Name: Inibição Optogenética da Contratilidade da Actomiosina Mediada por Rho1 Juntamente com a Medida da Tensão Epitelial em Embriões de Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Aprenda a inibir optogeneticamente a contratilidade da actomiosina mediada por Rho1 e medir a tensão epitelial em embriões de Drosophila. Este método permite controlar temporalmente as forças mecânicas em morfogênese tecidual.

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Os autores agradecem a Ann Lavanway pelo suporte de imagem. Os autores agradecem ao laboratório Wieschaus e ao laboratório De Renzis pelo compartilhamento de reagentes e ao Bloomington Drosophila Stock Center pelos estoques de moscas. Este estudo é apoiado pelo R35GM128745 NIGMS ESI-MIRA e American Cancer Society Institutional Research Grant #IRG-82-003-33 para BH.

Inibição optogenética da contratilidade da actomiosina mediada por Rho1 em Drosophila

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Este protocolo descreveu o uso combinado de optogenética e ablação a laser para sondar mudanças na tensão tecidual imediatamente após a inativação da contratilidade da actomiosina. A ferramenta optogenética aqui descrita aproveita a forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN) para inibir agudamente a contratilidade endógena de Rho1 e actomiosina dependente de Rho1. A caracterização prévia do Opto-Rho1DN no contexto da formação do sulco ventral de Drosophila demonstrou que a ferramenta é altamente eficaz em mediar ...

A contratilidade da actomiosina, força contrátil exercida pela miosina II não muscular (doravante denominada "miosina") sobre a rede de actina-F, é uma das forças mais importantes na mudança da forma celular e na condução da morfogênese tecidual 1,2. Por exemplo, a ativação da contratilidade da actomiosina no domínio apical das células epiteliais resulta em constrição apical, o que facilita uma variedade de processos morfogenéticos, incluindo dobramento epitelial, extrusão celular, delaminação e cicatrização de feridas 3,4,5,6,7 . A ativação da miosina requer a fosforilação de sua cadeia leve reguladora. Essa modificação alivia a conformação inibitória das moléculas de miosina, permitindo que elas formem feixes filamentares de miosina bipolar com múltiplos domínios de cabeça em ambas as extremidades. Os filamentos bipolares de miosina conduzem o movimento antiparalelo dos filamentos de actina e resultam na geração de força contrátil 1,8,9.
A pequena GTPase RhoA (Rho1 em Drosophila) conservada evolutivamente desempenha um papel central na ativação da contratilidade da actomiosina em vários contextos celulares10,11. Rho1 funciona como um interruptor bimolecular, ligando-se a GTP (forma ativa) ou GDP (forma inativa)12. A ciclagem entre Rho1 ligado ao GTP ou GDP-bound é regulada por suas proteínas ativadoras de GTPase (GAPs) e fatores de troca de nucleotídeos guanina (GEFs)13. Os GEFs funcionam para facilitar a troca de PIB por GTP e, assim, ativar a atividade Rho1. Os GAPs, por outro lado, aumentam a atividade GTPase de Rho1 e, assim, desativam Rho1. O Rho1 ativado promove a contratilidade da actomiosina interagindo e ativando seus efetores a jusante, a quinase associada ao Rho (Rok) e a diáfana14. Rok induz a ativação da miosina e a contratilidade da actomiosina fosforilando a cadeia leve reguladora da miosina15. Além disso, Rok também inibe a fosfatase de cadeia leve reguladora da miosina e, portanto, promove ainda mais a montagem do filamento de miosina16. Rok também pode fosforilar LIM quinases, que, quando ativadas, impedem a desmontagem da actina fosforilando e inibindo o fator de despolimerização da actinacofilina 17,18. O diáfano é um nucleador de actina da família das forminas que promove a polimerização da actina, fornecendo uma base para a miosina interagir com 19,20,21.
Embora os mecanismos celulares que ativam a contratilidade da actomiosina tenham sido bem elucidados, nossa compreensão de sua função na regulação do remodelamento dinâmico tecidual permanece incompleta. O preenchimento dessa lacuna de conhecimento requer abordagens que possam inativar rapidamente a actomiosina em regiões específicas do tecido in vivo e registrar o impacto imediato no comportamento e nas propriedades teciduais. Este protocolo descreve o uso de uma abordagem optogenética para inibir agudamente a contratilidade da actomiosina durante a invaginação do mesoderma de Drosophila, seguida de medição da tensão epitelial usando ablação a laser. Durante a gastrulação de Drosophila, as células precursoras do mesoderma localizadas ventralmente sofrem constrição apical e invaginam a partir da superfície do embrião, formando um sulco orientado anteroposterior22,23. A formação de sulcos ventrais tem sido utilizada há muito tempo como modelo para o estudo do mecanismo de dobramento epitelial. A formação do sulco ventral é administrada pelo sistema de padronização dorso-ventral em Drosophila24,25,26,27. A expressão de dois fatores de transcrição, Twist e Snail, localizados na face ventral do embrião, controla a formação do sulco ventral e especifica o destino das células mesodérmicas28. Twist e Snail ativam o recrutamento do Rho1 GEF RhoGEF2 para o ápice das células precursoras do mesoderma através de uma via de receptor acoplado à proteína G e uma proteína adaptadora RhoGEF2, T48 29,30,31,32,33. Em seguida, o RhoGEF2 ativa a miosina em toda a superfície apical do mesoderma potencial através da via Rho-Rho quinase 34,35,36,37,38,39. A miosina ativada forma uma rede supracelular de actomiosina em toda a superfície apical do mesoderma primórdio, cujas contrações conduzem a constrição apical e resultam em rápido aumento da tensão tecidual apical14,37,40.
A ferramenta optogenética descrita neste protocolo, Opto-Rho1DN, inibe a contratilidade da actomiosina através do recrutamento da membrana plasmática dependente de luz azul de uma forma dominante negativa de Rho1 (Rho1DN)41. Uma mutação T19N em Rho1DN elimina a capacidade da proteína mutante de trocar GDP por GTP e, assim, torna a proteína perpetuamente inativa34. Uma mutação subsequente em Rho1DN, C189Y, elimina seu sinal de direcionamento de membrana virgens42,43. Quando Rho1DN é infundido à membrana plasmática, ele se liga e retém Rho1 GEFs, bloqueando assim a ativação de Rho1, bem como a ativação de miosina e actina mediada por Rho134,44. O recrutamento da membrana plasmática de Rho1DN é obtido através de um módulo de dimerização dependente de luz derivado do Cryptochrome 2 e seu parceiro de ligação CIB1. O criptocromo 2 é um fotorreceptor de criptocromo ativado pela luz azul em Arabidopsis thaliana45. O criptocromo 2 liga-se à CIB1, uma proteína básica hélice-alça-hélice, apenas em seu estado fotoexcitado45. Posteriormente, verificou-se que a região conservada N-terminal, fotoliase homologia (PHR), do Criptocromo 2 (CRY2PHR, doravante denominada CRY2) e o domínio N-terminal (aa 1-170) do CIB1 (doravante CIBN) são importantes para a dimerização induzida pela luz46. Opto-Rho1DN contém dois componentes. O primeiro componente é a proteína CIBN fusionada com uma âncora CAAX, que localiza a proteína na membrana plasmática47. O segundo componente é o mCherry-tagged CRY2 fundido com Rho1DN41. Na ausência de luz azul, CRY2-Rho1DN permanece no citoplasma. Após a estimulação com luz azul, o CRY2-Rho1DN é direcionado para a membrana plasmática através da interação entre CIBN ancorado na membrana e CRY2 excitado. Opto-Rho1DN pode ser ativado por luz ultravioleta A (UVA) e luz azul (400-500 nm, pico de ativação em 450-488 nm), ou por um laser pulsado de 830-980 nm ao realizar estimulação de dois fótons41,46,47,48. Portanto, Opto-Rho1DN é estimulado por comprimentos de onda normalmente usados para excitar GFP (488 nm para imagens de fóton único e 920 nm para imagens de dois fótons). Em contraste, comprimentos de onda comumente usados para excitar mCherry (561 nm para imagens de fóton único e 1.040 nm para imagens de dois fótons) não estimulam o módulo optogenético e, portanto, podem ser usados para imagens de pré-estimulação. O protocolo descreve as abordagens utilizadas para minimizar o risco de estimulação indesejada durante a manipulação da amostra.
A ablação a laser tem sido extensivamente empregada para detectar e medir a tensão em células e tecidos49. Estudos anteriores mostraram que, quando a intensidade do laser é adequadamente controlada, a ablação com laser de dois fótons empregando um laser infravermelho próximo de femtossegundo pode prejudicar fisicamente algumas estruturas subcelulares (por exemplo, redes de actomiosina cortical) sem causar arrebatamento da membrana plasmática50,51. Se o tecido estiver sob tensão, a ablação a laser de uma região de interesse dentro do tecido resulta em um recuo externo imediato das células adjacentes à região ablada. A velocidade de recuo é função da magnitude da tensão e da viscosidade do meio (citoplasma) que circunda as estruturas submetidas ao recuo49. Devido à profundidade de penetração superior dos lasers de infravermelho próximo e à capacidade de alcançar uma ablação focal bem confinada, a ablação a laser de dois fótons é particularmente útil para detectar tensão tecidual in vivo. Como demonstrado neste protocolo, este método pode ser facilmente combinado com a inativação da contratilidade da actomiosina mediada por Opto-Rho1DN para investigar o impacto direto da contratilidade celular Rho1-dependente na mecânica tecidual durante a remodelação dinâmica tecidual.

<table><tbody><tr><td>Prato com fundo de vidro de 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>Utilizado para preparação de amostras</td></tr><tr><td>60 mm &vezes; Placa de Petri de 15 mm com tampa</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td>Utilizado para preparação de amostras</td></tr><tr><td>Pano preto para cobrir o microscópio</td><td>Online</td><td>NA</td><td>Utilizado para evitar estimulação indesejada da luz</td></tr><tr><td>Alvejante Clorox Ultra Germicada (hipoclorito de sódio a 8,25%)</td><td>VWR</td><td>10028-048</td><td>Usado para descorinação de embriões</td></tr><tr><td>CO2 pad</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td>Usado para configuração cruzada</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Usado para preparação de amostras</td></tr><tr><td>Pinças Dumont Style 5</td><td>VWR</td><td>102091-654</td><td>Usado para preparação</td></tr><tr><td>de amostras Ferramenta de cílios (feita de pincel redondo de zibelina vermelha pura #2)</td><td>VWR</td><td>22940-834</td><td>Usado para preparação de amostras</td></tr><tr><td>FluoView (Software)</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>Usado para aquisição de imagens e estimulação optogenética</td></tr><tr><td>Óleo de halocarbono 27</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8773-100ML</td><td>Usado para visualização do estágio embrionário</td></tr><tr><td>ImageJ/FIJI</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>Usado para análise de imagens</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>NA</td><td>Usado para análise de imagens</td></tr><tr><td>Estereoscópio Nikon SMZ-745</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Usado para preparação de amostras</td></tr><tr><td>Microscópio multifotônico Olympus FVMPE-RS com lasers ultrarrápidos de linha dupla InSight DS para imagens multifotônicas simultâneas de comprimento de onda duplo, uma objetiva de imersão em água 25x/NA1.05 (XLPLN25XWMP2) e uma unidade de estimulação IR/VIS para fotoativação/estimulação. Este sistema também está equipado com um filtro TRITC (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M) e uma unidade de iluminação de fluorescência que emite luz branca.</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>Usado para aquisição de imagens e estimulação optogenética</td></tr><tr><td>Caixa de armazenamento de freezer de polipropileno SP Bel-Art de 100 lugares (caixa preta à prova de luz para transferência de amostras)</td> <td>VWR</td><td>30621-392</td><td>Usado para evitar estimulação de luz indesejada</td></tr><tr><td>Escudo de filtro UV para fluores FM1403 (escudo de plástico vermelho-alaranjado)</td> <td>Bolioptics</td><td>FM14036151</td><td>Usado para evitar estimulação</td></tr> <tr><td>de luz indesejadaFarol VITCHELO V800 com luzes LED brancas e vermelhas</td><td>Amazon</td><td>NA</td><td>Usado para evitar estimulação de luz indesejada</td></tr></tbody></table>

inibição optogenética da contratilidade da actomiosina mediada por rho1 juntamente com a medida da tensão epitelial em embriões de drosophila

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

As forças contráteis geradas pela actina e pela miosina não muscular II ("contratilidade da actomiosina") são críticas para alterações morfológicas de células e tecidos em múltiplas escalas de comprimento, tais como divisão celular, migração celular, dobramento epitelial e morfogênese ramificada. Uma compreensão profunda do papel da contratilidade da actomiosina na morfogênese requer abordagens que permitam a rápida inativação da actomiosina, o que é difícil de ser alcançado usando abordagens genéticas ou farmacológicas convencionais. O protocolo apresentado demonstra o uso de um sistema de dimerização optogenética baseado em CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, para inibir a contratilidade da actomiosina em embriões de Drosophila com controles temporais e espaciais precisos. Neste sistema, CRY2 é fundido à forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN), enquanto CIBN é ancorado à membrana plasmática. A dimerização mediada pela luz azul de CRY2 e CIBN resulta em rápida translocação de Rho1DN do citoplasma para a membrana plasmática, onde inativa a actomiosina inibindo Rho1 endógeno. Além disso, este artigo apresenta um protocolo detalhado para acoplamento da inativação da actomiosina mediada por Opto-Rho1DN com ablação a laser para investigar o papel da actomiosina na geração de tensão epitelial durante a formação do sulco ventral de Drosophila . Este protocolo pode ser aplicado a muitos outros processos morfológicos que envolvem a contratilidade da actomiosina em embriões de Drosophila com modificações mínimas. Em geral, esta ferramenta optogenética é uma abordagem poderosa para dissecar a função da contratilidade da actomiosina no controle da mecânica tecidual durante o remodelamento dinâmico tecidual.

Nos embriões não estimulados submetidos à constrição apical, o Sqh-mCherry enriqueceu-se na região medioapical das células mesodérmicas ventrais, enquanto o CRY2-Rho1DN-mCherry foi citosólico (Figura 1A). A ablação a laser dentro do domínio de constrição levou a um rápido recuo tecidual ao longo do eixo A-P (Figura 1B,C). Nos embriões estimulados, o sinal CRY2-Rho1DN-mCherry tornou-se localizado na membrana plasmática, enquanto o sinal medioapic...

A contratilidade da actomiosina desempenha um papel importante na morfogênese celular e tecidual. No entanto, é um desafio manipular agudamente a contratilidade da actomiosina in vivo . Este protocolo descreve um sistema optogenético que inibe rapidamente a contratilidade da actomiosina mediada por Rho1 em embriões de Drosophila , revelando a perda imediata da tensão epitelial após a inativação da actomiosina in vivo.

Inibição Optogenética da Contratilidade da Actomiosina Mediada por Rho1 Juntamente com a Medida da Tensão Epitelial em Embriões de Drosophila

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

Nossa pesquisa estuda a morfogênese tecidual, a formação de estruturas teciduais tridimensionais complexas em desenvolvimento. Estamos interessados nos genes e nas moléculas que regulam a morfogênese e buscamos entender os princípios físicos subjacentes à morfogênese. Por exemplo, como as forças mecânicas são geradas e como elas conduzem a reabilitação tecidual.As forças contráteis geradas pela actina filamentosa e miosina II não muscular, também conhecida como contratilidade da actomiosina, é uma das forças mais importantes que dirigem a morfogênese tecidual. Nossa pesquisa atual aborda como a contratilidade da actomiosina medeia o enovelamento das folhas celulares epiteliais do sangue, um mecanismo fundamental de construção tecidual no desenvolvimento. Uma compreensão profunda do papel da contratilidade da actomiosina no epitélio e em outros processos morfogenéticos requer abordagens que possam inativar rapidamente a actomiosina em tempo e local designados, e registre o impacto imediato do comportamento e das propriedades teciduais.No entanto, isso é difícil de conseguir usando abordagens genéticas convencionais. A abordagem descrita neste protocolo é projetada para abordar como as células e tecidos respondem a mudanças súbitas nas forças mecânicas que normalmente conduzem a remodelação tecidual. Esta é uma questão importante, mas tem sido difícil de abordar devido a abordagens limitadas que podem alterar rapidamente as forças mecânicas em tecidos intactos.Neste estudo, desenvolvemos uma ferramenta optogenética para inativar rapidamente a actomiosina em regiões específicas do tecido em embriões de Drosophila. Verificamos que a combinação destes dois com a ablação a laser para investigar o impacto direto da contratilidade da actomiosina na mecânica tecidual no epitélio de dobramento. Nossos achados fornecem novos conhecimentos sobre o mecanismo mecânico dos meios de constrição apical para dobramento epitelial.Com modificações manuais, o protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar a função da contratilidade da actomiosina em uma ampla gama de processos morfogenéticos.

optogenetic-inhibition-rho1-mediated-actomyosin-contractility-coupled

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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