Name: Sensoriamento Elétrico Célula-Substrato para Avaliação em Tempo Real de Perfis Toxicológicos de Estrutura Metal-Orgânica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Aprenda a avaliar perfis toxicológicos de estruturas metal-orgânicas em células epiteliais pulmonares humanas usando ECIS em tempo real. Este método de alta vazão permite monitoramento contínuo sem reagentes externos.

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Este trabalho foi financiado em parte pelo programa T32 do National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) (T32 GM133369) e pela National Science Foundation (NSF 1454230). Além disso, as Instalações de Pesquisa Compartilhadas da WVU e a assistência e suporte em Biofísica Aplicada são reconhecidos.

1. Síntese de ZIF-8
<ol><li>Para a finalidade deste exemplo, use uma relação de massa de 1:10:100 (metal:linker:solvente) para sintetizar o ZIF-8. Para isso, meça o hexahidrato de nitrato de zinco e registre a medição. Utilize o exemplo de razão de massa para calcular a quantidade necessária para o ligante, 2-metilimidazol, e o solvente (ou seja, metanol).</li>
	<li>Coloque o hexahidrato de nitrato de zinco e o ligante em dois frascos de vidro diferentes. Adicionar metade da quantidade calculada de metanol ao hexahidrato de nitrato de zinco e a outra metade ao ligante. Deixe cada solução se dissolver.</li>
	<li>Combine as duas soluções (ou seja, soluções contendo o metal e o ligante, respectivamente). Colocar o recipiente com a solução combinada para a reacção numa placa de agitação e agitar a 700 rpm durante 24 h à temperatura ambiente (TR).</li>
</ol>2. Coleção ZIF-8
<ol><li>Uma vez concluída a reação acima (ou seja, após 24 h), coloque a solução em tubos de centrífuga de 50 mL e centrífuga a 3.075 x g por 5 min (use quantidades iguais e equilibre o rotor). Remova qualquer um dos sobrenadantes dos tubos centrifugados.</li>
	<li>Adicionar metanol (5-15 mL) aos tubos de centrífuga e redispersar as partículas.</li>
	<li>Repita as etapas de centrifugação e lavagem pelo menos mais duas a quatro vezes. Após a última lavagem, descarrega o sobrenadante. NOTA: As etapas de lavagem removem qualquer espécie não precipitada.</li>
	<li>Retire as tampas dos tubos e coloque fita parafilm por cima; Posteriormente, fure o parafilme. Colocar o(s) tubo(s) que contém a amostra numa câmara de vácuo em RT para secar durante 24 horas.</li>
</ol>3. Morfologia da superfície do ZIF-8 (microscopia eletrônica de varredura [MEV])
<ol><li>Monte os pós secos de ZIF-8 em fita de carbono e pulverização por 120 s com paládio de ouro para evitar qualquer carga que possa ocorrer durante a análise de MEV.</li>
	<li>Ajuste a tensão de aceleração do microscópio para 15 kV. Coloque as partículas em foco e ajuste a ampliação (foram usadas ampliações de 500x, 1.000x, 1.500x, 4.000x, 10.000x, 20.000x, 30.000x e 40.000x).</li>
	<li>Imagem das partículas sob a ampliação que permite uma avaliação clara do tamanho das partículas e da morfologia (recomendado para considerar intervalos para partículas de 5 μm, 10 μm e 20 μm).</li>
	<li>Colete dados de pelo menos três campos de visão diferentes e, para cada um, considere ampliações diferentes.</li>
</ol>4. Composição elementar do ZIF-8
<ol><li>Siga as etapas para imagens por MEV.</li>
	<li>Usando a unidade de espectroscopia de energia dispersiva de raios X (EDX) do microscópio de MEV, analise a composição elementar da amostra.</li>
	<li>Verifique se a tensão de aceleração e ampliação do SEM correspondem ao monitor EDX. Desligue a câmera infravermelha no microscópio de MEV.</li>
	<li>No monitor EDX, vá para Coletar espectro e insira um tempo de coleta de 200 s. Isso é recomendado para evitar a carga de partículas e a desintegração que poderiam levar a avaliações falsas.</li>
	<li>Colete dados de pelo menos três campos de visão diferentes. Finalizada a coleta, analise os dados e identifique os elementos de interesse.</li>
</ol>5. Cultura celular
<ol><li>Cultura imortalizou células BEAS-2B em meio suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB) e 0,2% de penicilina/estreptomicina. NOTA: Passagens entre 5-10 devem ser usadas para garantir que nenhuma alteração fenotípica tenha ocorrido anteriormente no lote de células que está sendo usado37 (todos os reagentes estão listados na Tabela de Materiais).</li>
	<li>Pegue uma placa de cultura celular de 100 mm e coloque 10 mL do meio na placa. Adicionar 1 ml da solução de células BEAS-2B à placa.</li>
	<li>Coloque a placa numa incubadora (37 °C, 5% CO2) e deixe as células crescerem.</li>
	<li>Verifique a placa após 24 h para determinar se as células atingiram 80% de confluência. Neste estudo, a confluência de 80% refere-se à porcentagem da superfície coberta por células aderidas. Caso contrário, troque o meio e permita que as células cresçam até que o nível de confluência de 80% seja atingido.</li>
</ol>6. Contagem de células
<ol><li>Uma vez que as células na placa tenham atingido uma confluência de 80%, remova o meio da placa. Lavar a placa com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).</li>
	<li>Remova o PBS da placa. Adicionar 2 mL de tripsina à placa e colocá-la na incubadora (37 °C, 5% CO 2) por2 min.</li>
	<li>Adicione 2 mL de mídia à placa e pipete o meio para cima e para baixo para remover as células da placa. Transferir a solução para um tubo de 15 ml e centrifugar a 123 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Retire o sobrenadante do tubo e adicione 2 mL de meio. Pipetar o meio para cima e para baixo para redispersar as células.</li>
	<li>Com um tubo de 1,5 ml, adicionar 20 μL de azul de tripano e, em seguida, 20 μL da solução celular (proporção de 1:1 de azul de tripano:solução celular).</li>
	<li>Coloque 10 μL da mistura celular numa lâmina de vidro e coloque-a num contador automático de células. Aguarde até que a tela entre em foco e selecione capturar.</li>
	<li>A tela exibe os números de células ao vivo e a viabilidade da célula. A faixa de medição se estende de 1 x 104-1 x 107 células.</li>
	<li>Alternativamente, conte as células manualmente usando um hemocitômetro.<ol><li>Para isso, adicione 15-20 μL da solução de células tratadas com azul de tripano ao hemocitômetro.</li>
		<li>Use um microscópio vertical com foco objetivo de 10x nas linhas de grade do hemocitômetro.</li>
		<li>Conte o número de células nos quatro quadrados externos e divida o número por quatro. Em seguida, multiplique por 10.000 para obter o número de células vivas.</li>
		<li>Para calcular a viabilidade celular, adicione a contagem de células vivas e mortas para obter a contagem total de células e, subsequentemente, divida a contagem de células vivas pela contagem total de células.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Preparação da dose de ZIF-8
<ol><li>Fazer uma solução-mãe ZIF-8 de 1 mg/ml. Para isso, meça a quantidade de ZIF-8 e adicione água deionizada (DI) às partículas para atingir uma concentração de 1 mg/mL.</li>
	<li>Sonicate (ajuste o sonicator para sonics) a solução estoque ZIF-8 por 2 min a intervalos de 30 s em banho-maria.</li>
	<li>Faça diferentes doses de ZIF-8 para exposições celulares calculando a quantidade de solução estoque e o meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) necessário para atingir as doses desejadas usando a equação C 1 V1= C 2 V2. As doses variam de 0-950 μg/mL. NOTA: Neste experimento, foram selecionadas doses de 0 μg/mL, 1 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL e 950 μg/mL.</li>
</ol>8. Concentração inibitória meta-máxima (IC 50)
<ol><li>Após a contagem celular, semear as células BEAS-2B a uma densidade de 4 x 104 células/mL em uma placa de 96 poços, com um volume de 100 μL/poço.<ol><li>Para atingir uma densidade de 4 x 104 células/mL, use C 1 V1= C 2 V 2para calcular a quantidade de solução celular necessária para ser combinada com o meio.</li>
		<li>Garantir a manutenção de poços em branco para cada dose; deixar esses poços vazios até a exposição ao ZIF-8.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque a placa de 96 poços na incubadora a 37 °C e 5% CO2 e deixe as células crescerem para uma monocamada confluente por 24 h.</li>
	<li>Remover o meio dos poços e expor as células BEAS-2B a doses de ZIF-8 que variam de 0-950 μg/mL. Adicionar 100 μL de ZIF-8 aos respectivos poços em branco e celulares.</li>
	<li>Coloque as placas de 96 poços de volta na incubadora por um tempo de exposição de 48 h.</li>
	<li>Após a exposição, adicionar 10 μL de 4-[3-(4-idofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazólio]-1,3-benzeno dissulfonato (WST-1) a cada poço (poços vazios e celulares) e incubar por 2 h. A mídia permanece nos poços; a proporção é de 1:10 (reagente:mídia).</li>
	<li>Leia as mudanças na absorbância em um leitor de placas usando uma absorbância de 485 nm.</li>
	<li>Calcular a viabilidade celular através do software para determinar o valor IC 50 (ver secção10 ).</li>
</ol>9. Sensor elétrico de impedância célula-substrato (ECIS)
<ol><li>Use uma placa de 96 poços (96W10idf) para realizar a análise ECIS. A placa28 contém eletrodos de conexão interdigitalizados cobrindo uma área de cerca de 4 mm2.</li>
	<li>Primeiro, teste se todos os poços estão sendo lidos pelos sensores. Para isso, coloque a placa de 96 poços na estação do poço e clique no botão Configuração .</li>
	<li>Se os poços estiverem conectados corretamente, o verde aparecerá; quaisquer poços não conectados serão identificados como vermelhos. Se esse caso surgir, remova e reinsira a placa do poço e clique no botão Configurar novamente, até que todos os poços ofereçam leituras verdes viáveis.</li>
	<li>Estabilizar os eletrodos por 40 min com 200 μL de meio por poço para evitar deriva de potencial. Adicione 200 μL de meio a cada poço usado e, em seguida, coloque a placa de 96 poços na estação ECIS. Clique em Configurar/Verificar para garantir que a placa esteja conectada corretamente. Clique em Estabilizar.</li>
	<li>Quando a estabilização estiver completa, remova a placa da estação e remova o meio de cada poço.</li>
	<li>Semeando as células BEAS-2B a uma densidade de 4 x 104 células/mL, com um volume de 100 μL por poço, nos poços contendo as células e colocar a placa na estação ECIS na incubadora.</li>
	<li>No monitor, clique em Verificar para determinar se todos os eletrodos são lidos pelos sensores da estação.</li>
	<li>Configure a medição do curso de tempo selecionando Freq/Time Múltiplo (MFT). O programa medirá cada poço em sete frequências diferentes.</li>
	<li>Clique em Iniciar e permita que ele seja executado por 24 h para que as células possam formar uma monocamada confluente.</li>
	<li>Após 24 h, os poços contendo células apresentarão maior resistência no monitor. Este é um indicador de que as células se fixaram aos eletrodos.</li>
	<li>Pressione Pausar no monitor para interromper a coleta de dados.</li>
	<li>Faça as doses de ZIF-8 em, acima e abaixo do valor IC50 calculado, seguindo os passos descritos na secção 7 acima.</li>
	<li>Exponha as nanopartículas ZIF-8 aos seus respectivos poços em branco e celulares a um volume de 100 μL por poço e coloque a placa de 96 poços de volta na estação.</li>
	<li>Clique em Verificar novamente no monitor para garantir que os sensores estão lendo todos os eletrodos. Clique em Retomar e permita que o sistema funcione por 72 h para monitorar o comportamento e a conexão celular.</li>
	<li>Quando a coleta de dados terminar, clique em Concluir no monitor. Para salvar o arquivo, clique em Arquivo > Salvar como. Salve os dados como um arquivo de planilha.</li>
	<li>Para obter os parâmetros alfa, clique em Modelo. Na tela pop-up, clique em Media Only Well, em seguida, selecione o poço que tem apenas mídia.</li>
	<li>Clique em Definir Ref. No monitor, clique em Localizar.</li>
	<li>Se o bem mostrado no sistema não for o mesmo que foi escolhido, repita o passo 9.16.</li>
	<li>Clique em Definir. Clique em Ajustar T-Range para determinar o intervalo de tempo desejado para a coleta de dados.</li>
	<li>Enquanto estiver processando, clique em Alpha. Quando o sistema terminar a análise, clique em Salvar RbA e salve-o como um arquivo de planilha. NOTA: Consulte o manual ECIS, que pode ser encontrado no site do fabricante38.</li>
</ol>10. Análise dos dados
<ol><li>MEV<ol><li>Abra o software de imagem para analisar as imagens de MEV. Clique em Arquivo > Abrir e selecione a imagem a ser analisada.</li>
		<li>Clique em Image > Type > 8 Bits para converter a imagem em tons de cinza para executar a operação de limite.</li>
		<li>Calibrar a medição de distância de pixels a mícrons. Clique na ferramenta Linha reta e trace o comprimento de cada partícula a ser medida.</li>
		<li>Clique em Analisar e, em seguida, em Definir escala. A distância conhecida será definida como o comprimento do tamanho da barra de escala na imagem de MEV. A unidade de comprimento conhecida será definida como mícrons. Verifique Global e pressione Ok.</li>
		<li>Clique na ferramenta Linha reta e trace o diâmetro da partícula e, em seguida, selecione Analisar e medir. Registre o resultado do comprimento.</li>
		<li>Repita para todas as imagens coletadas. Faça a média de todos os diâmetros de pelo menos 60 partículas para uma avaliação estatística adequada.</li>
	</ol></li>
	<li>EDX<ol><li>Faça a média de todas as porcentagens de peso de cada elemento a partir de todas as imagens coletadas (veja a seção EDX acima).</li>
		<li>Usando uma planilha, plote um gráfico de barras de cada elemento no eixo x e sua porcentagem média de peso elementar no eixo y.</li>
	</ol></li>
	<li>CI50<ol><li>Média dos poços em branco e média dos poços de dose para cada repetição.</li>
		<li>Calcule o branco ajustado subtraindo a média em branco do controle da média da dose em branco. Calcular o valor real da célula para cada dose subtraindo o branco ajustado do valor médio da dose.</li>
		<li>Subtrair o valor em branco ajustado para cada dose do valor médio de controle. Calcular a viabilidade celular de cada dose utilizando a equação: viabilidade celular = (valor real da célula/(valor de controle - valor em branco ajustado)) x 100.</li>
		<li>Repita isso para todas as outras replicações.</li>
		<li>Média da viabilidade celular para cada réplica em conjunto para obter a viabilidade celular final para cada dose.</li>
		<li>No software, escolha a guia XY na tela.</li>
		<li>Insira os valores de concentração (dose) na coluna X e a viabilidade celular (%) de cada dose na coluna Y.</li>
		<li>Transforme os valores X clicando em Analisar > Transformar > OK e Transformar X = Log(X).</li>
		<li>Normalize os valores Y selecionando a folha de dados Transformada , clicando em Analisar e, em seguida, selecionando Normalizar.</li>
		<li>Selecione a folha de dados Normalizar da Transformação , clique em Analisar e selecione Regressão Não Linear (Ajuste de Curva). Selecione Dose-Resposta-Inibição e clique em Log(Inibidor) Vs. Inclinação da Variável de Resposta (Quatro Parâmetros). Clique em OK para visualizar os resultados.</li>
	</ol></li>
	<li>ECIS<ol><li>A partir da planilha, pegue as colunas de resistência (ohm) de cada réplica (poços em branco e poços de dose) e faça a média das mesmas a partir da frequência de 4.000 Hz. Essa frequência permite a avaliação do contato célula-célula38.</li>
		<li>Calcular a resistência corrigida subtraindo o branco médio da dose média para cada réplica. Média da resistência corrigida para as repetições para cada dose.</li>
		<li>Repita as mesmas etapas para os valores alfa para calcular o parâmetro alfa médio. Plotar o eixo x como tempo (h) e o eixo y como os valores médios de resistência/alfa para cada valor de dose.</li>
	</ol></li>
</ol>11. Análise estatística
<ol><li>MEV<ol><li>Realizar um desvio padrão no arquivo de planilha eletrônica onde foram calculados os diâmetros médios das partículas ZIF-8.</li>
		<li>Utilizando a função STDEV na planilha, realce os dados das 60 partículas e clique em Enter. Gráfico do desvio padrão para cada diâmetro médio calculado.</li>
	</ol></li>
	<li>EDX<ol><li>Semelhante à MEV (passos 11.1.1-11.1.2), calcule o desvio padrão para cada composição elementar média usando a função STDEV na planilha. Grafar os desvios padrão para cada composição elementar média.</li>
	</ol></li>
	<li>CI50<ol><li>Abra o software utilizado para calcular o IC50 e clique em Ficha Agrupada.</li>
		<li>Insira as doses de ZIF-8 nas linhas rotuladas Grupo A, Grupo B, etc. Introduzir a viabilidade celular média para cada dose e replicar na coluna correspondente à dose ZIF-8.</li>
		<li>Clique em Analisar e, em Análises de coluna, selecione ANOVA unidirecional (não paramétrica ou mista).</li>
		<li>Na guia Experimental , selecione Sem correspondência ou emparelhamento. Em Distribuição Gaussiana de Resíduos, selecione Sim usar ANOVA. Finalmente, selecione Yes Use Ordinary ANOVA Test em Assume Equal SDs.</li>
		<li>Na guia Comparações Múltiplas , selecione Comparar a Média de Cada Coluna com a Média de uma Coluna de Controle. Clique em OK para visualizar os resultados.</li>
	</ol></li>
</ol>

Avaliando as alterações de comportamento celular induzidas por MOF por detecção elétrica de substrato celular

Os autores declaram não haver conflitos de interesse neste trabalho.

Análises anteriores mostraram que o ECIS poderia ser usado para avaliar o comportamento de células expostas a analitos (i.e., nanotubos de carbono35, fármacos43 ou nanoargilas16). Além disso, Stueckle e col. avaliaram a toxicidade de células BEAS-2B expostas a nanoargilas e seus subprodutos e verificaram que o comportamento celular e a fixação eram dependentes das características físico-químicas desses materiais42. Neste traba...

Estruturas metal-orgânicas (MOFs) são híbridos formados através da combinação de íons metálicos e ligantes orgânicos 1,2 em solventes orgânicos. Devido à variedade dessas combinações, os MOFs possuem diversidade estrutural3, porosidade ajustável, alta estabilidade térmica e altas áreas superficiais 4,5. Tais características os tornam candidatos atraentes em uma variedade de aplicações, desde o armazenamento de gás 6,7 até a catálise8,9 e dos agentes de contraste 10,11 para unidades de liberação de fármacos12,13. No entanto, a implementação de MOFs em tais aplicações tem levantado preocupações relativas à sua segurança tanto para os usuários quanto para o meio ambiente. Estudos preliminares demonstraram, por exemplo, que a função e o crescimento celular mudam com a exposição das células a íons metálicos ou ligantes utilizados para síntese de MOF 1,14,15. Por exemplo, Tamames-Tabar e colaboradores demonstraram que o ZIF-8 MOF, um MOF baseado em Zn, estava levando a mais mudanças celulares em uma linhagem de células de câncer cervical humano (HeLa) e uma linhagem de células de macrófagos de camundongo (J774) em relação a MOFs baseados em Zr e Fe. Tais efeitos foram presumivelmente devidos ao componente metálico do ZIF-8 (i.e., Zn), que poderia potencialmente induzir apoptose celular após a desintegração do arcabouço e liberação do íon Zn1. Da mesma forma, Gandara-Loe e col. demonstraram que o HKUST-1, um MOF à base de, causou a maior redução na viabilidade celular do retinoblastoma de camundongo quando usado em concentrações de 10 μg/mL ou mais. Presumivelmente, isso ocorreu devido ao íon metálico incorporado durante a síntese desse arcabouço, que, uma vez liberado, poderia induzir estresse oxidativo nas células expostas15.
Além disso, a análise mostrou que a exposição a MOFs com diferentes características físico-químicas pode levar a respostas variadas das células expostas. Por exemplo, Wagner e col. demonstraram que ZIF-8 e MIL-160 (um framework baseado em Al), usados na exposição de uma célula epitelial brônquica humana imortalizada, levaram a respostas celulares dependentes das propriedades físico-químicas dos frameworks, ou seja, hidrofobicidade, tamanho e características estruturais16. Complementarmente, Chen e col. demonstraram que uma concentração de 160 μg/mL de MIL-100(Fe) exposta a células hepáticas humanas normais (HL-7702) causou a maior perda na viabilidade celular, presumivelmente devido ao componente metálico desse quadro específico (i.e., Fe17).
Enquanto esses estudos categorizam os efeitos deletérios dos MOFs sobre os sistemas celulares com base em suas características físico-químicas e concentrações de exposição, levantando preocupações potenciais com a implementação do framework, especialmente em áreas biomédicas, a maioria dessas avaliações é baseada em ensaios colorimétricos de ponto único de tempo. Por exemplo, demonstrou-se que, quando ensaios de brometo de tetrazólio (MTT) e sal de tetrazólio solúvel em água (WST-1), brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) e sal de tetrazólio solúvel em água (WST-1), esses reagentes bioquímicos poderiam levar a falsos positivos em suas interações com as partículas às quais as células também foram expostas18. O sal de tetrazólio e os reagentes vermelhos neutros demonstraram alta afinidade de adsorção ou ligação às superfícies das partículas, resultando em interferência do sinal do agente19. Além disso, para outros tipos de ensaios, como a citometria de fluxo, que já se mostrou utilizada para avaliar alterações em células expostas a MOFs20,21, demonstrou-se que grandes questões precisam ser contornadas para que uma análise viável dos efeitos deletérios das partículas seja considerada. Em particular, intervalos de detecção do tamanho das partículas, especialmente em populações mistas como as oferecidas por MOFs ou referências das partículas usadas para calibração antes de mudanças celulares, devem ser abordados22. Também foi demonstrado que o corante utilizado durante a marcação celular para tais ensaios de citometria também poderia interferir com as nanopartículas às quais as células foram expostas23.
O objetivo deste estudo foi usar um ensaio de avaliação em tempo real e de alto rendimento para avaliar mudanças no comportamento celular após a exposição a um MOF selecionado. Avaliações em tempo real podem ajudar a fornecer insights sobre os efeitos dependentes do tempo, relacionados às janelas de exposição16. Além disso, fornecem informações sobre mudanças nas interações célula-substrato, morfologia celular e interação célula-célula, bem como como tais mudanças dependem das propriedades físico-químicas dos materiais de interesse e tempos de exposição24,25, respectivamente.
Para demonstrar a validade e aplicabilidade da abordagem proposta, foram utilizadas células epiteliais brônquicas humanas (BEAS-2B), ZIF-8 (uma estrutura hidrofóbica de imidazolato zeolítico16) e sensor elétrico de impedância célula-substrato (ECIS). As células BEAS-2B representam um modelo de exposição pulmonar 26 e têm sido utilizadas anteriormente para avaliar alterações na exposição das células às nanoargilas e seus subprodutos degradados termicamente26,27,28, bem como avaliar a toxicidade de nanomateriais, como os nanotubos de carbono de parede simples (SWCNTs)18. Além disso, tais células têm sido utilizadas há mais de 30 anos como modelo para a função epitelial pulmonar29. O ZIF-8 foi escolhido devido à sua ampla implementação em catálise30 e como agentes de contraste 31 para bioimagem e liberação de fármacos32 e, portanto, pelo potencial estendido de exposição pulmonar durante tais aplicações. Por fim, a ECIS, técnica não invasiva em tempo real, foi previamente utilizada para avaliar alterações na aderência, proliferação, motilidade e morfologia celular 16,26 como resultado de uma variedade de interações entre analitos (materiais e fármacos) e células expostas em tempo real 16,18,28. A ECIS utiliza uma corrente alternada (CA) para medir a impedância de células imobilizadas em eletrodos de ouro, com as mudanças de impedância fornecendo informações sobre mudanças na resistência e capacitância na interface célula-substrato ouro, função de barreira induzida por interações célula-célula e cobertura da camada sobre-célula desses eletrodos de ouro33,34. O uso do ECIS permite medidas quantitativas em resolução nanométrica de forma não invasiva e em tempo real26,34.
Este estudo avalia e compara a simplicidade e facilidade de avaliação das mudanças induzidas por FMOS no comportamento celular em tempo real com avaliações de ensaio de ponto único. Tal estudo poderia ser extrapolado para avaliar perfis celulares em resposta à exposição a outras partículas de interesse, permitindo assim testes de partículas seguros por projeto e subsequentemente ajudando na implementação. Além disso, este estudo poderia complementar ensaios genéticos e celulares que são avaliações pontuais. Isso poderia levar a uma análise mais informada dos efeitos deletérios das partículas sobre a população celular e poderia ser usado para rastrear a toxicidade dessas partículas de maneira de alto rendimento16,35,36.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Dissulfonato de 4-[3-(4-idofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazólio]-1,3-benzeno (ensaio WST-1)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>5015944001</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>Placas Gibco</td><td>25255-056</td><td></td></tr> de <tr><td>100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>1300 Série A2 capa de biofumo</td><td>Thermo Scientific</td><td>323TS</td><td></td></tr><tr><td>2510 Branson sonicador de banho</td><td>Equipamento de processo e Supply, Inc.&nbsp;</td><td>251OU-DTH</td><td></td></tr><tr><td>2-metilimidazol, 97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>693-98-1</td><td></td></tr><tr><td>5 mL microtubo estéril</td><td>Argos Technologies</td><td>T2076S-CA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL&nbsp; tubos&nbsp;</td>Placas de poço <td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>96W10idf</td><td>Biofísica Aplicada&nbsp;</td><td>96W10idf PET</td><td></td></tr><tr><td>96 placas de poços</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012931</td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>Biorender N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Countess cell counting chamber slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL contador automatizado de células</td><td>Life Technologies</td><td>C0916-186A-0303</td><td></td></tr><tr><td>Denton Desk V pulverizador catódico e revestidor de carbono</td><td>Denton Vacuum</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dimetly sulfóxido&nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>DPBS/Cytiva Modificado</td><td></td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Meio Eagle modificado da Dulbecco</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>ECIS-Z&Theta;</td><td>Biofísica Aplicada&nbsp;</td><td>ABP 1129</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Versão 2301</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon (15 mL)</td><td>Corning</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Gibco</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas FLUOstar OPTIMA</td><td>BMG LABTECH</td><td>413-2132</td><td></td></tr><tr><td>Software GraphPad Prism (9.0.0)</td><td>Software GraphPad, LLC</td><td>Versão 9.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora HERAcell 150i CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>50116047</td><td></td></tr><tr><td>Hitachi S-4700 Microscópio eletrônico de varredura por emissão de campo equipado com raios-X dispersivos de energia&nbsp;</td><td>Hitachi High-Technologies Corporation</td><td>S4700 e software</td><td></td>de análise EDAX TEAM</tr><tr><td>Software ImageJ software</td><td>National Institutes of Health</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Células epiteliais brônquicas humanas imortalizadas</td> American <td>Type Culture Collection</td><td>CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp freezer</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol, 99%</td><td>Fisher Chemical</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Filme de vedação de parafilme</td><td>The Lab Depot</td><td>HS234526A</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Steptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R Centrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004220</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall T 6000B</td><td>DU PONT</td><td>&nbsp; T6000B</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, solução a 0,4% em PBS</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>1691049</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de Vácuo</td><td>Belart</td><td>999320237</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de Zinco Hexahidratado, 98% extra puro</td><td>Acros Organic</td><td>101-96-18-9</td><td></td></tr></tbody></table>

sensoriamento elétrico célula-substrato para avaliação em tempo real de perfis toxicológicos de estrutura metal-orgânica

Electric Cell-Substrate Sensing for Real-Time Evaluation of Metal-Organic Framework Toxicological Profiles

Estruturas metal-orgânicas (MOFs) são híbridos formados através da coordenação de íons metálicos e ligantes orgânicos em solventes orgânicos. A implementação de MOFs em aplicações biomédicas e industriais tem gerado preocupações quanto à sua segurança. Neste estudo, o perfil de um MOF selecionado, um quadro de imidazol zeolítico, foi avaliado após exposição a células epiteliais pulmonares humanas. A plataforma de avaliação foi uma técnica em tempo real (i.e., sensor elétrico de impedância célula-substrato [ECIS]). Este estudo identifica e discute alguns dos efeitos deletérios da MOF selecionada sobre as células expostas. Além disso, este estudo demonstra os benefícios do uso do método em tempo real versus outros ensaios bioquímicos para avaliações celulares abrangentes. O estudo conclui que as mudanças observadas no comportamento celular podem sugerir uma possível toxicidade induzida pela exposição a MOFs de diferentes características físico-químicas e à dosagem desses referenciais que estão sendo utilizados. Ao compreender as mudanças no comportamento celular, prevê-se a capacidade de melhorar estratégias seguras de MOFs a serem usadas para aplicações biomédicas, adaptando especificamente suas características físico-químicas.

Usando uma linhagem celular modelo in vitro comum 39 (BEAS-2B), este estudo teve como objetivo demonstrar a viabilidade e aplicabilidade do ECIS para avaliar mudanças no comportamento celular após exposição a um MOF sintetizado em laboratório. A avaliação dessas alterações foi complementada pela análise por meio de ensaios colorimétricos convencionais.
As características físico-químicas do framework foram primeiramente avaliadas para garantir a reprodutibilidad...

O estudo a seguir avalia o perfil toxicológico de uma estrutura metal-orgânica selecionada utilizando sensor de impedância de substrato de célula elétrica (ECIS), uma técnica de triagem de alto rendimento em tempo real.

Sensoriamento Elétrico Célula-Substrato para Avaliação em Tempo Real de Perfis Toxicológicos de Estrutura Metal-Orgânica

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of ...

Minha pesquisa visa avaliar mudanças no comportamento de células epiteliais pulmonares humanas frente à exposição a estruturas orgânicas metálicas, híbridos formados pela combinação de íons metálicos em ligantes orgânicos em solventes orgânicos. Esta pesquisa demonstrou que a composição física e química de estruturas orgânicas metálicas, bem como suas razões de exposição celular, afeta o comportamento de células epiteliais pulmonares humanas de forma tempo-dependente e dose-dependente. Isso pode ser registrado em uma alta taxa de transferência em tempo real.Nossa pesquisa ajuda a avaliar, compreender os mecanismos de toxicidade de estruturas orgânicas metálicas após a exposição a sistemas celulares. O método atual permite o monitoramento contínuo das células em tempo real e de alta produtividade. Além disso, esse método não depende de reagentes externos e, portanto, reduz qualquer possível interferência que eles possam ter com as estruturas usadas para exposição.Nosso laboratório continuará a se concentrar em entender e avaliar os mecanismos de toxicidade associados à exposição a nanomateriais, bem como usar essas informações para sintetizar sistemas novos e seguros que possam ser implementados em aplicações biomédicas com riscos mínimos para o usuário ou para o meio ambiente.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

O transistor Electrochemical orgânica é integrado com células vivas e utilizado para monitorizar o fluxo de iões através da barreira epitelial gastrointestinal. Neste estudo, um aumento no fluxo de iões, relacionada com a ruptura das junções apertadas, induzida pela presença de EGTA quelante de cálcio (ácido etileno glicol-bis (éter de beta-aminoetilo)-N, N, N ', N'-tetra-acético ácido), é medida.

Sensoriamento de Barreira rompimento do tecido com um transistor Eletroquímica Orgânica

Ensaios aprimorados de neurotoxicidade in vitro ajudariam na identificação de novos compostos neuroprotetores. A utilidade de um analisador celular baseado em impedância em tempo real para determinar a citotoxicidade e citoproteção em linhagens celulares neuronais e delinear o envolvimento das vias do segundo mensageiro, obtendo assim informações sobre o mecanismo de neuroproteção é apresentada.

Analyzer celular baseado em impedância Real-Time como uma ferramenta para delinear vias moleculares envolvidas na neurotoxicidade e neuroproteção em uma linha de células neuronais

Este manuscrito descreve como preparar biochips fluídicos com células epiteliais branquiais de truta arco-íris para uso em um sensor de impedância de substrato de célula elétrica portátil de campo.  O protocolo para executar um teste rápido de toxicidade da água potável com o sensor também é descrito.

Preparação e Teste de impedância baseado em Biochips fluídicas com células RTgill-W1 para avaliação rápida das amostras de água para a toxicidade

O objetivo do estudo foi avaliar o impacto biológico de 15 constituintes da fumaça de cigarro usando uma combinação de um analisador de células em tempo real baseado em impedância e uma plataforma baseada em triagem de alto conteúdo (HCS) para avaliação toxicológica in vitro. Este estudo fornece informações sobre doses efetivas, toxicidade e modos de ação dos compostos testados.

Análise alto teor de triagem para avaliar os efeitos toxicológicos de Constituintes nocivas e potencialmente prejudiciais (HPHC)

Este protocolo descreve uma estratégia geral para regenerar microeletrodos de ouro matriz comerciais equipados para um analisador de célula livre de rótulo visto economia sobre as alta execução custos ofmicrochip ensaios baseados. O processo de regeneração inclui digestão do trypsin, enxaguando com água, etanol e uma etapa de fiação, que permite o uso repetido de microchips.

Regeneração da matriz microeletrodos ouro equipado para um analisador de celular em tempo real

Este manuscrito descreve o uso de repórteres fluorogenic geneticamente codificado em um aplicativo de imagem latente da viver-pilha para o exame de estresse oxidativo induzido por xenobiótico. Esta abordagem experimental oferece inigualável resolução spatiotemporal, sensibilidade e especificidade, evitando muitas das deficiências dos métodos convencionais utilizados para a detecção de estresse oxidativo toxicológico.

Abordagens para avaliação de estresse oxidativo toxicológico usando sensores Fluorogenic geneticamente codificado de imagem

Este procedimento foi estabelecido para ser utilizado para o desenvolvimento de culturas hepáticas 3D avançadas in vitro, que podem fornecer uma avaliação mais fisiologicamente relevante dos perigos genotoxicos associados a exposições nanomateriais em regimes de dose aguda ou a longo prazo.

Modelos avançados de fígado 3D para testes de genotoxicidade in vitro após exposição nanomaterial de longo prazo

Aqui, apresentamos o protocolo de fabricação de um dispositivo orgânico de efeito de campo modulado por carga (OCMFET) para interligação celular in vitro . O dispositivo, chamado de micro OCMFET array, é um dispositivo flexível, de baixo custo e sem referência, que permitirá o monitoramento das atividades elétricas e metabólicas das culturas de células eletroativas.

In vitro Análise celular multiparamétrica por micro matrizes transistores moduladas por carga orgânica

Levantamentos magnéticos ex situ podem fornecer diretamente informações locais e em massa em um eletrodo magnético para revelar seu mecanismo de armazenamento de carga passo a passo. Neste trabalho, a ressonância magnética eletrônica (VHS) e a suscetibilidade magnética são demonstradas para monitorar a avaliação de espécies paramagnéticas e sua concentração em uma estrutura metal-orgânica redox-ativa (MOF).

Caracterização Magnetométrica de Intermediários na Eletroquímica do Estado Sólido de Estruturas Redox-Metal Ativo-Orgânicas

Este trabalho discutiu o protocolo para projetar e desenvolver um dispositivo E-Eye-Enable POCT para detectar Fe, Cr, As e F em amostras ambientais, amostras biológicas e alimentos e bebidas. Quase 2000 amostras foram testadas e os resultados estão de acordo com a técnica padrão-ouro.

Técnica avançada de detecção E-Eye guiada por TD-DFT para quantificação no local de Fe, Cr, F e As em amostras ambientais, biológicas e de alimentos

Aprenda a avaliar perfis toxicológicos de estruturas metal-orgânicas em células epiteliais pulmonares humanas usando ECIS em tempo real. Este método de alta vazão permite monitoramento contínuo sem reagentes externos.

Sensoriamento Elétrico Célula-Substrato para Avaliação em Tempo Real de Perfis Toxicológicos de Estrutura Metal-Orgânica

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