Name: Análise da Herança Epigenética Transgeracional em C. elegans Usando um Fluorescente Reporter e Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprenda a analisar herança epigenética transgeracional em C. elegans usando um reporter fluorescente e ChIP. Este protocolo padroniza ensaios de RNAi para investigar silenciamento gênico e modificações cromossômicas.

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Gostaríamos de agradecer aos laboratórios da comunidade de C. elegans que desenvolveram e compartilharam as ferramentas e cujo trabalho é citado neste manuscrito. Algumas cepas foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Projeto Canadian Institutes of Health Research (CIHR) para A.L.S. (PJT-175245). C.L. é apoiado por uma bolsa de pós-graduação do Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (PGS-D).

Herança epigenética e ChIP em Caenorhabditis elegans

<ol><li>Alcazar, R. M., Lin, R., Fire, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+dynamics+of+heritable+silencing+induced+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transmission dynamics of heritable silencing induced by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 180 (3), 1275-1288 (2008).</li>
<li>Ashe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+can+trigger+a+multigenerational+epigenetic+memory+in+the+germline+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">piRNAs can trigger a multigenerational epigenetic memory in the germline of C. elegans.</a> Cell. 150 (1), 88-99 (2012).</li>
<li>Buckley, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+Argonaute+promotes+multigenerational+epigenetic+inheritance+and+germline+immortality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A nuclear Argonaute promotes multigenerational epigenetic inheritance and germline immortality.</a> Nature. 489 (7416), 447-451 (2012).</li>
<li>Vastenhouw, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+silencing+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term gene silencing by RNAi.</a> Nature. 442 (7105), 882(2006).</li>
<li>Lee, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+piRNAs+mediate+the+genome-wide+surveillance+of+germline+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C. elegans piRNAs mediate the genome-wide surveillance of germline transcripts.</a> Cell. 150 (1), 78-87 (2012).</li>
<li>Luteijn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+stable+Piwi-induced+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Extremely stable Piwi-induced gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (16), 3422-3430 (2012).</li>
<li>Sapetschnig, A., Sarkies, P., Lehrbach, N. J., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+siRNAs+mediate+paramutation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tertiary siRNAs mediate paramutation in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 11 (3), e1005078(2015).</li>
<li>Shirayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+initiate+an+epigenetic+memory+of+nonself+RNA+in+the+C.+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline.</a> Cell. 150 (1), 65-77 (2012).</li>
<li>Minkina, O., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+heritable+germline+silencing+directs+somatic+silencing+at+an+endogenous+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Stable heritable germline silencing directs somatic silencing at an endogenous locus.</a> Molecular Cell. 65 (4), 659-670 (2017).</li>
<li>Seroussi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+epigenetic+regulation+by+C.+elegans+nuclear+RNA+interference+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of epigenetic regulation by C. elegans nuclear RNA interference pathways.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 127, 142-154 (2022).</li>
<li>Lev, I., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9me3+is+required+for+inheritance+of+small+RNAs+that+target+a+unique+subset+of+newly+evolved+genes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">H3K9me3 is required for inheritance of small RNAs that target a unique subset of newly evolved genes.</a> eLife. 8, e40448(2019).</li>
<li>Woodhouse, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifiers+SET-25+and+SET-32+are+required+for+establishment+but+not+long-term+maintenance+of+transgenerational+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifiers SET-25 and SET-32 are required for establishment but not long-term maintenance of transgenerational epigenetic inheritance.</a> Cell Reports. 25 (8), 2259-2272 (2018).</li>
<li>Houri-Zeevi, L., Teichman, G., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+resets+ancestral+heritable+small+RNA+responses%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Stress resets ancestral heritable small RNA responses.</a> eLife. 10, e65797(2021).</li>
<li>Houri-Ze'evi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+mechanism+determines+the+duration+of+the+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A tunable mechanism determines the duration of the transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 165 (1), 88-99 (2016).</li>
<li>Spracklin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNAi+inheritance+machinery+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The RNAi inheritance machinery of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 206 (3), 1403-1416 (2017).</li>
<li>Perales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenerational+epigenetic+inheritance+is+negatively+regulated+by+the+HERI-1+chromodomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transgenerational epigenetic inheritance is negatively regulated by the HERI-1 chromodomain protein.</a> Genetics. 210 (4), 1287-1299 (2018).</li>
<li>Shukla, A., Perales, R., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+coordinate+poly%28UG%29+tailing+to+prevent+aberrant+and+perpetual+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">piRNAs coordinate poly(UG) tailing to prevent aberrant and perpetual gene silencing.</a> Current Biology. 31 (20), 4473-4485 (2021).</li>
<li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+GeneticsWormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Reverse GeneticsWormBook: the Online Review of C. elegans Biology.</a> WormBook. , https://www.ncbi.nim.nih.gov/books/NBK19711/ (2006).</li>
<li>Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+nematodes+for+live+imaging+using+an+agarose+pad+produced+with+a+Vinyl+Record%5BTitle%5D)+AND+%22microPublication+Biology%22%5BJournal%5D)">Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a Vinyl Record.</a> microPublication Biology. 2018, (2018).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Askjaer, P., Ercan, S., Meister, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+techniques+for+the+analysis+of+chromatin+and+nuclear+organization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Modern techniques for the analysis of chromatin and nuclear organization in C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-35 (2014).</li>
<li>Gu, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+siRNA+in+Caenorhabditis+elegans+generates+a+transgenerational+sequence-targeted+histone+H3+lysine+9+methylation+footprint%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Amplification of siRNA in Caenorhabditis elegans generates a transgenerational sequence-targeted histone H3 lysine 9 methylation footprint.</a> Nature Genetics. 44 (2), 157-164 (2012).</li>
<li>Kalinava, N., Ni, J. Z., Peterman, K., Chen, E., Gu, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+the+downstream+effects+of+germline+nuclear+RNAi+reveals+that+H3K9me3+is+dispensable+for+heritable+RNAi+and+the+maintenance+of+endogenous+siRNA-mediated+transcriptional+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+%26+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Decoupling the downstream effects of germline nuclear RNAi reveals that H3K9me3 is dispensable for heritable RNAi and the maintenance of endogenous siRNA-mediated transcriptional silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Epigenetics & Chromatin. 10, 6(2017).</li>
<li>Kalinava, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+heterochromatin+factor+SET-32+plays+an+essential+role+in+transgenerational+establishment+of+nuclear+RNAi-mediated+epigenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">elegans heterochromatin factor SET-32 plays an essential role in transgenerational establishment of nuclear RNAi-mediated epigenetic silencing.</a> Cell Reports. 25 (8), 2273-2284 (2018).</li>
<li>Lev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MET-2-dependent+H3K9+methylation+suppresses+transgenerational+small+RNA+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">MET-2-dependent H3K9 methylation suppresses transgenerational small RNA inheritance.</a> Current Biology. 27 (8), 1138-1147 (2017).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), (2001).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+Argonaute+protein+promotes+the+inheritance+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic Argonaute protein promotes the inheritance of RNAi.</a> Cell Reports. 23 (8), 2482-2494 (2018).</li>
<li>Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+requirements+for+inheritance+of+RNAi+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans.</a> Science. 287 (5462), 2494-2497 (2000).</li>
<li>Houri-Zeevi, L., Korem Kohanim, Y., Antonova, O., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+rules+explain+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Three rules explain transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 182 (5), 1186-1197 (2020).</li>
<li>Burton, N. O., Burkhart, K. B., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNAi+maintains+heritable+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNAi maintains heritable gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (49), 19683-19688 (2011).</li>
<li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrde+pathway+mediates+small-RNA-directed+histone+H3+lysine+27+trimethylation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nrde pathway mediates small-RNA-directed histone H3 lysine 27 trimethylation in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 25 (18), 2398-2403 (2015).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J. M., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+coupled+to+detection+by+quantitative+real-time+PCR+to+study+transcription+factor+binding+to+DNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 3 (4), 698-709 (2008).</li>
</ol>

Todos os autores confirmam que não têm conflitos a revelar.

Nesse protocolo, o dsRNA é introduzido pela alimentação, que se tornou um método padrão em C. elegans18. Para ensaios de herança de RNAi, a abordagem alimentar fornece um método fácil para obter uma grande população de P0 2,11,12,22,23,24,25. No entanto, o tempo e a duração da exposição ao RNAi afetam a eficácia do silenciamento transgênico26, e a concentração de bactérias RNAi afeta a persistência do silenciamento hereditário de RNAi1. Portanto, bactérias RNAi padronizadas e o crescimento de vermes são importantes para obter um nível consistente de silenciamento de GFP e duração da herança. Aqui, os embriões são plaqueados em placas de RNAi para que os animais P0 sejam expostos às bactérias RNAi desde a eclosão. Abordagens alternativas têm plaqueado animais sincronizados nos estágios L1 24,27 ouL4 25 em placas RNAi-NGM. Além disso, como a fome e outros estresses afetam a manutenção da herança do RNAi13, os pratos devem ser monitorados para evitar superlotação e esgotamento da oferta de alimentos. Como alternativa para iniciar RNAi por alimentação, alguns dos estudos pioneiros de herança de RNAi de C. elegans induziram RNAi por meio de injeção de gônadas, o que proporciona maior controle da concentração de dsRNA 1,28.
Nesse protocolo, cada geração é passada como uma população com tratamento com hipoclorito alcalino, conforme descrito anteriormente 16,22,23,24. O tratamento com hipoclorito garante que a geração F1 não será contaminada com bactérias RNAi do ambiente parental22 e evita possíveis gargalos populacionais indesejados. No entanto, a passagem em massa também pode ser uma limitação, uma vez que animais individuais podem ter padrões de herança distintos 1,29. Um método alternativo para estabelecer cada geração é selecionar animais individuais 1,2,9,11,25. Essa abordagem permite o rastreamento de fenótipos dentro de linhagens e a incorporação de cruzamentos genéticos. A análise de linhagens também pode ser vantajosa para fenótipos de baixa penetrância12.
A expressão de proteínas fluorescentes é uma leitura poderosa e conveniente do silenciamento induzido por RNAi 2,3,4,12,14,15,16,25,30. Conforme descrito neste protocolo, a expressão da GFP pode ser pontuada manualmente como ON ou OFF 11,12,15,16,25. A pontuação manual pode ser refinada com a atribuição de níveis qualitativos de intensidade 3,4,14. Alternativamente, a pontuação automatizada da intensidade das imagens de microscopia 11,12,14,25,27 ou a medição da fluorescência da citometria de fluxo de animais vivos2 podem fornecer uma leitura quantitativa e de alto rendimento. No entanto, como a expressão do repórter é restrita à linha germinativa, uma ressalva das abordagens automatizadas é que elas também devem diferenciar entre animais com expressão silenciada de GFP versus animais sem linha germinativa, especialmente se o estudo incorporar mutantes com desenvolvimento germinativo anormal. Como alternativa à fluorescência da GFP, a transcrição reversa (RT)-qPCR pode ser usada para quantificar os níveis de RNAi alvo de pré-mRNA e mRNA 2,16,23,24. Esta abordagem fornece uma leitura mais direta do silenciamento, que tem como alvo o RNA, e é especialmente útil para outros alvos de RNAi onde o silenciamento não produz um fenótipo visível. Uma limitação do uso de repórteres artificiais de GFP é que sequências exógenas e endógenas são reguladas diferencialmente em RNAi transgeracional11. Estudos com alvos endógenos, como o alelo letal embrionário sensível à temperatura oma-1(zu405)1,11,16,25, devem, portanto, ser considerados como uma abordagem complementar aos repórteres de transgenes fluorescentes.
A análise de ChIP no contexto de ensaios de herança de RNAi requer comparação entre tratamentos e réplicas. Primeiro, para levar em conta as diferenças no material de partida entre as amostras, o sinal ChIP é normalizado para o sinal de entrada no mesmo locus que a 'porcentagem de entrada'. O processamento paralelo de uma histona H3 ChIP ajudará a determinar se quaisquer alterações na modificação da histona correspondem a mudanças na densidade nucleossômica. Além disso, como o ChIP é um processo de várias etapas, a eficiência pode variar entre as amostras. A seleção de loci de controle positivo e negativo apropriados é útil para avaliar e comparar a relação sinal-ruído entre amostras e experimentos. Além disso, para facilitar as comparações entre as amostras, os valores do ciclo de limiar de qPCR do DNA ChIP no alvo RNAi são frequentemente normalizados para um locus controle 3,11,15,23,30,31. Para avaliar os efeitos do tratamento com RNAi, a relação do sinal de ChIP em condições de RNAi de tratamento versus controle ou ausência de RNAi também é comparada. Uma limitação da abordagem atual é que o ChIP é realizado com animais inteiros, enquanto a resposta ao tratamento com RNAi pode ser exclusiva da linhagem germinativa. Uma abordagem para superar essa ressalva é realizar ChIP usando núcleos germinativos isolados. Considerações técnicas adicionais para otimizar a ChIP também foram amplamente discutidas em outros estudos32,33.
No geral, esta herança RNAi e protocolo ChIP fornece uma base detalhada e fácil de adaptar que pode ser integrada com outras técnicas para explorar ainda mais a regulação epigenética transgeracional. Por exemplo, bibliotecas de sequenciamento de alto rendimento podem ser construídas a partir do DNA ChIP (ChIP-seq) para uma visão mais detalhada da paisagem da cromatina tanto proximal ao alvo RNAi quanto em escala genômica.

A herança epigenética permite a transmissão de informações reguladoras de genes através de gerações e, portanto, pode permitir que o ambiente ou as experiências dos pais afetem sua progênie. Em C. elegans, o silenciamento gênico germinativo iniciado por RNA exógeno de fita dupla (dsRNA) pode ser herdado por múltiplas gerações em progênies não expostas ao gatilho original 1,2,3,4. Esse processo, denominado herança de interferência de RNA (RNAi), é um dos vários fenômenos de silenciamento epigenético relacionados em C. elegans, incluindo silenciamento multigeracional iniciado por piRNA 2,5, paramutação/RNAe (silenciamento epigenético induzido por RNA)6,7,8 e silenciamento iniciado por array de múltiplas cópias9, que têm requisitos sobrepostos, mas distintos, para pequenas máquinas de regulação de RNA e cromatina . No RNAi exógeno de C. elegans, o dsRNA é processado em pequenos RNAs interferentes (siRNAs) que atuam em um complexo com proteínas primárias de Argonauta para reconhecer seu RNAm alvo. Este alvo leva à amplificação de siRNAs secundários que se associam com Argonautas secundários para silenciar o mRNA alvo através de vias de silenciamento citoplasmático e nuclear. Para alvos de RNAi expressos em linhagem germinativa, o Argonaute HRDE-1 secundário nuclear nuclear e fatores adicionais de RNAi têm como alvo transcritos nascentes, resultando em repressão transcricional e recrutamento de histonas metiltransferases para depositar marcas repressivas de cromatina, incluindo H3K9me310. Histone H3K9me3 promove o estabelecimento do silenciamento hereditário de transgenes de proteína verde fluorescente (GFP) expressa em germinação por herança de RNAi11,12.
O objetivo deste protocolo é usar um transgene expressando uma proteína de fusão GFP-histona na linha germinativa como repórter para herança de RNAi e testar mudanças nas modificações de histonas no locus transgênico repórter usando imunoprecipitação de cromatina e reação em cadeia da polimerase quantitativa (ChIP-qPCR). Este protocolo descreve uma abordagem padronizada de alimentação de RNAi baseada em placas para iniciar o silenciamento do repórter. Também fornece uma linha do tempo detalhada para a passagem de animais entre gerações, isolando embriões in utero de adultos grávidos por tratamento com hipoclorito alcalino ('branqueamento'). Métodos e dados representativos para monitorar a frequência de silenciamento de GFP em um subgrupo da população por microscopia de fluorescência e para a histona H3K9me3 ChIP-qPCR também são descritos. Ensaios de herança de RNAi baseados em repórteres fornecem um sistema altamente tratável para dissecar funcionalmente os papéis de fatores genéticos e ambientais na regulação epigenética 13,14, e rastreios genéticos usando tais repórteres identificaram tanto genes que são necessários para 2,3,15 quanto genes que regulam negativamente16,17 a duração da herança epigenética transgeracional.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Bioshop</td><td>AMP201</td><td>Faça uma solução de 100 mg/mL em água ultrapura. Filtre-esterilize e armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal de coelho anti-H3K9me3</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td>A concentração depende do lote (0,9 - 1 mg / mL).</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal anti-histona H3 coelho</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>A concentração depende do lote (0,7 - 1 mg / mL).</td></tr><tr><td>Alvejante (6% de hipoclorito de sódio)</td><td>Lavo</td><td>02358107</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans cepa com GFP RNAi Reporter</td><td>NA</td><td>, SX1263</td>, <td>Sapetschnig et al., 2015 (ref. 7). Um presente do laboratório E. Miska, Universidade de Cambridge.</td></tr><tr><td>Carbenicilina</td><td>BioShop</td><td>CAR544</td><td>Faça uma solução de 25 mg/mL em água ultrapura. Filtre-esterilize e armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G Magnetic Beads</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>E. coli cepa HT115(DE3)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>HT115(DE3)</td><td></td></tr><tr><td>E. coli cepa OP50-1</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M, pH 8,0)</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescência Estereoscópio</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído (37%)</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td>Faça uma solução de 1,25 M e armazene a 4 °C.</td></tr><tr><td>HEPES-KOH (1 M, pH 7,5)</td>Lâminas impressas hidrofóbicas <td>Teknova</td><td>H1035</td><td></td></tr>, <tr><td>10 poços</td><td>VWR</td><td>100488-904</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (etoxilato de octilfenol)</td><td>BioShop</td><td>NON999</td><td>Faça uma solução a 10% (v/v) em água ultrapura e guarde à temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>IPTG (Isopropil-&beta;-D-tiogalactosídeo)</td><td>BioShop</td><td>IPT001</td><td>Faça uma solução de 0,2 g/mL em água ultrapura. Filtre-esterilize e armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725122</td><td></td></tr><tr><td>LB Placas de Ágar Suplementares com 100 &micro; g / mL de ampicilina</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Receita padrão de laboratório.</td></tr><tr><td>Levamisol (cloridrato de tetramisol)</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td>Faça uma solução de 200 mM em água ultrapura. Armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>LiCl (8 M)</td><td>Sigma</td><td>L7026</td><td></td></tr><tr><td>M9 Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4.</td></tr><tr><td>Separador Magnético (tubos de 1,5 mL)</td><td>Separador Magnético Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>(tubos de 0,2 mL)</td><td>Permagen</td><td>MSR812</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de Cobertura de Microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12541B</td><td></td></tr><tr><td>Tecnólogo</td> de<td>Lâminas de Microscópio</td><td>Escolha LAB-037</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5 M)</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td>Para tampões ChIP.</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td>Faça uma solução de 10 M e armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Placas NGM</td><td>NA NA</td><td></td><td>1,7% (p/v) ágar, 0,3% (p/v) NaCl, 0,25% (p/v) peptona, 1 mM CaCl2, 5 &mu; g/mL de colesterol, 25 mM de fosfato de potássio pH 6,0, 1 mM de MgSO4, 50 &micro; g/mL de estreptomicina.</td></tr><tr><td>IgG Normal de Coelho (1 mg/mL)</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>2729</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri (35 mm x 10 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Tampolado Salino (10X)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo - Controle RNAi&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>L4440 (Plasmídeo #1654)</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo - RNAi direcionado a GFP&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>L4417 (Plasmídeo # 1649)</td><td>Observe que plasmídeos alternativos derivados de L4440 direcionados à GFP podem ser usados.</td></tr><tr><td>Par de primers [-3,3 kb a montante do gfp]</td><td>Tecnologias integradas de DNA</td><td>NA</td><td>F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG</td></tr><tr><td>Par de primers [+1,3 kb a jusante do gfp]</td><td>Tecnologias integradas de DNA</td><td>NA</td><td>F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT</td></tr><tr><td>Par de primers [clec-18]</td><td>Tecnologias integradas de DNA</td><td>NA</td><td>F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA</td></tr><tr><td>Par de primers [gfp exon 1]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC</td></tr><tr><td>Primer pair [gfp exon 4]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA</td></tr><tr><td>Primer pair [hrp-2]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail Tablet</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K&nbsp;</td>Kit de Purificação <td>PCR Bioline</td><td>BIO-37084</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick&nbsp;</td>Sistema de Detecção de PCR em Tempo Real <td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>CFX96&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placas de RNAi-NGM</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1,7% (p/v) ágar, 0,3% (p/v) NaCl, 0,25% (p/v) peptona, 1 mM CaCl2, 5 &micro; g/mL de colesterol, 25 mM Tampão fosfato de potássio pH 6,0, 1 mM MgSO4, 25 &micro; g/mL de carbenicilina e 5 mM de IPTG.</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl (sal de sódio N-Lauroilsarcosina)</td><td>Sigma</td><td>L5777</td><td>Faça uma solução a 10% (p/v) e armazene em temperatura ambiente protegida da luz por no máximo 1 mês.</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>74255</td><td>Faça uma solução a 10% (p/v) e armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td>Faça uma solução a 5% (p/v) e armazene em temperatura ambiente protegida da luz por no máximo 1 mês.</td></tr><tr><td>Tubo de Sonicação</td><td>Evergreen</td><td>214-3721-010</td><td></td></tr><tr><td>Tampa do Tubo de Sonicação</td><td>Evergreen</td><td>300-2911-020</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q800R3-110</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>Bioshop</td><td>STP101</td><td>Faça uma solução de 50 mg/mL em água ultrapura. Filtre-esterilize e armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Tampão TAE (1X)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>40 mM Tris, acetato de 20 mM, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Contador de contagem clicker</td><td>Uline</td><td>H-7350</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Bioshop</td><td>TET701</td><td>Faça uma solução de 5 mg/mL em etanol e armazene a -20 °C.</td></tr><tr><td>Termomixer</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-205</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Faça uma solução a 10% (v/v) em água ultrapura e armazene em temperatura ambiente.</td></tr></tbody></table>

análise da herança epigenética transgeracional em c. elegans usando um fluorescente reporter e imunoprecipitação de cromatina (chip)

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

A herança epigenética transgeracional (TEI) permite a transmissão de informações através da linha germinativa sem alterar a sequência do genoma, através de fatores como RNAs não codificantes e modificações na cromatina. O fenômeno da herança de RNA de interferência (RNAi) no nematoide Caenorhabditis elegans é um modelo eficaz para investigar TEI que aproveita o curto ciclo de vida, autopropagação e transparência desse organismo modelo. Na herança de RNAi, a exposição dos animais ao RNAi leva ao silenciamento gênico e assinaturas alteradas de cromatina no locus alvo que persistem por várias gerações na ausência do gatilho inicial. Este protocolo descreve a análise da herança de RNAi em C. elegans usando um repórter de proteína fluorescente verde nuclear (GFP) expressa em linhagem germinativa. O silenciamento do repórter é iniciado alimentando os animais com bactérias que expressam RNA de fita dupla visando a GFP. A cada geração, os animais são passados para manter o desenvolvimento sincronizado, e o silenciamento gênico do repórter é determinado por microscopia. Em gerações selecionadas, populações são coletadas e processadas para imunoprecipitação de cromatina (ChIP)-reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) para medir o enriquecimento de modificação de histonas no locus repórter da GFP. Este protocolo para estudar a herança de RNAi pode ser facilmente modificado e combinado com outras análises para investigar fatores TEI em pequenas vias de RNA e cromatina.

Animais portadores da histona H2B da GFP expressa germinativa [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 repórter (Figura 2A) foram expostos ao RNAi da GFP ou RNAi de controle por meio da alimentação e passados conforme descrito no protocolo e na Figura 1. O sinal nuclear de GFP na linha germinativa foi manualmente marcado usando um microscópio dissecante de fluorescência para uma amostra da população em cada geração. O silenciamento do transgene foi totalmente penetrante nos animais pontuados P0 e F1 tratados com GFP RNAi (Figura 2B). Na geração F2, a proporção da população exibindo herança do silenciamento de GFP foi de aproximadamente 50%. Na geração F5, a maioria da população não apresentou herança de silenciamento e, na geração F10, nenhuma herança foi detectada, pois todos os animais expressaram GFP.
Para determinar a mudança no enriquecimento de histona H3K9me3 correspondente ao silenciamento induzido por RNAi, ChIP-qPCR foi realizada em animais da geração F1 após o tratamento com RNAi GFP ou RNAi controle. Como esperado, a população tratada com GFP RNAi exibiu níveis mais altos de histona H3K9me3 no alvo de GFP e na região a jusante de 1,3 kb em comparação com animais tratados com RNAi controle (Figura 2C). A especificidade da histona H3K9me3 ChIP é suportada pelo enriquecimento em um locus de controle positivo (clec-18) conhecido por ser enriquecido nesta marca, mas não em um locus de controle negativo próximo (hrp-2). O enriquecimento com histona H3 e o enriquecimento próximo ao fundo nas imunoprecipitações de controle de IgG também foram detectados em todos os loci de qPCR, como esperado. Quando o enriquecimento de ChIP no repórter é normalizado para o locus de controle positivo clec-18 , maior enriquecimento de histona H3K9me3 sobre o RNAi da GFP é mostrado, enquanto o enriquecimento de histona H3 é semelhante entre os tratamentos controle e RNAi da GFP (Figura 2D). Como não se espera que o RNAi da GFP afete a histona H3K9me3 ou a ocupação total da histona H3 no locus clec-18 , essa normalização atenua a variação técnica, como diferenças na eficiência de ChIP entre as amostras de RNAi da GFP e RNAi de controle. A mudança de dobra dos níveis de histona H3K9me3 e histona H3 entre os tratamentos de RNAi mostra enriquecimento de histona H3K9me3 específico para repórteres de GFP, independente da ocupação de histonas, após silenciamento induzido por RNAi de GFP (Figura 2E).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65285/65285fig02.jpg"> Figura 2: O silenciamento induzido por RNAi da GFP corresponde ao elevado enriquecimento de H3K9me3 no alvo do RNAi. (A) Diagrama do repórter de RNAi de GFP expresso em linhagem germinativa mjIs134[mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR] com regiões de amplicon de qPCR marcadas. (B) Expressão de GFP pontuada ao longo das gerações após tratamentos com RNAi a 21 °C. As barras de erro representam o desvio padrão de duas réplicas biológicas. (C) ChIP-qPCR do controle de H3K9me3, histona H3 e IgG em adultos jovens F1 de duas réplicas biológicas. clec-18 e hrp-2 são os loci de controle positivo e negativo para o enriquecimento com H3K9me3, respectivamente. (D) O enriquecimento de H3K9me3 e histona H3 no repórter de RNAi da GFP normalizou para o locus de controle positivo clec-18. (E) Alteração no enriquecimento de H3K9me3 e histona H3 entre animais tratados com RNAi de GFP e RNAi controle, com normalização para clec-18. A linha pontilhada representa uma mudança de dobra de 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65285/65285fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve um ensaio de interferência de RNA e ChIP para estudar a herança epigenética do silenciamento induzido por RNAi e modificações associadas da cromatina em C. elegans.

Análise da Herança Epigenética Transgeracional em C. elegans Usando um Fluorescente Reporter e Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...

A pesquisa em nosso laboratório examina como as proteínas associadas à cromatina, as modificações das histonas e os pequenos fatores da via do RNA trabalham juntos no contexto do desenvolvimento e da herança epigenética transgeracional. O ensaio de herança de RNA, usando um repórter GFP, tornou-se uma ferramenta muito poderosa. Este protocolo descreve como padronizar a preparação, pontuação e passagem de vermes, e a preparação de amostras de ChIP, que podem ajudar a gerar resultados reprodutíveis.Um dos desafios experimentais ao estudar transgenes expressos em germinação é isolar os efeitos na linha germinativa do animal. Atualmente, estamos usando animais inteiros para ChIP, mas no futuro gostaríamos de desenvolver ensaios para examinar a cromatina, especificamente na linha germinativa. Nosso laboratório está interessado na metilação de histonas e proteínas que reconhecem essas marcas.No futuro, gostaríamos de investigar a interação entre esses leitores de cromatina e pequenas vias de RNA no contexto da herança de RNAi em transgenes e da regulação de sequências endógenas.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Este artigo descreve uma técnica para a visualização dos eventos iniciais da embriogênese do...

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Este protocolo descreve um procedimento rápido e de baixo consumo de material para a integração de matrizes extracromossômicas transgênicas no genoma de Caenorhabditis elegans usando irradiação ultravioleta (UV). Além disso, este protocolo é particularmente adequado para linhas transgênicas que transmitem matrizes extracromossômicas em alta taxa.

Um protocolo rápido para integrar matrizes extracromossômicas com alta taxa de transmissão no genoma de C. elegans

Descrevemos as etapas detalhadas de um ensaio químico de alto rendimento no nematóide Caenorhabditis elegans usado para avaliar a toxicidade da linha germinativa. Neste ensaio, a interrupção da função germinativa após a exposição química é monitorada usando um repórter fluorescente específico para embriões aneuploides.

Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Regulamento do ambiente da cromatina é um processo essencial, necessário para a expressão do gene apropriado. Aqui, descrevemos um método para controlar a expressão do gene através do recrutamento de cromatina-modificando máquinas de forma gene-específico e reversível.

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

Este método é projetado para seguir a formação de domínios de cromatina mediada por PRC2 em linhas celulares, e o método pode ser adaptado para muitos outros sistemas.

Um método para estudar a formação de novo dos domínios da cromatina

Este trabalho descreve um protocolo semi-alta de supressão que permite imagens simultâneas de lapso de tempo 3D de embriaênese embrionária em embriões de 80-100 C. elegans em uma única corrida noturna. Além disso, as ferramentas de processamento e visualização de imagens são incluídas para simplificar a análise de dados. A combinação destes métodos com tensões personalizadas do repórter permite a monitoração detalhada do embryogenesis.

Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

A infecção da Caenorhabditis elegans pelo parasita microsporidiano Nematocida parisii permite que os vermes produzam descendentes altamente resistentes ao mesmo patógeno. Este é um exemplo de imunidade herdada, um fenômeno epigenético mal compreendido. O presente protocolo descreve o estudo da imunidade herdada em um modelo de verme geneticamente tratável.

Estudando imunidade herdada em um modelo de infecção por microsporidia

Aqui, apresentamos protocolos e ferramentas para visualizar o cálcio durante a fertilização e embriogênese inicial usando um repórter de cálcio geneticamente codificado expresso na linha germinativa do nematóide modelo C. elegans.

Visualização in vivo de transientes de cálcio durante a fertilização e desenvolvimento inicial em C. elegans

Aqui, apresentamos um protocolo ATAC-seq rápido e simples a ser implementado em um verme inteiro de estágio L4 Caenorhabditis elegans usando apenas 30 μL de pellet de verme.

Perfil de Acessibilidade por Cromatina em Larvas Plenas de Caenorhabditis elegans L4

Um fluxo de trabalho de microinjeção CRISPR/Cas9 para marcação fluorescente endógena na linha germinativa de Caenorhabditis elegans , visando obter linhas homozigotas knock-in para análise in vivo de localização de proteínas.

Marcação Endógena Fluorescente Mediada por CRISPR/Cas9 de Genes Específicos da Linhagem Germântica em Caenorhabditis elegans

Aprenda a analisar herança epigenética transgeracional em C. elegans usando um reporter fluorescente e ChIP. Este protocolo padroniza ensaios de RNAi para investigar silenciamento gênico e modificações cromossômicas.

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Análise da Herança Epigenética Transgeracional em C. elegans Usando um Fluorescente Reporter e Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP)

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