Name: Fluorometria Sítio-Dirigida Funcional em Células Nativas para Estudo da Excitabilidade do Músculo Esquelético (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T13:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Aprenda fluorometria sítio-dirigida funcional para estudar excitabilidade do músculo esquelético usando fibras musculares murinas. Este método permite rastrear movimentos dos sensores de voltagem do canal Kv1.1 em tempo real.

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Agradecemos ao Dr. J. Vergara (Universidade da Califórnia, Los Angeles) por compartilhar o plasmídeo selvagem EGFP-CaV1.1 (coelho). Agradecemos ao Yale Department of Physiology Electronics Laboratory e especialmente a Henrik Abildgaard pelo projeto e construção do fotodiodo com circuito track and hold. Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do National Institutes of Health R01-AR075726 e R01-NS103777

Fluorometria Funcional Dirigida ao Local em Células Musculares Esqueléticas Nativas

Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.

Aqui, um protocolo passo-a-passo para conduzir FSDF em fibras musculares para o estudo dos movimentos individuais do sensor de voltagem a partir do canal CaV1.1 é descrito. Embora o número de etapas e a diversidade de abordagens combinadas nesta técnica possam parecer complexas, a maioria dessas técnicas é frequentemente usada rotineiramente em laboratórios de biofísicos/biólogos celulares. Assim, a aparente complexidade reside principalmente na combinação de todas as várias abordagens em uma única técnica int...

A capacidade de rastrear rearranjos conformacionais de canais iônicos em resposta a um estímulo elétrico conhecido em uma célula viva é uma fonte de informações valiosas para a fisiologiamolecular1. Os canais iônicos dependentes de voltagem são proteínas de membrana que detectam mudanças na tensão transmembrana, e sua função também é afetada por mudanças de tensão2. O desenvolvimento das técnicas de pinça de voltagem no século passado permitiu aos fisiologistas estudar, em tempo real, as correntes iônicas transportadas por canais iônicos dependentes de voltagem em resposta à despolarização da membrana3. O uso da tecnologia de pinça de voltagem tem sido crucial na compreensão das propriedades elétricas de células excitáveis, como neurônios e músculos. Na década de 1970, o refinamento das pinças de tensão permitiu a detecção de correntes de fechamento (ou movimento de carga) em canais de cálcio (Ca V) e sódio (NaV) dependentes de tensão 4,5. As correntes de gating são correntes capacitivas não-lineares que surgem do movimento de sensores de tensão em resposta a mudanças no campo elétrico através da membrana celular6. As correntes de gating são consideradas uma manifestação elétrica de rearranjos moleculares que precedem ou acompanham a abertura dos canaisiônicos7. Embora essas medições de corrente forneçam informações valiosas sobre a função do canal, tanto as correntes iônicas quanto as correntes de sincronização são leituras indiretas de rearranjos conformacionais inter e intramoleculares de canais dependentes de voltagem7.
A fluorometria sítio-dirigida funcional (FSDF; também conhecida como fluorometria de clamp de voltagem, VCF) foi desenvolvida no inícioda década de 19908 e, pela primeira vez, forneceu a capacidade de visualizar diretamente as mudanças conformacionais locais e a função de uma proteína de canal em tempo real. Usando uma combinação de mutagênese de canais, eletrofisiologia e sistemas de expressão heteróloga, é possível marcar e rastrear fluorescentemente as partes móveis de canais ou receptores específicos em resposta ao estímulo ativador 9,10. Esta abordagem tem sido extensivamente utilizada para estudar os mecanismos de detecção de tensão em canais iônicos dependentes de voltagem 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Para revisões autorizadas, ver 10,20,21,22,23.
Os canais Ca V e NaV, críticos para a iniciação e propagação de sinais elétricos, são compostos por uma subunidade α1 principal, que possui um poro central e quatro domínios de detecção de tensão não idênticos2. Além de sua estrutura primária distinta, os canais de Ca V e NaV são expressos como complexos de multisubunidades com subunidades auxiliares24. Os canais de potássio dependentes de voltagem (K V) consistem em quatro subunidades que se parecem com um único domínio de Na V ou CaV25. A subunidade α1 formadora de poros e sensor de tensão dos canais de Ca V e NaV é formada por um único polipeptídeo que codifica para quatro domínios individuais de seis segmentos transmembrana únicos (S1-S6; Figura 1A) 24,26. A região composta pelos segmentos transmembrana de S1 a S4 forma o domínio de detecção de tensão (VSD) e os segmentos transmembrana de S5 e S6 formam o domínio de poros26. Em cada CIV, a α-hélice S4 contém arginina ou lisina carregada positivamente (Figura 1A,B) que se movem em resposta à despolarização da membrana7. Várias décadas de pesquisa e os resultados de abordagens experimentais altamente diversas suportam a premissa de que os segmentos S4 se movem para fora, gerando correntes de fechamento, em resposta à despolarização da membrana6.
O FSDF mede as mudanças de fluorescência de um corante tiol-reativo conjugado a um resíduo específico de cisteína (isto é, a α-hélice S4) em um canal iônico ou outra proteína, projetada via mutagênese sítio-dirigida, à medida que o canal funciona em resposta à despolarização da membrana ou a outros estímulos10. De fato, o FSDF foi originalmente desenvolvido para investigar se o segmento S4 em canais de KV, proposto para ser o principal sensor de tensão do canal, se move quando as cargas de gating se movem em resposta a mudanças no potencial de membrana 8,10. No caso de canais iônicos dependentes de tensão, o FSDF pode resolver rearranjos conformacionais independentes dos quatro VSDs (rastreando um VSD a qualquer momento), simultaneamente com medições de função de canal. De fato, usando essa abordagem, demonstrou-se que as CIVs individuais parecem estar envolvidas diferencialmente em aspectos específicos da ativação e inativação do canal 12,27,28,29,30. A identificação da contribuição de cada VSD para a função dos canais é de alta relevância e pode ser usada para elucidar melhor a operação do canal e potencialmente identificar novos alvos para o desenvolvimento de fármacos.
O uso de FSDF em sistemas de expressão heteróloga tem sido extremamente útil para aprofundar nossa compreensão da função do canal a partir de uma perspectiva reducionista10,23. Como muitas abordagens reducionistas, apresenta vantagens, mas também tem limitações. Por exemplo, uma grande limitação é a reconstituição parcial do nanoambiente do canal no sistema heterólogo. Frequentemente, os canais iônicos interagem com inúmeras subunidades acessórias e inúmeras outras proteínas que modificam sua função31. Em princípio, diferentes canais e suas subunidades acessórias podem ser expressos em sistemas heterólogos com o uso de múltiplas construções codificadoras de proteínas ou plasmídeos policistrônicos, mas seu ambiente nativo não pode ser totalmente reconstituído30,32.
Nosso grupo publicou recentemente uma variante da FSDF em fibras musculares esqueléticas dissociadas nativas para o estudo dos passos iniciais do acoplamento excitação-contração (CCE)33,34, processo pelo qual a despolarização elétrica das fibras musculares está ligada à ativação da contraçãomuscular35,36. Pela primeira vez, essa abordagem permitiu o rastreamento de movimento de sensores de tensão S4 individuais do canal Ca2+ do tipo L dependente de tensão (CaV1.1, também conhecido como DHPR) no ambiente nativo de uma fibra muscular diferenciada adulta37. Isso foi conseguido considerando múltiplas características desse tipo celular, incluindo a atividade elétrica da célula permitindo a despolarização autopropagada induzida por estimulação rápida, a capacidade de expressar o plasmídeo de cDNA através da eletroporação in vivo, a alta expressão natural e organização compartimental dos canais dentro da célula, e sua compatibilidade com dispositivos de imagem de alta velocidade e gravação eletrofisiológica. Previamente, utilizamos um microscópio confocal de varredura de linha de alta velocidade como dispositivo de detecção37. Agora, uma variação da técnica é apresentada usando um fotodiodo para aquisição do sinal. Este sistema de detecção baseado em fotodiodos poderia facilitar a implementação desta técnica em outros laboratórios.
Aqui, um protocolo passo-a-passo para utilizar FSDF em células nativas para o estudo do movimento individual do sensor de tensão de CaV1.1 é descrito. Embora o canal CaV1.1 tenha sido usado como exemplo ao longo deste manuscrito, esta técnica pode ser aplicada a domínios extracelularmente acessíveis de outros canais iônicos, receptores ou proteínas de superfície.

<table><tbody><tr><td>Hialuronidase</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>H3884-50mg</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL Tubo Eppendorf</td><td>Millipore Sigma</td><td>EP022363719-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td> Ponta de <td>deslizamento tuberculina</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z683531-100EA</td></tr><tr><td>Agulha e seringa de insulina estéril de calibre 29 de comprimento de 1/2" Becton</td><td>Dikinson</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>placa de plástico não revestida de 35 mm</td><td>Falcon, Corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>placa de plástico não revestida de 60 mm</td><td>Falcon, Corning</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Chicote alcoólico</td><td>PDI</td><td>B60307</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-533 cubo LP</td><td>Chroma</td><td>49907</td><td>Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp</td></tr><tr><td>Lâmpada de arco</td><td>Sutter Instrumets</td><td>LB-LS 672</td><td></td></tr><tr><td>Lágrimas artificiais creme</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-162-35</td><td></td></tr><tr><td>Vidro borossilicato Pipeta Pasteur 5 3/4"</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>BTS (N-benzil-p-tolueno sulfonamida)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>203895</td><td></td></tr><tr><td>colagenase tipo I</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>C0130-1g</td><td></td></tr><tr><td>Ponta de algodão</td><td>VWR</td><td>VWR-76048-960-BG</td><td></td></tr><tr><td>Feixe de eletrodos duplos&nbsp; (para eletroporação)</td><td>Aparelho de harvard BTX</td><td>45-0120</td><td>10mm 2 pontas de matriz de agulhas</td></tr><tr><td>EGFP cubo</td><td>Chroma</td><td>39002AT</td><td>Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m</td></tr><tr><td>Aparelho de eletroporação aparelho</td><td>BTX harvard aparelho</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>EPC10</td><td>HEKA Elektronik GmbH&nbsp; (Biociência de Harvard)</td><td>895000</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biotechne,&nbsp; R& D Systems</td><td>RND-S11150H</td><td>Soro Fetal Bovino - Premium, Prato</td></tr> de <tr><td>lamínula de vidro inativado por calor de 35 mm</td><td>MatTek Life Science</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Fluriso (Isoflurano) Líquido para Inalação</td><td>502017-250ml</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento isotérmico</td><td>Braintree scientific inc</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Fisher</td><td>INV-23017015</td><td>Proteína de rato de laminina,</td></tr><tr><td>lâmpada de látex</td> natural <td>VWR</td><td>82024-554</td><td></td></tr><tr><td>LED 530 nm</td><td>Sutter Instrumets</td><td>5A-530</td><td></td></tr><tr><td>Proteína de baixa ligação 0,2 &mu; m filtro estéril</td><td>Pall</td><td>FG4579</td><td>acrodisk&nbsp; filtro de seringa 0.2um supor membrana baixa ligação a proteínas não pirogênica</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>INV-11380037</td><td></td></tr><tr><td>MTS-5-TAMRA</td><td>Biotium</td><td>89410-784</td><td>MTS-5-TAMRA</td></tr><tr><td>Software de Análise OriginPro</td><td>OriginLab Corporation OriginPro</td><td>2022 (64-bit) SR1</td><td></td></tr><tr><td>Fotodiodo</td><td>Feito Sob Medida</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>PlanApo 60x óleo&nbsp; 1.4 N.A/&infin;/0.17</td><td>Olympus</td><td>BFPC2</td><td></td></tr><tr><td>Fio de platina 0.5 mm, 99.9% à base de metais</td><td>SIGMA</td><td>267228-1G</td><td>Para fabricar eletrodo de estimulação de campo</td></tr><tr><td>Gerador de Pulso</td><td>WPI</td><td>Pulsemaster A300</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de acionamento do obturador</td><td>Uniblitz</td><td>100-2B</td><td></td></tr><tr><td>Shuttter</td><td>Uniblitz</td><td>VS2582T0-100</td><td></td></tr><tr><td>S-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>INV-11380037</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de bancada estéril</td><td>VWR</td><td>DSI-B1623</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina estéril</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>S8776</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de elastômero de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>1419447-1198</td><td></td></tr><tr><td>Vaporizador para anestesia</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PK</td><td></td></tr><tr><td>Gerador de tensão</td><td>Custom Made</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorometria sítio-dirigida funcional em células nativas para estudo da excitabilidade do músculo esquelético

Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability

A fluorometria sítio-dirigida funcional tem sido a técnica de escolha para investigar a relação estrutura-função de numerosas proteínas de membrana, incluindo canais iônicos dependentes de voltagem. Esta abordagem tem sido usada principalmente em sistemas de expressão heteróloga para medir simultaneamente as correntes de membrana, a manifestação elétrica da atividade dos canais e medidas de fluorescência, relatando rearranjos de domínio local. A fluorometria sítio-dirigida funcional combina eletrofisiologia, biologia molecular, química e fluorescência em uma única técnica abrangente que permite o estudo de rearranjos estruturais em tempo real e função através de fluorescência e eletrofisiologia, respectivamente. Normalmente, essa abordagem requer um canal de membrana dependente de voltagem projetado que contenha uma cisteína que possa ser testada por um corante fluorescente reativo a tiol. Até recentemente, a química tiol-reativa utilizada para a marcação fluorescente sítio-dirigida de proteínas era realizada exclusivamente em oócitos e linhagens celulares de Xenopus , restringindo o escopo da abordagem a células primárias não excitáveis. Este relato descreve a aplicabilidade da fluorometria sítio-dirigida funcional em células musculares esqueléticas adultas para estudar os passos iniciais do acoplamento excitação-contração, o processo pelo qual a despolarização elétrica das fibras musculares está ligada à ativação da contração muscular. O presente protocolo descreve as metodologias para projetar e transfectar canais de Ca2+ voltagem-dependentes (CaV1.1) em fibras musculares do flexor curto dos dedos de camundongos adultos usando eletroporação in vivo e as etapas subsequentes necessárias para medidas funcionais de fluorometria sítio-dirigida. Esta abordagem pode ser adaptada para estudar outros canais iônicos e proteínas. O uso de fluorometria sítio-dirigida funcional do músculo de mamíferos é particularmente relevante para o estudo de mecanismos básicos de excitabilidade.

Quando potenciais de ação propagadores são acionados em resposta à estimulação de campo repetitivo, é possível rastrear o movimento específico do sensor de voltagem em resposta a uma frequência específica de despolarização. Como mostrado na Figura 6A, o movimento das hélices marcadas com VSD-II pode ser rastreado em resposta a cada uma das duas despolarizações sucessivas aplicadas a 10 Hz (ou seja, espaçadas por 100 ms). O clareamento do sinal pode ser corrigido subtraindo-se a linha de base...

A fluorometria sítio-dirigida funcional é um método para estudar movimentos do domínio de proteínas em tempo real. A modificação desta técnica para sua aplicação em células nativas agora permite a detecção e rastreamento de movimentos de sensores de voltagem únicos a partir de canais de Ca2+ dependentes de voltagem em fibras musculares esqueléticas isoladas de murino.

Fluorometria Sítio-Dirigida Funcional em Células Nativas para Estudo da Excitabilidade do Músculo Esquelético

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, ...

O CaV1.1, um membro dos canais iônicos dependentes de tensão, possui quatro sensores de tensão distintos. Evidências sugerem que alguns sensores de voltagem contribuem mais para a ativação do receptor de rianodina ou corrente de cálcio. Nosso objetivo é ser capaz de identificar o papel preciso de cada sensor de tensão no acoplamento excitação-contração e na ativação do canal de cálcio.O acoplamento excitação-contração tem sido estudado desde o início dos anos 50, mas os detalhes moleculares de como esse processo ocorre ainda são desconhecidos. O recente avanço na estrutura microscópica ciro-eletrônica do canal, a caracterização da nova proteína acessória CaV1.1, a descoberta de uma variante de splicing alternativo do canal e a identificação de mutação causadora de doença reacenderam o interesse neste campo. Muitas técnicas são usadas em nosso campo, desde eletrofisiologia clássica e biologia molecular até técnicas mais novas, como microscopia crioeletrônica, simulação dinâmica molecular, degradação de proteínas direcionadas e fluorometria funcional dirigida por sítio, bem como células projetadas ou modelos animais.Atualmente, o combustível enfrenta diversos desafios experimentais.

functional-site-directed-fluorometry-native-cells-to-study-skeletal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descrevemos os procedimentos detalhados para a transfecção eficiente de DNA plasmidial nas fibras dos músculos do pé de ratos ao vivo usando o eletroporação ea visualização posterior de expressão da proteína através de microscopia de fluorescência.

Transfecção de DNA de mamíferos usando músculos esqueléticos In Vivo Eletroporação

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Este protocolo utiliza eletroporação para introduzir e expressar proteínas marcadas com fluorescência em fibras musculares de camundongos. Após a recuperação após a eletroporação, as fibras são isoladas. As fibras individuais são então visualizadas usando microscopia confocal de alta resolução para visualizar a estrutura muscular.

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Aqui, descrevemos uma metodologia para obter uma população pura de mioblastos humanos a partir do tecido muscular adulto. Essas células são usadas para estudar a diferenciação do músculo esquelético in vitro e, em particular, para estudar proteínas envolvidas na sinalização de Ca 2+ .

Isolamento de mioblastos humanos, avaliação da diferenciação miogênica e medição de entrada de cálcio armazenada

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Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

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