Name: Uma estrutura de código aberto para o cálculo de massa de moléculas terapêuticas baseadas em anticorpos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Aprenda a calcular massas de anticorpos monoclonais com o software mAbScale. Esta ferramenta de código aberto resolve defeitos de massa em moléculas terapêuticas grandes, melhorando a precisão no desenvolvimento de proteínas bioterapêuticas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores agradecem a Robert Schuster pela ajuda na verificação dos dados.

O fluxo de trabalho de alto nível para mAbScale é mostrado na Figura 2. Cada etapa tem ramificações de decisão internas mais sofisticadas, loops e combinatória. Um fluxo de trabalho algorítmico detalhado descrevendo o processo de cálculo é apresentado na Figura Suplementar 1. A saída do aplicativo é salva em um formato de planilha na pasta selecionada pelo usuário. O arquivo de saída consiste em várias planilhas separadas, que podem ser categorizadas como a entrada do usuário, cálculos de peso molecular e referências para as derivações de massa isotópica média (saída de exemplo é fornecida em tabelas suplementares). As planilhas de entrada do usuário incluem as sequências de aminoácidos proteicos e outras informações inseridas pelo usuário, massas elementares médias e massas glicanas, que são usadas para calcular a composição elementar e diferentes pesos moleculares. As folhas de cálculo de peso molecular incluem a composição química de várias formas, a massa reduzida com e sem glicosilação e modificação química, e a massa intacta com e sem glicosilação e modificação química. Folhas contendo massas de semianticorpos serão geradas automaticamente se o usuário inserir dois HCs diferentes e/ou dois LCs diferentes na página de entrada do usuário, uma vez que os meio-anticorpos são impurezas primárias que precisam ser identificadas e quantificadas em relação ao heterodímero desejado. O código-fonte do mAbScale pode ser acessado através do seguinte repositório: https://github.com/kkhatri99/mAbScale.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig02.jpg"> Figura 2: Visão geral das etapas envolvidas no cálculo de composições elementares e massas usando o aplicativo. A codificação de cores pode ser usada para vincular ao fluxo de processo descrito na Figura 1 Suplementar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
1. Abrindo o aplicativo mAbscale
<ol><li>Abra o aplicativo de software clicando duas vezes no ícone do arquivo executável.</li>
</ol>2. Entrada de sequência
<ol><li>Insira as sequências heavy-chain e light-chain nas respectivas caixas de texto marcadas com 1 sem espaços.<ol><li>Para bsAbs, adicione cadeias pesadas ou leves adicionais no segundo conjunto de caixas de texto marcadas como 2. Deixe 2 em branco para mAbs com correntes pesadas e correntes leves idênticas.</li>
		<li>Marque as caixas de seleção N-Terminal Cyclization e/ou C-Terminal Clipping , se essas variantes de terminal de cadeia pesada forem aplicáveis.</li>
		<li>Adicione quaisquer modificações químicas, incluindo linker e carga útil para moléculas ADC, às caixas de texto Heavy Chain Chem Mod e/ou Light Chain Chem Mod.<ol><li>Especifique modificações como composições elementares, como CaCl2. A modificação será adicionada à respectiva subunidade ou cadeia proteica. NOTA: Uma composição química também pode ser subtraída de uma subunidade ou cadeia prefixando a composição elementar com um sinal -. Por exemplo, -H2O subtrairá uma molécula de água da composição e massa da subunidade.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. Especificação do número de ligações dissulfeto
<ol><li>Especifique o número de ligações dissulfeto nas moléculas de proteína na caixa de texto marcada Número Total de Dissulfetos.</li>
	<li>Insira o número de dissulfetos de HC não reduzidos na caixa de texto Dissulfetos de HC não reduzidos e o número de dissulfetos de LC não reduzidos na caixa de texto Dissulfetos de LC não reduzidos , dependendo da extensão da redução (completa versus parcial). NOTA: A análise de massa reduzida das subunidades mAb envolve a redução/separação das cadeias pesadas e leves ligadas ao dissulfeto.</li>
	<li>Se a glicosilação estiver presente na cadeia leve mAb, marque a caixa de seleção Cadeia leve é glicosilada .</li>
</ol>4. Definindo a pasta de saída e executando o aplicativo
<ol><li>Clique no botão Procurar para selecionar uma pasta de saída para a caixa de texto Pasta de saída .</li>
	<li>Digite o nome do arquivo de saída sem uma extensão de arquivo (salva automaticamente como .xlsx) na caixa de texto Arquivo do Excel (sem ext). </li>
	<li>Clique no botão Enviar para iniciar o aplicativo. O arquivo de saída pode ser encontrado na pasta designada. NOTA: As massas elementares e a lista de glicanos podem ser personalizadas editando os arquivos de texto delimitados Element_Mass.csv (Arquivo de Codificação Suplementar 1) e Glicano.csv (Arquivo de Codificação Suplementar 2), respectivamente. Esses arquivos devem ser colocados na mesma pasta que o arquivo executável mAbScale.exe (Supplementary Coding File 3) para que o aplicativo seja executado. O aplicativo será fechado automaticamente após uma execução. O usuário terá que iniciar o aplicativo novamente se um segundo cálculo for necessário.</li>
</ol>

Uma ferramenta baseada em Python para cálculo preciso de massa de entidades bioterapêuticas

<ol><li>Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+trends+for+monoclonal+antibody+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).</li>
<li>Kintzing, J. R., Filsinger Interrante, M. V., Cochran, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+strategies+for+developing+next-generation+protein+therapeutics+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Emerging strategies for developing next-generation protein therapeutics for cancer treatment.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 37 (12), 993-1008 (2016).</li>
<li>Wang, M. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2%3A+Structure%2C+biology%2C+and+structure-based+therapeutics+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2: Structure, biology, and structure-based therapeutics development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269(2020).</li>
<li>ICH Q8 (R2) Pharmaceutical Development - Scientific Guideline. European Medicines Agency. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline">https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline</a> (2018).</li>
<li>Donnelly, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+and+benchmarks+for+intact+protein+analysis+for+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Best practices and benchmarks for intact protein analysis for top-down mass spectrometry.</a> Nature Methods. 16 (7), 587-594 (2019).</li>
<li>Gadgil, H. S., Pipes, G. D., Dillon, T. M., Treuheit, M. J., Bondarenko, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+mass+accuracy+of+high+performance+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+of+intact+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Improving mass accuracy of high performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry of intact antibodies.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 17 (6), 867-872 (2006).</li>
<li>Beck, A., Sanglier-Cianférani, S., Van Dorsselaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosimilar%2C+biobetter%2C+and+next+generation+antibody+characterization+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biosimilar, biobetter, and next generation antibody characterization by mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4637-4646 (2012).</li>
<li>Camperi, J., Goyon, A., Guillarme, D., Zhang, K., Stella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-dimensional+LC-MS%3A+the+next+generation+characterization+of+antibody-based+therapeutics+by+unified+online+bottom-up%2C+middle-up+and+intact+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Multi-dimensional LC-MS: the next generation characterization of antibody-based therapeutics by unified online bottom-up, middle-up and intact approaches.</a> Analyst. 146 (3), 747-769 (2021).</li>
<li>Liu, H., May, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide+bond+structures+of+IgG+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Disulfide bond structures of IgG molecules.</a> mAbs. 4 (1), 17-23 (2012).</li>
<li>Jakes, C., Füssl, F., Zaborowska, I., Bones, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+biotherapeutics+using+protein+a+chromatography+coupled+to+orbitrap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of biotherapeutics using protein a chromatography coupled to orbitrap mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (40), 13505-13512 (2021).</li>
<li>Robotham, A. C., Kelly, J. F. Chapter 1 - LC-MS characterization of antibody-based therapeutics: Recent highlights and future prospects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobotham%2C+AC+%22Approaches+to+the+Purification%2C+Analysis+and+Characterization+of+Antibody-Based+Therapeutics%22">Approaches to the Purification, Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics</a>. Matte, A. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 1-33 (2020).</li>
<li>Valeja, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+mass+baseline+resolution+for+an+intact+148+kDa+therapeutic+monoclonal+antibody+by+fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Unit mass baseline resolution for an intact 148 kDa therapeutic monoclonal antibody by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8391-8395 (2011).</li>
<li>Fornelli, L., Ayoub, D., Aizikov, K., Beck, A., Tsybin, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle-down+analysis+of+monoclonal+antibodies+with+electron+transfer+dissociation+orbitrap+fourier+transform+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Middle-down analysis of monoclonal antibodies with electron transfer dissociation orbitrap fourier transform mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (6), 3005-3012 (2014).</li>
<li>Berglund, M., Wieser, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+compositions+of+the+elements+2009+%28IUPAC+Technical+Report%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pure+and+Applied+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isotopic compositions of the elements 2009 (IUPAC Technical Report).</a> Pure and Applied Chemistry. 83 (2), 397-410 (2011).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ame2012+atomic+mass+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Physics+C%22%5BJournal%5D)">The Ame2012 atomic mass evaluation.</a> Chinese Physics C. 36 (12), 1603-2014 (2012).</li>
<li>Peri, S., Steen, H., Pandey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPMAW--A+software+tool+for+analyzing+proteins+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">GPMAW--A software tool for analyzing proteins and peptides.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (11), 687-689 (2001).</li>
<li>Tipton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+intact+protein+isoforms+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (29), 25451-25458 (2011).</li>
<li>De Leoz, M. L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interlaboratory+study+on+glycosylation+analysis+of+monoclonal+antibodies%3A+Comparison+of+results+from+diverse+analytical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">interlaboratory study on glycosylation analysis of monoclonal antibodies: Comparison of results from diverse analytical methods.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 19 (1), 11-30 (2020).</li>
<li>Cymer, F., Beck, H., Rohde, A., Reusch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+monoclonal+antibody+N-glycosylation+-+Structure%2C+function+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Therapeutic monoclonal antibody N-glycosylation - Structure, function and therapeutic potential.</a> Biologicals. 52, 1-11 (2018).</li>
<li>Baker, P. R., Trinidad, J. C., Chalkley, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+site+localization+scoring+integrated+into+a+search+engine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Modification site localization scoring integrated into a search engine.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 10 (7), (2011).</li>
<li>Chalkley, R. J., Clauser, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+site+localization+scoring%3A+Strategies+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Modification site localization scoring: Strategies and performance.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (5), 3-14 (2012).</li>
</ol>

Este software está sendo lançado sob a licença Apache 2.0. Direitos autorais (2022) da GlaxoSmithKline Research &Development Limited. Todos os direitos reservados. Licenciado sob a Licença Apache, Versão 2.0 (a "Licença"); você não pode usar este arquivo, exceto em conformidade com a Licença. Você pode obter uma cópia da Licença em http://www.apache.org/licenses/LICENSE-2.0. A menos que exigido pela lei aplicável ou acordado por escrito, o software distribuído sob a Licença é distribuído "no estado em que se encontra", sem garantias ou condições de qualquer tipo, expressas ou implícitas. Consulte a Licença para o idioma específico que rege as permissões e limitações sob a Licença. L.C. é funcionário da GlaxoSmithKline (GSK). T.H. e K.K. desenvolveram este software como funcionários da GSK e agora são associados da Merck e da Moderna, respectivamente.

O mAbScale fornece uma interface de usuário intuitiva com a flexibilidade de alterar os blocos de construção para cálculos elementares e de massa. Espera-se que os usuários tenham uma compreensão básica da molécula-alvo para usar a aplicação, derivar massas corretas e interpretar os resultados. Por exemplo, a folha de saída de massa intacta ou reduzida pode ser esmagadora devido às numerosas fileiras de massas intactas ou reduzidas, uma vez que o banco de dados de glicanos padrão contém 88 glicanos ligados a N que são co...

Nas últimas duas décadas, os bioterapêuticos evoluíram para se tornarem um pilar da indústria farmacêutica moderna. A pandemia de SARS-CoV2 e outras condições com risco de vida aumentaram ainda mais a necessidade de desenvolvimento mais rápido e mais amplo de moléculas biofarmacêuticas 1,2,3.
O peso molecular bioterapêutico é crítico para a identificação da molécula, em combinação com outros ensaios analíticos. As massas intactas e reduzidas das subunidades são utilizadas ao longo dos ciclos de vida de descoberta e desenvolvimento como parte das estratégias de controle que visam à manutenção da qualidade, conforme descrito no QTPP (Quality Target Product Profile)4.
O desenvolvimento analítico na indústria biofarmacêutica depende fortemente de medições de massa para análise de massa intacta e caracterização profunda usando mapeamento de peptídeos ou monitoramento de método multiatributo (MAM). No centro dessas técnicas que utilizam plataformas modernas de espectrometria de massa (MS) está a capacidade de fornecer medições de massa precisas de alta resolução (HR/AM). A maioria dos instrumentos HR/AM produz precisão de massa na faixa de 0,5-5 ppm, que escala com a faixa de massa. A capacidade de medir massas com precisão para moléculas grandes intactas permite a identificação rápida e confiável de terapias de moléculas grandes. Como a resolução isotópica não pode ser obtida usando condições experimentais típicas para moléculas grandes (&gt;10 kDa), massas médias devem ser calculadas para comparação e identificação 5,6.
Um espectro de massa de proteína intacto ou subunidade típico representa o perfil proteoforme geral, que contém informações compostas sobre as várias formas moleculares resultantes de modificações pós-traducionais (PTM) e quaisquer diferenças de estrutura primária, como clipes ou variantes de sequência. A natureza relativamente fácil e de alto rendimento dessas medições as torna atraentes para caracterização e como controles de monitoramento em processo 7,8. A análise de dados para esses experimentos geralmente requer que o usuário defina o espaço de busca para formas moleculares (gama de PTMs ou outras formas moleculares). Para proteínas glicosiladas, esse espaço de busca é em grande parte impulsionado pela heterogeneidade de glicoformas. Combinações de múltiplos PTMs, configurações de ligações dissulfeto e outras variações ao longo da estrutura primária tornam o cálculo de todas as formas moleculares possíveis uma tarefa tediosa. Portanto, o cálculo manual das possíveis formas moleculares é um processo que consome tempo e recursos e com alto potencial de erro humano.
Aqui, apresentamos uma ferramenta de cálculo de massa que foi desenvolvida considerando as características mais importantes de moléculas bioterapêuticas, como mAbs, bsAbs, ADCs, etc. A ferramenta permite a fácil incorporação de variáveis do espaço de busca para o cálculo consistente de massas e composições elementares. A natureza modular desta ferramenta permitirá que ela seja desenvolvida e aplicada ao cálculo de massa e à correspondência de massa para outras modalidades.
O módulo GUI permite que o usuário especifique a entrada para o cálculo de massa, como mostrado na Figura 1; Especificamente, o usuário insere sequências de aminoácidos de letra única para cadeias de anticorpos leves e pesadas. Modificações comuns para ciclização de N-terminal de cadeia pesada e clipagem de lisina C-terminal estão incluídas como caixas de seleção. Além disso, a fórmula química/composição elementar pode ser adicionada/subtraída dessas cadeias proteicas através da respectiva caixa de texto Chem Mod . Isso permite ao usuário a flexibilidade de adicionar uma composição elementar que inclui várias modificações pós-traducionais ou uma carga útil de pequena molécula no caso de um ADC. Como a maioria dos mAbs terapêuticos são projetados para remover os locais de glicosilação na cadeia leve, a glicosilação na cadeia leve é opcional e pode ser especificada usando uma caixa de seleção na GUI.
Uma variação típica na análise de massa intacta para anticorpos é uma análise de massa de subunidade reduzida, onde a cadeia leve é destacada da cadeia pesada reduzindo as ligações dissulfeto entre cadeias. Dependendo da força do agente redutor utilizado, as ligações dissulfeto intrachain podem ou não ser clivadas. Os usuários têm a flexibilidade de inserir o número total de ligações dissulfeto dependendo do subtipo de IgG ou no caso de um ADC conjugado com cisteína9.
O aplicativo calcula massas de uma maneira ascendente, na qual as composições elementares são primeiro calculadas para as cadeias pesadas individuais e cadeias leves. Em seguida, a ciclização N-terminal de cadeia pesada (HC) Lys-clipping é contabilizada ajustando as composições elementares calculadas. Quaisquer modificações químicas especificadas são então aplicadas às cadeias pesadas e/ou leves. Dependendo do tipo de análise e dos padrões de ligação dissulfeto especificados pelo usuário, o número de hidrogênios é ajustado para as duas cadeias polipeptídicas. As massas de HC glicosilado e de cadeia leve (LC) (opcional) são calculadas com base na entrada do usuário. Finalmente, múltiplas massas HC e LC são combinadas, e os números de ligação dissulfeto são atualizados automaticamente para o cálculo da massa intacta.
Com moléculas maiores, como proteínas intactas, as massas monoisotópicas não podem ser medidas devido ao defeito de massa aditivo ao usar espectrômetros de massa com poder de resolução típico. Em vez disso, massas nominais ou médias são medidas ou relatadas 5,10,11,12,13. As massas elementares médias podem variar de acordo com a fonte utilizada para as massas curadas14,15. Embora as diferenças nas massas elementares possam ser pequenas, elas podem somar valores significativos para cálculos de peso molecular de moléculas grandes. As massas elementares médias usadas por padrão no aplicativo de software são mostradas na Tabela Suplementar 1. Para ambientes regulados, como o campo de pesquisa e desenvolvimento biofarmacêutico (P&amp;D), é importante manter massas moleculares consistentes, pois mudanças nas massas podem implicar mudanças na entidade molecular durante os registros regulatórios. Para permitir a consistência no uso de massas elementares, um dicionário de massas elementares é incluído com a ferramenta de software como um arquivo de texto de valor separado por vírgula (csv): Element_Mass.csv (Supplementary Coding File 1). Da mesma forma, uma lista curada de composições de glicanos tipicamente vistas em mAbs está incluída: Glycan.csv (Supplementary Coding File 2). Ambos os arquivos são salvos no mesmo local de pasta como um aplicativo executável e podem ser modificados pelo usuário para usar uma lista de massa elementar específica ou biblioteca glicana.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig01.jpg"> Figura 1: Interface GUI para o aplicativo mAbScale. O módulo GUI permite que o usuário especifique a entrada para o cálculo de massa. O usuário insere sequências de aminoácidos de letra única para as cadeias de anticorpos leves e pesadas. Modificações comuns para a ciclização N-terminal de cadeia pesada e clipagem de lisina C-terminal estão incluídas como caixas de seleção. Fórmulas químicas/composições elementares podem ser adicionadas/subtraídas através da respectiva caixa de texto Chem Mod . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Sistema Acquity UPLC</td><td>Waters Corp., Milford, MA</td><td>N/A</td><td>Sistema modular</td></tr><tr><td>Conjugado anticorpo-droga (ADC)</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>N/A</td><td>Molécula proprietária</td></tr><tr><td>BEH 200 SEC coluna&nbsp;</td><td>Waters Corp., Milford, MA</td><td>176003904</td><td></td></tr><tr><td>mAb biespecífico</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>N/A</td><td>Molécula proprietária</td></tr><tr><td>Byos</td><td>Protein Metrics, Cupertino, CA</td><td>https://proteinmetrics.com/byos/ Versão 4.5</td><td></td></tr><tr><td>GPMAW</td><td>GPMAW</td><td>http://www.gpmaw.com/</td><td></td></tr> <tr><td>LC-MS grau de água&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>W6-1</td><td></td></tr><tr><td>mAb padrão&nbsp;</td><td>Waters Corp., Milford, MA</td><td>186009125</td><td>Waters Humanized mAb Mass Check Standard</td></tr><tr><td>mAbScale</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>Apache License, Versão 2.0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa Xevo G2 Q-TOF</td><td>Waters Corp., Milford, MA</td><td>N/A</td><td>Sistema modular</td></tr></tbody></table>

uma estrutura de código aberto para o cálculo de massa de moléculas terapêuticas baseadas em anticorpos

An Open-Source Framework for Mass Calculation of Antibody-Based Therapeutic Molecules

As massas bioterapêuticas são um meio de verificação de identidade e integridade estrutural. A espectrometria de massa (MS) de proteínas intactas ou subunidades proteicas fornece uma ferramenta analítica fácil para diferentes estágios do desenvolvimento biofarmacêutico. A identidade da proteína é confirmada quando a massa experimental de MS está dentro de uma faixa de erro de massa pré-definida da massa teórica. Embora existam várias ferramentas computacionais para o cálculo de pesos moleculares de proteínas e peptídeos, elas não foram projetadas para aplicação direta a entidades bioterapêuticas, têm limitações de acesso devido a licenças pagas ou exigem o upload de sequências de proteínas para servidores host. 
Desenvolvemos uma rotina modular de cálculo de massa que permite a fácil determinação das massas médias ou monoisotópicas e composições elementares de glicoproteínas terapêuticas, incluindo anticorpos monoclonais (mAb), anticorpos biespecíficos (bsAb) e conjugados anticorpo-droga (ADC). A natureza modular desta estrutura de cálculo baseada em Python permitirá a extensão desta plataforma para outras modalidades, como vacinas, proteínas de fusão e oligonucleotídeos no futuro, e esta estrutura também pode ser útil para a interrogação de dados de espectrometria de massa de cima para baixo. Ao criar um aplicativo de desktop autônomo de código aberto com uma interface gráfica do usuário (GUI), esperamos superar as restrições em torno do uso em ambientes onde as informações proprietárias não podem ser carregadas em ferramentas baseadas na Web. Este artigo descreve os algoritmos e a aplicação dessa ferramenta, mAbScale, a diferentes modalidades terapêuticas baseadas em anticorpos.

Uma variedade de mAbs foi selecionada para representar diferentes tipos de mAbs. Um padrão de mAb comercialmente disponível foi selecionado para representar um mAb convencional com cadeias pesadas idênticas, cadeias leves idênticas e um sítio de glicosilação N-ligado na região Fc. Um mAb com uma cadeia leve adicional N-glicosilação ligada, um mAb biespecífico e um mAb conjugado anticorpo-droga (ADC) também foram escolhidos para ampliar o uso da aplicação. A composição química, a massa calculada, a massa medida e o erro d...

Este artigo descreve o uso de um software, mAbScale, para o cálculo de massas para a terapêutica proteica baseada em anticorpos monoclonais.

Uma estrutura de código aberto para o cálculo de massa de moléculas terapêuticas baseadas em anticorpos

Biotherapeutic masses are a means of verifying identity and structural integrity. Mass spectrometry (MS) of intact proteins or protein subunits provides ...

O desafio com o cálculo preciso de massa para moléculas grandes de proteína é o defeito de massa associado à medição. Como resultado, apenas massas médias podem ser medidas. Pequenas diferenças de massa elementar podem se acumular, causando discrepâncias significativas em grandes moléculas paraterapêuticas, como anticorpos monoclonais.Nossa ferramenta aborda explicitamente o desafio no cálculo de massa consistente para terapêuticas baseadas em anticorpos, como MAPs, biespecíficos e conjugados de drogas de anticorpos. Os pesquisadores no espaço de desenvolvimento biofarmacêutico comercial têm que confiar em cálculos manuais ou ferramentas que não dependem de comunicação com servidores externos devido ao envolvimento de informações proprietárias. As ferramentas existentes requerem uma licença ou não são construídas considerando as necessidades específicas do desenvolvimento biofarmacêutico.MapScale oferece uma interface amigável e estrutura de código aberto adaptável para usuários e desenvolvedores. Ele suporta a manutenção de várias versões de massas elementares e listas de modificação, e permite o compartilhamento de listas para manter a consistência nos cálculos. O código pode ser compartilhado em nível corporativo usando servidores internos ou implantação baseada em nuvem com acesso controlado para proteger informações proprietárias.

an-open-source-framework-for-mass-calculation-antibody-based

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Neste vídeo, demonstramos o uso da fotometria de massa para estudar as interações antígeno-anticorpo em uma câmara de fluxo. A luz focalizada se espalha de forma diferente com base na massa das moléculas. Um detector coleta a luz espalhada e gera o padrão de interferência como pontos de intensidades variadas, que se correlacionam com as massas moleculares.

Fotometria de massa para estudar interações antígeno-anticorpo em um nível de molécula única

Um método é descrito com acompanhamento visual para a realização escaláveis, selecções de alto rendimento de bibliotecas combinatórias de anticorpos sintéticos exibidos em fagos contra centenas de antigénios simultaneamente. Usando esta abordagem paralela, isolámos fragmentos de anticorpos que exibem uma elevada afinidade e especificidade para diversos antígenos que são funcionais em imunoensaios convencionais.

Selecção de alta Scalable Rendimento de bibliotecas de anticorpos em fagos sintética exibida-

Este protocolo descreve a produção de um anticorpo terapêutico num sistema de expressão de mamífero. Os métodos descritos incluem a preparação de ADN do vector, transfecção estável e adaptação isento de soro de uma linha celular de rim embrionário humano 293, configurado de culturas em larga escala e a purificação utilizando cromatografia de afinidade.

Produção à escala laboratorial e purificação de um anticorpo terapêutico

Peptídeos virais-derivado acoplados ao anticorpo-conjugados (ACs) é uma abordagem ganhando impulso devido ao potencial de entregar cargas moleculares com acumulação de células de tumor aumento. Utilizando métodos comuns para avaliar a conjugação do peptide, AC e acúmulo intracelular de carga e direcionamento do tumor, este protocolo ajuda pesquisadores durante as fases de desenvolvimento inicial chave.

Avaliação inicial do anticorpo cojugado modificado com peptídeos virais-derivado para aumentar a acumulação celular e melhorando o direcionamento do Tumor

Aqui nós descrevemos uma abordagem proteômica de célula única para avaliar imunológico fenotípico e funcional (indução de citocinas intracelulares) alterações nas amostras de sangue periférico, analisadas através de citometria de massa.

Análise de célula única do imunofenótipo e produção de citocinas no sangue periférico através de citometria de massa

Incorporando um derivado do ciclopropeno de lisina em anticorpos permite a ligação de site-specific, rápida e eficiente de moléculas de tetrazine-rolamento para gerar o cojugado anticorpo-droga.

Codificação genética de um aminoácido não-canônicos para a geração de anticorpos-droga conjuga através de uma reação rápida opaco

Aqui, descrevemos os protocolos para a análise e visualização da estrutura e constituição de repertórios de anticorpo toda. Isso envolve a aquisição da vastas sequências de RNA de anticorpo usando sequenciamento de próxima geração.

Identificação de Mouse e repertórios de anticorpo humano por sequenciamento de próxima geração

Este estudo teve como objetivo apresentar uma estratégia para identificar interações medicamentosa-peptídeos. A estratégia envolve o biopanning de peptídeos curtos que reconhecem drogas com base em um biosensor de microequilísã de quartzo-cristal (QCM), seguido de análise bioinformática para avaliação quantitativa das informações obtidas para o reconhecimento de medicamentos e anotação dos locais de ligação medicamentosa em proteínas.

Estratégia de análise de biopanning e bioinformática baseada em biosensor para a validação global de interações medicamentosas-proteínas

Aqui, apresentamos um método para identificar compostos que modulam o mecanismo ADCC, um importante mecanismo de morte de células cancerígenas de anticorpos antitumorais. O efeito citotóxico das células NK é medido em esferoides de células de câncer de mama na presença de trastuzumabe. A análise de imagens identifica células assassinas e alvo vivas e mortas em esferoides.

Quantificação da Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos em Modelo Esferoide Tumoral: Aplicação para Descoberta de Fármacos

flexibilidade conformacional desempenha um papel crucial na função da proteína. Aqui, nós descrevemos o uso de espectrometria de massa por ionização por electropulverização resolvida no tempo acoplado a troca de hidrogénio-deutério para sondar as rápidas mudanças estruturais que conduzem a função de proteínas ordenadas e desordenadas.

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Aprenda a calcular massas de anticorpos monoclonais com o software mAbScale. Esta ferramenta de código aberto resolve defeitos de massa em moléculas terapêuticas grandes, melhorando a precisão no desenvolvimento de proteínas bioterapêuticas.

Uma estrutura de código aberto para o cálculo de massa de moléculas terapêuticas baseadas em anticorpos

Explorar mais vídeos