Name: Análise da densidade mitocondrial e distribuição longitudinal em fibras musculares esqueléticas vivas de ratos por microscopia confocal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprenda a quantificar a densidade e distribuição mitocondrial em fibras musculares esqueléticas vivas de ratos por microscopia confocal. Este método avança o entendimento da remodelação mitocondrial em condições fisiológicas e patológicas.

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Este trabalho foi apoiado pela Faculdade de Medicina e pelo Instituto de Pesquisa em Obesidade de Tecnologico de Monterrey. A Figura 3A foi criada com o software Scientific Image and Illustration.

Análise microscópica confocal das mitocôndrias do músculo de ratos

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<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+subpopulations+and+heterogeneity+revealed+by+confocal+imaging%3A+possible+physiological+role%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial subpopulations and heterogeneity revealed by confocal imaging: possible physiological role.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1757 (5-6), 686-691 (2006).</li>
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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

As mitocôndrias são organelas com alta capacidade de remodelação. Seu conteúdo, densidade e distribuição podem ser rapidamente modificados através da ativação dos mecanismos de fusão e fissão mitocondrial, conhecidos como dinâmica mitocondrial1, e do equilíbrio entre os mecanismos de turnover mitocondrial: a biogênese mitocondrial e a via especializada de degradação mitocondrial, a mitofagia21,22. O conteúdo e a morfologia mitocondrial podem variar de acordo com o tipo celular e o estágio de desenvolvimento e podem ser remodelados sob diferentes estímulos fisiológicos e patológicos 17,22,23,24. Portanto, o estudo da morfologia mitocondrial tem sido relevante há mais de meio século25. Notadamente, a análise de mitocôndrias por microscopia eletrônica tem sido a técnica padrão aplicada em múltiplosestudos26.
Estudos fluorescentes por microscopia confocal têm ganhado relevância nos últimos anos devido à sua capacidade de imageamento de células vivas de mitocôndrias em diferentes profundidades de fibras, o que poderia ajudar a entender melhor o papel das mitocôndrias no músculo esquelético em diferentes condições adaptativas e desadaptativas27. Neste estudo, uma metodologia para a análise da densidade e distribuição mitocondrial em fibras musculares esqueléticas vivas por microscopia confocal é descrita. Um dos principais desafios de trabalhar com fibras musculares esqueléticas vivas é evitar a contração desde os processos de isolamento até o registro confocal mitocondrial. Para atingir esse objetivo, uma solução de alto teor de Mg e ATP Relax17 é utilizada para manter as fibras relaxadas por pelo menos 2 h, o que dá tempo suficiente para realizar o processo de isolamento das fibras, a carga de fluoróforo e a aquisição do sinal mitocondrial por microscopia confocal. Um ponto crítico do protocolo é a obtenção das fibras mecanicamente, pois requer alta precisão e tecido fresco; no entanto, é possível obter feixes de fibras viáveis a partir de músculo de rato com esta técnica previamente utilizada erelatada28. A obtenção de fibras íntegras permite preservar o sarcolema e o meio intracelular, mantendo o crosstalk metabólico e funcional entre as estruturas celulares28,29.
Ao contrário do trabalho com tecidos ou células fixas, a aquisição de imagens fluorescentes de células vivas por microscopia confocal permite o monitoramento em tempo real do efeito de diversas condições experimentais. O presente protocolo pode ser utilizado para explorar mudanças na densidade e distribuição mitocondrial em tempo real e explorar diferenças entre grupos experimentais, como os exemplos aqui apresentados entre fibras magras e derivadas de Ob (Figura 3 e Figura 4). Deve-se sempre considerar que a imagem de células vivas implica na padronização de condições ideais de trabalho com pequenos danos celulares. O tempo de trabalho, a qualidade das soluções utilizadas, os parâmetros de aquisição e a exposição dos lasers devem ser finamente controlados. Assim, considerações essenciais são mencionadas a seguir.
As mitocôndrias das fibras musculares não podem ser registradas inteiramente longitudinalmente por microscopia confocal devido ao tamanho da fibra e ao dano da fibra que pode ser causado pela longa exposição ao laser. No entanto, uma amostra representativa da fibra é registrada sob esta técnica. Embora seja possível registrar toda a espessura da fibra muscular esquelética de um rato por microscopia confocal, isso implica em maior tempo de registro e exposição ao feixe de laser. No caso de ratos controle, problemas com essas gravações não foram encontrados. No entanto, fibras de condições patológicas podem ser mais suscetíveis a danos, como observado nas fibras de ratos Ob. Consequentemente, a aquisição de uma pilha de imagens confocais representativas obtidas em diferentes distâncias Z é preferível. Quando apenas uma seção da espessura da fibra é registrada, recomenda-se tomar a pilha na mesma profundidade em todas as fibras testadas, uma vez que a distribuição e a densidade mitocondrial podem variar de acordo com sua posição dentro da fibra. A aquisição do sinal a uma profundidade acima de 15 μm é recomendada para obter imagens confocais representativas do FMI, evitando populações de MES situadas próximas à periferia.
Durante a aquisição confocal, algumas considerações importantes devem ser levadas em consideração. Primeiramente, a seleção da objetiva de imersão considerando o meio de magnificação, NA alto e imersão. Como as células são mantidas em um meio de incubação hidrofílico, o índice de refração do meio de incubação e imersão deve ser semelhante para obter um bom sinal e varrer profundamente o tecido. Geralmente obtido usando uma lente objetiva de imersão em água. As imagens confocais da Figura 3 e Figura 4 foram adquiridas com objetiva de imersão em água de 20x, 0,7 NA. Este objetivo permite o registro da fibra em toda a sua profundidade, mas a varredura a 15, 18 e 21 μm foi decidida, uma vez que imagens confocais representativas do FMI podem ser obtidas com sinal de alta intensidade de fluorescência e pequenos danos à fibra. Outras ampliações, como 40x e óleo como meio de imersão, podem ser consideradas, mas precisam ser avaliadas.
Em segundo lugar, o tamanho do pixel para aquisição da imagem é calculado de acordo com o teorema de Nyquist, que permite a seleção de um tamanho de pixel apropriado que evite a superamostra (maior exposição ao laser) e a subamostra (leva a menor resolução)30. O cálculo depende das características da objetiva selecionada e do comprimento de onda (~90 nm). Pode ser ajustado com o zoom; portanto, apenas uma configuração de zoom fornece um tamanho de pixel ideal30. No entanto, na prática, o zoom também depende da área do espécime a ser analisado. Assim, encontrar equilíbrio permite trabalhar com um tamanho de pixel que se aproxime mais do critério de Nyquist e que também se encaixe na área a ser analisada. A Figura 3 e a Figura 4 foram adquiridas com um tamanho de pixel de 150 e 190 nm, o que permitiu a análise da largura total da fibra que é de ~50-80 μm.
Em terceiro lugar, deve ser usado um diâmetro de orifício apropriado que impeça que a luz fora de foco atinja o detector. Tipicamente, 1 Airy é considerado o tamanho ideal do orifício, pois permite a detecção de ~80% dos fótons provenientes do plano de foco30. No entanto, algumas amostras biológicas coradas que apresentam baixos níveis de fluorescência requerem um aumento do orifício30. As imagens confocais da Figura 3 e Figura 4 foram adquiridas com um orifício de 3 Airy devido a um baixo sinal captado com um Airy mais baixo. É importante considerar que o aumento da intensidade do sinal resultante do aumento do tamanho do orifício leva à redução da resolução devido ao aumento da luz captada fora de foco. Por esse motivo, recomendamos o uso de um tamanho pinhole o mais próximo possível de 1 arejado.
Quando adequadamente adquiridas, as imagens confocais podem ser processadas para obter informações quantitativas sobre densidade e distribuição mitocondrial. Independentemente disso, a etapa crítica de processamento da imagem de limiar precisa ser realizada antes da análise para melhorar a quantificação do sinal. Durante esta etapa crucial, o valor de intensidade de fluorescência que separa os pixels positivos para mitocôndrias daqueles do fundo é definido. O limiar pode ser definido por um ajuste gaussiano do pico que representa a mitocôndria quando o histograma da imagem exibe dois picos, um correspondendo ao fundo e outro à mitocôndria. No entanto, uma distribuição bimodal nem sempre é alcançada em cada uma das imagens, portanto, outros métodos de limiares devem ser aplicados.
Nesse protocolo, descreve-se a implementação do thresholding de Otsu, que é um método não paramétrico e não supervisionado projetado para encontrar o valor limite quando os dois picos não estão separados, ou outros picos estão presentes31. Otsu pode ser facilmente aplicado usando uma plataforma de código aberto para análise de imagens biológicas; no entanto, outros métodos de limiares podem ser testados. O mesmo método de limiar deve ser aplicado a todas as imagens confocais e deve ser calculado independentemente para cada imagem confocal. Aplicar o limite a uma pilha inteira leva a resultados incorretos. Uma vez obtidas as imagens binárias após o processo de limiarização, a análise da densidade mitocondrial e FFT pode ser facilmente realizada seguindo as instruções descritas neste protocolo. No entanto, deve-se ter cuidado ao realizar ambas as análises para evitar a inclusão de núcleos e capilares, pois isso levaria a erros de quantificação. Em relação à densidade, basta subtrair os pixels, ou a área ocupada pelos núcleos ou capilares, dos pixels ou área total a ser analisada. Além disso, ao realizar a análise do FFT, deve-se verificar se o sinal mitocondrial está reto. Por outro lado, quando o sinal mitocondrial é inclinado, ele pode produzir perfis que não representam a distribuição longitudinal mitocondrial, produzindo dados incorretos do espectro FFT. Além disso, uma etapa de pré-processamento pode ser aplicada para reduzir o ruído nas imagens. Este protocolo descreve duas etapas opcionais de pré-processamento usando um filtro mediano e deconvolução 2D. Os efeitos desses métodos de pré-processamento sobre a imagem e o conteúdo de densidade mitocondrial são apresentados na Figura Suplementar S1. É importante considerar que, embora esses pré-processos possam melhorar a qualidade da imagem, eles também podem resultar na perda de certos detalhes da imagem. Portanto, devem ser usados com cautela e aplicados de forma consistente em todas as imagens analisadas.
Apesar de suas vantagens, a microscopia confocal é limitada por uma resolução lateral (XY) de 180-250 nm quando as condições ótimas de aquisição são implementadas32. O diâmetro mitocondrial é de ~200-700 nm, próximo ao limite de difração da microscopia confocal; assim, estruturas submitocondriais não podem ser adequadamente detectadas33 e não podem ser avaliadas por análises de densidade e FFT mostradas neste protocolo. Outras técnicas de super-resolução da microscopia, como a microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM), a microscopia de depleção de emissão estimulada (STED) ou a microscopia de iluminação estruturada (SIM), podem ser exploradas para resolver estruturas submitocondriais32. Neste protocolo, as imagens confocais das mitocôndrias são obtidas utilizando o fluoróforo TMRE, que depende do potencial de membrana mitocondrial. Portanto, a intensidade fluorescente mitocondrial pode variar de acordo com seu potencial de membrana. Um processo de limiar é realizado antes da análise dos dados para superar esse problema. Todos os pixels acima de um limiar definido são considerados positivos para o sinal mitocondrial, independentemente do seu valor de fluorescência. No entanto, deve-se notar que mitocôndrias com um potencial de membrana muito baixo não podem ser resolvidas com esta técnica. Assim, estudos complementares de quantificação do conteúdo de proteínas mitocondriais são recomendados. Uma vantagem do uso da TMRE é que imagens confocais também podem ser usadas para análise do potencial de membrana mitocondrial, mas controles adequados com agentes desacopladores precisam ser realizados, como carbonilcianeto-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP). Além disso, as instruções para análise de densidade e distribuição mitocondrial podem ser obtidas usando indicadores fluorescentes verdes para mitocôndrias, que carregam mitocôndrias independentemente de seu potencial de membrana, mas a estratégia de incubação e os ajustes de aquisição confocal precisam ser padronizados.
Dado que a estrutura mitocondrial está relacionada às funções mitocondriais e celulares essenciais, o protocolo aqui descrito pode fornecer informações valiosas sobre sua remodelação durante a doença ou por um insulto ao estresse particular. Isso poderia contribuir para uma melhor compreensão das principais funções do músculo esquelético governado por mitocôndrias, como a produção de energia, ou nas quais as mitocôndrias desempenham um papel importante na interação com outras organelas, como o acoplamento contração-metabolismo. Seguir as instruções do protocolo permite estimar a densidade e distribuição mitocondrial no músculo vivo esquelético. As etapas do protocolo são divididas em três etapas principais focadas na dissecção do feixe muscular esquelético, microscopia confocal e análise de imagens, onde instruções detalhadas e considerações importantes são incluídas. Notavelmente, o protocolo pode ser otimizado para explorar etapas Z adicionais para a reconstrução mitocondrial completa dentro da fibra de acordo com as necessidades do usuário. Por exemplo, as etapas de análise e imagem confocal podem ser testadas para estudar estruturas celulares com distribuição semelhante, como TT em amostras vivas e fixas.

As mitocôndrias formam redes altamente dinâmicas que são reguladas principalmente pelo equilíbrio entre seu alongamento (fusão) e fragmentação (fissão)1,2, que são moduladas pela expressão e atividade de proteínas como a Mitofusina 1 e 2 (Mfn1 e Mfn2), e a Atrofia de proteínas ópticas 1 (Opa1), que regulam a fusão da membrana mitocondrial externa e da membrana interna, respectivamente 1,2. A proteína relacionada à dinamina (Drp1) regula predominantemente a fissão mitocondrial quando é fosforilada no Ser6163.
No músculo esquelético, está bem estabelecido que a rede mitocondrial está disposta em subpopulações estruturalmente bem definidas com base na proximidade com diferentes regiões celulares (miofibrilas, sarcolemas e núcleos)4,5. As mitocôndrias localizadas logo abaixo do sarcolema são chamadas de mitocôndrias subsarcolemais (MES), aquelas localizadas entre os filamentos contráteis são chamadas de mitocôndrias intermiofibrilares (FMI) e a subpopulação mitocondrial ao redor dos núcleos é chamada de rede mitocondrial perinuclear (NMP). Além disso, tem sido sugerido que essas subpopulações mitocondriais têm funções específicas da região e são metabolicamente especializadas 4,5.
A manutenção da homeostase energética celular, que permite a função metabólica e contrátil, depende em grande parte da interação e comunicação em locais específicos através da rede mitocondrial (por exemplo, interação FMI e MSE)4,6. Além das interações da rede mitocondrial, as mitocôndrias também podem interagir com outras organelas, formando complexos estruturais e funcionais. Nesse sentido, tem sido demonstrado que o FMI pode estar localizado adjacente ao retículo sarcoplasmático (RS) e próximo às unidades de liberação de Ca2+ (CRU), formadas pelos túbulos transversos (TT)7. Este fato é relevante devido ao papel da captação mitocondrial de Ca2+ na regulação da síntese de ATP e apoptose. Recentemente, um papel potencial na regulação dos transitórios citosólicos de Ca2+ também tem sido sugerido8.
Os TT são invaginações do sarcolema que apresentam distribuição periódica ao longo do eixo longitudinal dos cardiomiócitos e das fibras musculares esqueléticas9,10, semelhante à distribuição doFMI5. Alterações na distribuição do TT têm implicações fisiológicas importantes, dado seu papel na função contrátil. Entretanto, essas alterações têm sido avaliadas principalmente nos cardiomiócitos. A análise por Transformada Rápida de Fourier (FFT) permite a conversão de sinais periódicos do domínio da distância para o domínio da frequência, resultando em um espectro de FFT que indica a frequência e a regularidade do sinal11,12,13. Embora existam evidências de que a organização da rede mitocondrial nas fibras musculares esqueléticas seja essencial para a adaptação a diferentes condições metabólicas, como durante a regeneração após lesãomuscular14,15, a maioria das análises é realizada qualitativamente.
Além disso, dado que a disfunção mitocondrial tem sido associada a várias doenças musculares esqueléticas (por exemplo, atrofia por desuso)2 e não musculares, particularmente doenças metabólicas, e à perda de massa muscular associada (isto é, atrofia)16, a avaliação quantitativa da rede e distribuição mitocondrial no músculo esquelético assume relevância. Recentemente, uma diferença significativa na distribuição longitudinal das mitocôndrias das fibras musculares gastrocnêmias entre um grupo de obesos (Ob; Zucker fa/fa ratos) e um grupo magro (Lean; Zucker +/+ ratos) foi identificada através da FFT17. Este estudo demonstrou a utilidade da FFT na análise da distribuição mitocondrial. Portanto, este protocolo apresenta uma metodologia para estudar mitocôndrias em fibras musculares esqueléticas vivas a partir de imagens obtidas por microscopia confocal de fluorescência. A densidade mitocondrial é quantificada pelo limiar de fundo, e a análise da distribuição mitocondrial longitudinal pela análise FFT também é descrita. Um esquema de fluxo de trabalho é apresentado na Figura 1.

<table><tbody><tr><td>Adenosina 5'-trifosfato de hidrato de sal dissódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>Lamínula de vidro borossilicato</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0709</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Software de microscópio confocal Leica Application Suite&nbsp;</td><td>Leica</td><td>2.7.3.9723</td><td></td></tr><tr><td>Creatina Fosfoquinase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3755</td><td></td></tr><tr><td>DeconvoluçãoLab2 (DeconvolutionLab_2.jar)</td><td>Grupo de Imagens Biomédicas, EPFL</td><td>http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/</td><td></td></tr> <tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ácido DL-aspártico potássio sat hemihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11240</td><td></td></tr><tr><td>Etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N&agudo; Ácido N&tetracético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Miltex</td><td>MH-18</td><td></td></tr><tr><td>HC PL APO 20x/ 0.7 Objetiva IMM&nbsp;</td><td>Leica</td><td>506517</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de íris</td><td>Miltex</td><td>5-304</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-Ácido málico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>Hidrato de sal monossódico de ácido L-glutâmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Maxchelator</td><td>UC Davis Health</td><td>https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micro tesoura</td><td>Miltex</td><td>18-1633</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de código aberto para análise de imagens biológicas Fiji&nbsp;</td><td>Público, mantido pelo grupo Eliceiri/LOCI, grupo Jug e laboratório Tomancak. Fiji</td><td>https://fiji.sc/</td><td></td></tr> <tr><td>Hidrato de sal dissódico de fosfocreatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>PSF Generator (PSF_Generator.jar)</td><td>Grupo de Imagens Biomédicas, EPFL</td><td>http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de gravação</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27N</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Planilha Microsoft Excel</td><td>Microsoft&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina, éster etílico</td><td>Invitrogen</td><td>T669</td><td></td></tr></tbody></table>

análise da densidade mitocondrial e distribuição longitudinal em fibras musculares esqueléticas vivas de ratos por microscopia confocal

Analysis of the Mitochondrial Density and Longitudinal Distribution in Rat Live-Skeletal Muscle Fibers by Confocal Microscopy

A mitocôndria é uma organela que pode ser alongada, fragmentada e renovada de acordo com as necessidades metabólicas das células. O remodelamento da rede mitocondrial permite que mitocôndrias saudáveis atendam às demandas celulares; entretanto, a perda dessa capacidade tem sido relacionada ao desenvolvimento ou progressão de diferentes patologias. No músculo esquelético, observam-se alterações na densidade e distribuição mitocondrial em condições fisiológicas e patológicas como exercício, envelhecimento, obesidade, entre outras. Portanto, o estudo da rede mitocondrial pode fornecer um melhor entendimento dos mecanismos relacionados a essas condições.
Aqui, um protocolo para imagens mitocondriais de fibras musculares esqueléticas vivas de ratos é descrito. As fibras são dissecadas manualmente em uma solução relaxante e incubadas com um indicador fluorescente de imagem de células vivas da mitocôndria (éster etílico de tetrametilrodamina, TMRE). O sinal mitocondrial é registrado por microscopia confocal usando o modo de varredura XYZ para obter imagens confocais da rede mitocondrial intermiofibrilar (FMI). Em seguida, as imagens confocais são processadas por limiar e binarização. A imagem confocal binarizada representa os pixels positivos para as mitocôndrias, que são então contados para obter a densidade mitocondrial. A rede mitocondrial no músculo esquelético é caracterizada por uma alta densidade populacional de FMI, que tem uma distribuição longitudinal periódica semelhante à dos túbulos T (TT). A Transformada Rápida de Fourier (FFT) é uma técnica de análise padrão realizada para avaliar a distribuição de TT que permite encontrar a frequência de distribuição e o nível de sua organização. Neste protocolo, a implementação do algoritmo FFT é descrita para a análise da distribuição mitocondrial longitudinal no músculo esquelético.

Seguindo o presente protocolo, a análise da densidade e distribuição das mitocôndrias pode ser realizada no músculo esquelético vivo. O protocolo é dividido em três etapas principais: dissecção do feixe muscular esquelético, microscopia confocal e análise de imagens. A visão geral do fluxo de trabalho é apresentada na Figura 1. A Figura 2A mostra todo o músculo gastrocnêmio de rato em uma placa de Petri, marcando a cabeça lateral da qual as fibras são obtidas, enquanto a Figura 2B mostra os feixes de fibras em solução Relax. Por microscopia confocal, as mitocôndrias podem ser registradas ao longo da profundidade da fibra muscular esquelética viva usando o indicador fluorescente TMRE. O TMRE é um fluoróforo catiônico lipofílico que se acumula seletivamente dentro das mitocôndrias de acordo com o potencial de membrana mitocondrial20.
Uma imagem confocal ótima do FMI pode ser obtida selecionando-se uma distância Z acima de 15 μm de profundidade dentro da fibra (Figura 3A). A Figura 3B mostra imagens confocais XY representativas de mitocôndrias carregadas de TMRE adquiridas ao longo da distância Z das fibras musculares gastrocnêmias (15 a 21 μm). As imagens confocais foram processadas por limiar para transformá-las em imagens binárias para permitir a análise mitocondrial. A Figura 3B (painel esquerdo) mostra uma fibra de um rato magro exercitado. Representa um registro confocal esperado de mitocôndrias de fibras musculares esqueléticas, uma vez que apresenta um padrão consistente ao longo da fibra. Em contraste, selecionamos uma fibra de um rato Ob (Figura 3B, painel direito) que mostra alterações substanciais no conteúdo e distribuição mitocondrial. A Figura 3C mostra a quantificação da área das fibras ocupadas pelas mitocôndrias, expressa em densidade mitocondrial, obtida a partir de cada imagem binarizada (mostrada no painel B). Como esperado, a fibra Ob apresentou menor densidade mitocondrial. Ela foi quantificada consistentemente ao longo da distância Z analisada, o que também é observado na Figura 3D quando a densidade mitocondrial é calculada por pilha conforme as três imagens confocais adquiridas a 15, 18 e 21 μm.
Semelhante à análise da densidade mitocondrial, a varredura confocal de um indicador fluorescente para imagens de células vivas, como o TMRE, permite estudar a organização longitudinal das mitocôndrias no músculo esquelético vivo. O FMI apresenta uma organização periódica na banda I próxima ao TT7, que pode ser analisada pela FFT para quantificar a frequência do sinal mitocondrial e o nível de organização17. A Figura 4 mostra as diferenças na organização do FMI encontradas no gastrocnêmio derivado de ratos Lean e Ob e como a FFT permite encontrar as mudanças na distribuição do sinal mitocondrial. A Figura 4A,B apresenta ROIs longitudinais selecionadas em posição central e lateral na fibra para análise da FFT. Antes de executar o FFT, o limiar para subtração em segundo plano é calculado. Em seguida, a imagem é binarizada; Esses procedimentos eliminam as variações nos níveis de intensidade de fluorescência do sinal mitocondrial. A imagem binária fornece o perfil gráfico da distribuição de fluorescência necessária para realizar o FFT.
A Figura 4C,D mostra as ROIs selecionadas nos painéis A e B com seus perfis de plotagem (painéis superiores). A partir dos perfis das parcelas, podem ser observadas diferenças na distribuição de fluorescência entre as fibras derivadas de ratos Lean e Ob, bem como as variações entre as ROIs dentro de uma mesma fibra. Para cada perfil de parcela, seu respectivo espectro FFT é apresentado (painéis inferiores). O pico do espectro máximo de FFT indica a frequência de FFT (eixo X) da distribuição do sinal mitocondrial ao longo do eixo longitudinal. Ele pode ser transformado em um valor de distância próximo a 2 μm nas ROIs lateral e central do rato Lean. Notadamente, a magnitude FFT do pico é um índice da regularidade do sinal mitocondrial, e mudanças nessa amplitude revelam alterações na distribuição mitocondrial.
A Figura 4E,F mostra as diferenças no espectro da FFT entre as fibras Lean e Ob-derivadas, onde as ROIs lateral e central foram analisadas, respectivamente. Nas ROIs laterais (Figura 4E) a frequência da distribuição longitudinal mitocondrial foi semelhante nas fibras magras e derivadas de Ob; entretanto, a amplitude do pico máximo de FFT nas fibras derivadas de Ob foi maior, o que está de acordo com a maior regularidade do sinal observada na imagem da Figura 4B. No entanto, a ROI central (Figura 4F) do Ob é observada como exemplo de redução crítica do pico do FFT em relação ao Lean quando uma alteração importante da distribuição mitocondrial está presente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig01v2.jpg"> Figura 1: Esquema para análise mitocondrial em músculo esquelético por microscopia confocal. Esse esquema resume as principais etapas do protocolo em três fases distintas. A primeira fase, dissecção dos feixes de fibras do músculo gastrocnêmio, é subdividida em três etapas subsequentes, isolamento do músculo gastrocnêmio, seguido de dissecção mecânica do músculo em feixes para, finalmente, fazer uma seleção visual dos viáveis. A segunda fase consiste na aquisição de imagens de células vivas por microscopia confocal, que consiste na incubação com o fluoróforo (TMRE) por 20 min à temperatura ambiente para colocação das fibras na câmara. Em seguida, são feitos os ajustes apropriados no microscópio para realizar a aquisição das imagens confocais. Na terceira fase, são realizados o processamento das imagens confocais e a análise dos dados. Começando com o processamento de imagens, onde um limiar é necessário para gerar imagens binárias a partir das quais são feitos cálculos de densidade mitocondrial e distribuição mitocondrial por FFT. Abreviaturas: TMRE = tetrametilrodamina éster etílico; FFT = Transformada Rápida de Fourier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig01largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig02.jpg"> Figura 2: Dissecção do feixe muscular esquelético. (A ) Dissecada cabeça gastrocnêmio lateral de rato (seta preta) em placa de Petri com solução Relax. (B) Imagem representativa dos feixes de fibras musculares gastrocnêmias em solução Relax antes da carga com TMRE. Abreviação: TMRE = tetrametilrodamina éster etílico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig03.jpg"> Figura 3: Análise da densidade mitocondrial. (A) Ilustração que representa a distância Z recomendada para varredura confocal de mitocôndrias de FMI em fibras musculares esqueléticas. (B) Série de imagens confocais de mitocôndrias carregadas de TMRE em fibras musculares esqueléticas, obtidas de um rato Zucker +/+ exercitado (Lean) e de um rato Zucker fa/fa obeso (Ob) registrado na distância Z (de 15 a 21 μm de profundidade). As imagens foram processadas por thresholding e transformadas em imagens binárias. (C) Calculada a mitodensidade dos cortes confocais obtidos nas diferentes distâncias Z observadas no painel B. (D) A mitodensidade obtida da pilha composta pelas imagens observadas no painel B. As imagens no painel B são de 65 x 50 μm. Barra de escala = 10 μm. Abreviações: Mitodensidade = Densidade mitocondrial; FMI = mitocôndrias intermiofibrilares; Ob = Obeso; MES = mitocôndrias subsarcolemais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig04.jpg"> Figura 4: Análise da distribuição mitocondrial por FFT. Imagens confocais representativas de mitocôndrias carregadas com o indicador fluorescente TMRE adquiridas a 21 μm da profundidade das fibras musculares esqueléticas obtidas de um rato Zucker +/+ exercitado (Lean, painel A) e de um rato Zucker fa/fa obeso (Ob, painel B). As imagens foram processadas por thresholding e transformadas em imagens binárias. ROIs laterais e centrais do painel A (painel C) e do painel B (painel D) com seus respectivos perfis de intensidade de fluorescência (gráfico superior) e espectro FFT (gráfico inferior). A FFT foi calculada a partir de ROIs com 256 pixels de largura, o que corresponde a um tamanho de ROI de 39 x 5 μm no painel A e um tamanho de ROI de 50 x 5 μm no painel B. O painel E mostra as diferenças do espectro FFT encontrado entre mitocôndrias derivadas de ratos Lean e Ob na ROI lateral, enquanto o painel F mostra as diferenças do espectro FFT da ROI central. Barra de escala = 10 μm. Abreviaturas: A.U. = Unidades Arbitrárias; FFT = Transformada Rápida de Fourier; ROIs = regiões de interesse; Ob = Obeso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagente</td>
			<td>Concentração final em 100 mL</td>
			<td>Estoque </td>
		</tr><tr><td>K-aspartato</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Kcl</td>
			<td>20 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Ácido L-glutâmico</td>
			<td>3 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Ácido málico</td>
			<td>3 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr><tr><td>MgCl2</td>
			<td>1 mM livre Mg2+</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CaCl2</td>
			<td>0,00002 mM Ca2+ livre</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Fosfocreatina di-Na</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>500 mM</td>
		</tr><tr><td>Creatina fosfoquinase</td>
			<td>5 U/mL</td>
			<td>200 U/mL</td>
		</tr><tr><td>MgATP</td>
			<td>5 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>pH 7,3 (com NaOH)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Solução de relaxamento, reagentes e concentração.
Figura Suplementar S1: Efeito dos métodos de pré-processamento de imagens. (A) Imagens confocais representativas de mitocôndrias carregadas com o indicador fluorescente TMRE adquiridas a uma profundidade de 18 μm em fibras musculares esqueléticas obtidas de um rato Zucker +/+ exercitado (Lean, painel superior) e de um rato Zucker fa/fa obeso (painel inferior), juntamente com suas respectivas imagens obtidas após pré-processamento usando limiar de Otsu, filtro mediano e limiar de Otsu, e deconvolução 2D e limiar de Otsu. (B) Perfil gráfico da mitodensidade obtida das imagens confocais (painel A) após pré-processamento com diferentes métodos. As imagens no painel A são de 65 x 50 μm. Barra de escala = 10 μm. Abreviações: 2D-Decon = 2D deconvolution; Densidade mitocondrial = Densidade mitocondrial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/Supl%201-rev4.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Aqui, apresentamos um protocolo para analisar mudanças na densidade mitocondrial e distribuição longitudinal por imagens de músculo esquelético vivo usando microscopia confocal para varredura de rede mitocondrial.

Análise da densidade mitocondrial e distribuição longitudinal em fibras musculares esqueléticas vivas de ratos por microscopia confocal

The mitochondrion is an organelle that can be elongated, fragmented, and renovated according to the metabolic requirements of the cells. The remodeling of ...

O remodelamento da rede mitocondrial ocorre em condições fisiológicas de estresse e patológicas. No entanto, os efeitos da remodelação mitocondrial em um músculo esquelético permanecem incompletamente compreendidos. Este protocolo permite quantificar as alterações mitocondriais no músculo esquelético vivo, melhorando nossa compreensão da interação entre as alterações mitocondriais e a função celular.Trabalhar com músculos esqueléticos vivos apresenta desafios devido à contração das fibras durante o isolamento e sensibilidade à imagem durante a varredura confocal. Este protocolo descreve um processo de isolamento utilizando uma solução de relaxamento, possibilitando a análise de fibras musculares viáveis para avaliação mitocondrial via microscopia confocal. Nosso protocolo aborda a falta de fluxos de trabalho para analisar quantitativamente as redes mitocondriais em fibras musculares esqueléticas.As etapas aqui descritas permitem que os usuários aproveitem mais as imagens obtidas por microscopia confocal usando processamento de imagens por limiar e análise rápida de Fourier para obter a quantificação da densidade e distribuição mitocondrial. Estamos interessados no estudo das alterações musculares esqueléticas, particularmente da dinâmica mitocondrial e do remodelamento estrutural mitocondrial durante a adversidade e como elas podem ser moduladas através de intervenções como exercício e jejum intermediário.

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Análise da densidade mitocondrial e distribuição longitudinal em fibras musculares esqueléticas vivas de ratos por microscopia confocal

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