos microvasculares derivadas de tecido adiposo que representam unidades de vascularização promissores. Eles podem ser isolados rapidamente, não requerem processamento in vitro e, assim, pode ser utilizado para prevascularization um passo em diferentes campos da engenharia de tecidos.

Isolamento de Murino adiposo derivada de tecido microvascular Fragmentos como Vascularização Unidades para engenharia de tecidos

Tecido adiposo branco (WAT) tem deficiências críticas em seus modelos de cultura primária atual, dificultando o Desenvolvimento farmacológico e estudos metabólicos. Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um sistema de microphysiological de tecido adiposo por WAT imprensar entre lençóis de células do estroma. Essa construção fornece uma plataforma estável e adaptável para a cultura primária de WAT.

Uma plataforma de Microphysiologic para gordura humana: imprensado tecido adiposo branco

Este protocolo descreve a abordagem técnica para isolar subpopulações de células estromais adipogênicas e fibroinflamatórias de depósitos de tecido adiposo branco intra-abdominal murino (WAT) por classificação de células ativadas por fluorescência ou separação de esferas imunomagnéticas.

Isolamento de Subpopulações de Células Estromais Adipogênicas e Fibro-Inflamatórias de Depósitos Adiposos Intra-Abdominais Murinos

Este protocolo fornece um método eficiente de digestão de colagenase para isolamento de adipócitos viáveis e células da fração vascular estromal-SVF da gordura visceral humana em um único processo, incluindo metodologia para obtenção de RNA de alta qualidade a partir de adipócitos e fenotipificação de macrófagos SVF através da coloração de múltiplos marcadores ligados à membrana para análise por citometria de fluxo.

Isolamento de Adipócitos Viáveis e Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Visceral Humano Adequado para Análise de RNA e Fenotipagem de Macrófagos

Descrevemos o isolamento, a cultura e a indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da fração vascular estromal do tecido adiposo periaórtico de camundongos, permitindo o estudo da função do tecido adiposo perivascular e sua relação com as células vasculares.

Isolamento, Cultura e Indução Adipogênica de Pré-adipócitos Derivados da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Periaórtico de Camundongos

Aqui, apresentamos um método padrão para isolar eficientemente células-tronco e adipócitos derivados do adiposo, caracterizado por redução de &gt;90% no tempo de processamento, alta viabilidade celular e ampla compatibilidade.

Isolamento Eficiente de Células-Tronco e Adipócitos Derivados do Adiposo a partir do Tecido Adiposo Suíno

Aprenda o isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal de tecido adiposo branco murino usando um dissociador de tecido. Este protocolo melhora a reprodutibilidade para diferenciação de adipócitos em pesquisa metabólica.

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

Explorar mais vídeos