Name: Exposição Crônica Intermitente ao Vapor de Etanol Emparelhada com Escolha de Duas Garrafas para Modelar o Transtorno por Uso de Álcool (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Aprenda a modelar dependência alcoólica em camundongos usando o paradigma de escolha entre duas garrafas com exposição intermitente crônica ao vapor de etanol. Este método permite monitorar comportamentos de consumo e investigar alterações neurobiológicas.

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Este trabalho foi apoiado por bolsas do National Institutes of Health (NIH) AA027301 e AA029985.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Purdue. O presente estudo utilizou camundongos C57BL/6J com 8 semanas de idade. O grupo CIE teve 5 camundongos (3 machos, 2 fêmeas) e o grupo Air teve 10 camundongos (5 machos e 5 fêmeas). Os animais foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais) e foram alojados em grupo em um ciclo claro-escuro de 12 h com acesso a alimentos. Os pesos corporais dos camundongos foram medidos uma vez por semana durante todo o experimento.
1. Desenho experimental geral
NOTA: A escolha de duas garrafas (2BC)/exposição crônica intermitente ao vapor de etanol (CIE) é um modelo de camundongo pré-clínico para explorar a dependência do etanol51.
<ol>
	<li>Durante as semanas de 2BC, certifique-se de que os camundongos tenham acesso a uma garrafa contendo etanol (15% p / v) e uma garrafa contendo água por 2 h diariamente (de segunda a sexta-feira), começando 2 h no ciclo escuro.</li>
	<li>No início, permita aos camundongos um mínimo de 2 semanas de ingestão basal de 2BC até que um nível estável de ingestão de etanol seja atingido. Dependendo das necessidades experimentais, divida os camundongos em dois grupos (um grupo CIE e um grupo Air) ou mais se tratamentos adicionais forem incluídos com base na ingestão média de etanol na linha de base.</li>
	<li>Após as semanas basais de 2BC, exponha os camundongos do grupo CIE ao vapor de etanol (CIE) por quatro dias consecutivos (segunda a quinta-feira) com 16 horas consecutivas de vapor ligado e 8 horas consecutivas de vapor desligado. Para garantir concentrações estáveis e sustentadas de etanol no sangue durante todo o período de exposição, o pirazol foi co-administrado como um inibidor da álcool desidrogenase, evitando assim o rápido metabolismo do etanol e promovendo níveis consistentes de etanol sistêmico. 
	NOTA: Para controlar possíveis variáveis específicas da câmara, como iluminação, vibração, ruído e temperatura, os camundongos do grupo Ar foram alojados em uma câmara idêntica nas mesmas condições ambientais do grupo CIE, mas sem exposição ao vapor de álcool.</li>
	<li>Durante a semana CIE/Air, certifique-se de que 2BC não ocorra. Após 1 semana de CIE/Air, retome os camundongos em 2BC para a segunda a sexta-feira seguinte.</li>
	<li>Permita que os camundongos alternem semanas de CIE / Air e 2BC pelo restante do procedimento até que ocorra a escalada do consumo de álcool nos camundongos CIE. Colete sangue dos camundongos pelo menos uma vez por semana de CIE para determinar sua concentração de etanol no sangue (BEC)52.</li>
</ol>
2. Preparação experimental
<ol>
	<li>Adquira todos os seguintes suprimentos antes do início do estudo: camundongos, gaiolas / tampos de gaiola de metal, garrafas para caber duas por gaiola lado a lado, roupa de cama, comida, uma balança, uma câmara de vapor intermitente crônica e uma máquina Analox ou outro método para analisar os BECs (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Certifique-se de que todos os produtos químicos necessários estejam prontos para o experimento: água potável, etanol a 95%, pirazol, heparina e solução salina estéril.</li>
</ol>
3. Habituação animal
<ol>
	<li>Se os camundongos ainda não estiverem alojados no mesmo local dos experimentos, aguarde pelo menos 1 semana para que eles se acostumem ao novo ambiente. 
	NOTA: Durante este período, os camundongos também devem ser habituados ao manuseio suave para minimizar os fatores de confusão relacionados ao estresse e melhorar o bem-estar animal. As sessões de manejo foram realizadas uma vez ao dia durante cinco dias consecutivos, cada uma com duração aproximada de 2 a 3 minutos por animal. Os ratos foram colocados em concha ou gentilmente guiados para as mãos do experimentador sem levantar a cauda, permitindo que eles explorassem voluntariamente a mão do manipulador. Essa técnica facilita a interação de rotina, reduz o estresse durante os procedimentos experimentais subsequentes e garante dados comportamentais mais confiáveis. Além disso, os animais foram transferidos para a área experimental por 30 min diários para aclimatá-los ainda mais ao ambiente de teste.</li>
	<li>Certifique-se de que os ratos tenham 1 semana de opções de duas garrafas, com ambas as garrafas cheias de água para permitir que eles se ajustem às diferentes configurações da gaiola e sejam colocados em uma gaiola individual para beber.</li>
</ol>
4. Escolha de duas garrafas com 15% p/v de etanol e água
<ol>
	<li>Habituação de escolha de duas garrafas
	<ol>
		<li>O paradigma de teste de escolha de duas garrafas é o mesmo durante toda a semana de escolha de duas garrafas com água e os testes posteriores com água e etanol. Mova os ratos alojados em grupo para suas gaiolas individuais 30 minutos antes que as luzes se apaguem e, em seguida, deixe os ratos beberem por 2 h.</li>
		<li>Registre os volumes de cada garrafa antes e depois do período de bebedeira de 2 horas. Cada grupo passa por 2BC por 5 dias, de segunda a sexta-feira. 
		NOTA: O objetivo da semana de habituação é permitir que os animais se ajustem a duas garrafas na gaiola para minimizar qualquer viés causado pela posição lateral natural de uma única garrafa. Durante esta semana, ambas as garrafas estão cheias de água. Se a tremonha de metal fornecida for projetada para conter apenas uma garrafa, use cuidadosamente o espaço entre as barras adjacentes à primeira garrafa para criar espaço para a segunda garrafa. As garrafas usadas para experimentos de bebida são feitas sob medida usando pipetas de 10 mL e 25 mL com as extremidades cortadas para permitir que um bebedor reto com um rolamento de esferas seja inserido para os ratos beberem. O uso de clipes de fichário para prender as garrafas na tampa de arame garantirá que as garrafas não se movam durante o período de consumo (Figura Suplementar 1 e Figura Suplementar 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Escolha de linha de base de duas garrafas
	<ol>
		<li>Após a habituação, permita que os camundongos sejam submetidos a pelo menos 2 semanas de ingestão basal de 2BC para estabelecer uma ingestão estável de etanol. Durante o consumo basal, teste os camundongos por 2 h por dia e 5 dias por semana (de segunda a sexta-feira) com uma garrafa de água e uma segunda garrafa com 15% p / v de etanol. Registre os volumes de cada garrafa antes e depois do período de 2 h de bebida. 
		NOTA: Para estabelecer uma linha de base estável de ingestão de etanol, repita as semanas de 2BC até que cada camundongo tenha aproximadamente menos de 15% de variação na ingestão entre os dias.</li>
		<li>Depois que os camundongos atingirem uma linha de base estável de ingestão de etanol, divida uniformemente os camundongos com base na ingestão de etanol em grupos não dependentes de etanol (tratamento de ar) e dependentes de etanol (tratamento CIE). Uma vez estabelecida a ingestão basal de etanol, os camundongos são submetidos a CIE (ou exposição ao ar) na semana seguinte. 
		NOTA: Nem todos os experimentos requerem a inclusão de um grupo não dependente, e isso deve ser determinado com base no foco do estudo. Por exemplo, camundongos dependentes de etanol com e sem tratamento específico podem ser uma comparação mais relevante.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Escolha de duas garrafas (2BC)
	<ol>
		<li>Retome o procedimento de 2BC conforme realizado durante o consumo basal após a primeira semana de CIE. 
		NOTA: A fórmula de beber de rato de escolha de duas garrafas é uma mistura de etanol a 15% p/v (1 L): etanol a 95% (195 mL) e água potável de rato (805 mL).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Exposição crônica intermitente ao vapor de etanol (CIE)
<ol>
	<li>Organize os seguintes materiais: câmaras de vapor CIE feitas sob medida (Figura Suplementar 3), etanol a 95%, uma solução de etanol-pirazol (68,1 mg/kg de pirazol misturado em etanol a 20%), uma solução salina-pirazol (68,1 mg/kg de pirazol misturado em solução salina), seringas (1 mL) e agulhas.</li>
	<li>Procedimento crônico intermitente de vapor de etanol (CIE)
	<ol>
		<li>Antes de ser colocado nas câmaras de vapor para CIE, injete intraperitonealmente nos camundongos uma solução de etanol-pirazol (0,0075 mL / g), que é usada para criar uma intoxicação inicial por etanol, inibir a etanol desidrogenase e bloquear o metabolismo do etanol53.</li>
		<li>Injete todos os controles de ar e outros grupos com a mesma dose de pirazol misturada com solução salina (0,0075 mL / g) em vez de etanol. Recomenda-se administrar meia dose (0,00375 mL / g) das soluções de pirazol no primeiro dia e no último dia da CIE de cada semana.</li>
		<li>Após as injeções, retorne os camundongos Air/controle para suas gaiolas domésticas e coloque as gaiolas para o grupo CIE dentro da câmara de vapor. 
		NOTA: Dados os riscos potenciais à saúde associados à exposição crônica ao vapor de etanol, os animais foram monitorados de perto durante todo o protocolo para garantir seu bem-estar e detectar quaisquer efeitos adversos. Os camundongos foram pesados pelo menos duas vezes por semana, e as avaliações de saúde incluíram observação de sinais clínicos de sofrimento. Os animais que exibiram uma perda de peso corporal superior a 20% da linha de base ou exibindo sinais como postura curvada, letargia, piloereção ou pêlo despenteado foram considerados como tendo atingido os desfechos humanos e foram prontamente removidos do estudo de acordo com as diretrizes institucionais aprovadas de cuidados e uso de animais. Durante o CIE, os camundongos são mais suscetíveis a resultados ruins de saúde no final da semana, quando entram em um período de abstinência prolongado após a cessação da exposição ao etanol. Para minimizar a gravidade da abstinência, meia dose de pirazol é administrada no último dia de exposição ao vapor a cada semana. Além disso, meia dose é administrada no início de cada novo ciclo CIE para facilitar a exposição dos animais ao etanol. O pirazol, um inibidor da álcool desidrogenase, é usado para estabilizar e prolongar as concentrações de etanol no sangue; as doses geralmente variam de 0.00375 mL/g a 0.0075 mL/g e podem ser ajustadas para atingir a concentração desejada de etanol no sangue.</li>
		<li>Assim que os ratos forem colocados nas câmaras de vapor, tranque as portas e ajuste a bomba para o nível de vapor apropriado (por exemplo, 1-3). Defina o tempo de execução do experimento. Para o presente estudo, o experimento começou às 17:00 e terminou às 09:00, e uma configuração de bomba de 1-2 foi usada (usada por toda parte).</li>
		<li>Em seguida, pressione o botão Iniciar na tela de controle da câmara de vapor CIE para iniciar o experimento. 
		NOTA: Esta etapa pode variar dependendo da câmara que está sendo usada e das diferenças na configuração. Aqui, uma vez que todos os camundongos são injetados e colocados na câmara de etanol, a câmara deve começar a bombear etanol a 95% em um frasco de vidro e aquecer o etanol líquido em vapor. O vapor flui através da câmara onde os camundongos são mantidos por 16 h / dia durante 4 dias (de segunda à noite a sexta-feira de manhã). A cada dia, os ratos experimentam 8 horas de vapor sendo desligado. Os camundongos são então removidos da câmara no final do quarto dia (sexta-feira de manhã) e começam 2BC na segunda-feira seguinte. Dependendo do sistema e da configuração específicos da câmara de vapor, pode haver variações nos BECs causadas pelas diferentes configurações/níveis de vapor. Vários fatores, como pequenas diferenças nos componentes do sistema, fluxo de ar, exaustão, etc., podem causar isso. Ajustar o nível de vapor de etanol em vez da dose de pirazol é adequado para manter um BEC na faixa alvo. À medida que a tolerância se desenvolve, os BECs podem ser muito baixos e o nível de vapor pode precisar ser ajustado. Se o gradiente entre os níveis de vapor for muito acentuado para aumentar os BECs, recomenda-se ajustar a dose de pirazol de acordo para alterar os BECs.</li>
		<li>Meça os BECs (consulte a etapa 5.3) dos camundongos pelo menos uma vez por semana durante o CIE. Realize a coleta de sangue 30 minutos antes do vapor parar para garantir que os BECs não comecem a cair. 
		NOTA: O nível de vapor pode precisar ser ajustado durante o experimento, pois a tolerância ao etanol aumenta ao longo de várias semanas. Os BECs devem ser testados antes e depois de ajustar as configurações de vapor.</li>
		<li>Retorne os camundongos para o teste 2BC na semana seguinte ao CIE. Repita as etapas 4 e 5. Mantenha os camundongos alternando entre CIE e 2BC por quatro a oito ciclos (8-16 semanas) até que tenham um aumento significativo do consumo de etanol em comparação com o volume de consumo basal.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Medições de sangue
	<ol>
		<li>Organize os seguintes materiais: equipamento para medir BECs, como um sistema Analox, uma lâmina, um tubo (0,2 mL), heparina/EDTA e uma centrífuga (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Corte a cauda dos camundongos CIE uma vez durante a semana CIE, 30 minutos antes do desligamento do sistema de vapor, para coletar sangue para determinar o BEC. A coleta de sangue pode ser realizada por vários métodos, dependendo das preferências do lab54. 
		NOTA: O sangue é coletado em tubos de 0,5 mL heparinizados ou revestidos com EDTA (consulte a Tabela de Materiais).</li>
		<li>Manter as amostras de sangue recolhidas a 4 °C até serem processadas.</li>
		<li>Para processar as amostras, primeiro centrifugue a 208 x g por 10 min a 4 °C para separar o plasma.</li>
		<li>Determinar as concentrações de etanol no sangue utilizando um analisador de etanol de oxigénio (ver Tabela de Materiais) ou outros sistemas capazes de determinar os BECs.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Modeling Alcohol Use Disorder Using Chronic Intermittent Ethanol Vapor Exposure

Maury Cole é o proprietário e operador da La Jolla Alcohol Research Inc.

O transtorno por uso de álcool representa um problema de saúde pública global com alta prevalência e custo para a sociedade56. Para estudar AUD em modelos animais pré-clínicos, um método comum em camundongos é 2BC / CIE 20,34,43,44,51,57,58,59.<sup class="x...

O transtorno por uso de álcool (AUD), que envolve o consumo excessivo crônico de álcool, é um dos transtornos psiquiátricos mais comuns e é um problema global. Os sintomas do AUD envolvem ciclos repetidos de intoxicação, abstinência e desejos e são caracterizados pelo consumo constante de álcool sem levar em conta as consequências sociais, ocupacionais e de saúde1,2,3,4,5,6,7. O transtorno por uso de álcool geralmente ocorre em conjunto com outros transtornos mentais invasivos, persistentes e incapacitantes8, como TDAH9, anxiety10 ou depression11 e é responsável por aproximadamente 88.000 mortes anualmente apenas nos Estados Unidos2. O uso excessivo ou frequente de álcool pode afetar o status de trabalho e as relações sociais de uma pessoa12 e pode levar ao aumento da violência13. Fisicamente, a abstinência aguda do álcool pode resultar em ansiedade, agitação, tremor, sudorese excessiva, alteração da consciência e alucinações14,15. Além disso, as pessoas podem sentir sintomas de abstinência ao reduzir ou parar de beber e ficar irritadas ou irritadas16. Além disso, o consumo crônico de álcool pode causar perda de memória17 e pode resultar em deficiência de tiamina, também conhecida como síndrome de Wernicke-Korsakoff (WKS), que contribui significativamente para a demência induzida pelo álcool18.
Para avançar ainda mais na pesquisa do AUD, é necessário ter modelos animais da doença relevantes para a tradução. O modelo mais comum de AUD em roedores é a exposição crônica intermitente ao vapor de etanol (CIE), que é uma abordagem bem estabelecida para induzir a dependência do álcool por meio da inalação repetida de vapor de álcool4,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Os procedimentos de CIE de roedores induzem sintomas de abstinência, como convulsões induzidas pelo manuseio31, hiperexcitabilidade, comportamento semelhante à irritabilidade, comportamento semelhante à ansiedade e distúrbios do sono e resultam em uma escalada do consumo de álcool22,32,33,34,35. Além disso, a EIC leva a uma escalada significativa no consumo voluntário de álcool, refletindo a ingestão compulsiva observada em AUD36. Durante as fases de intoxicação, os camundongos exibem sinais comportamentais e fisiológicos consistentes com intoxicação alcoólica em humanos, incluindo ataxia, sedação e hipotermia prejudicada37,38,39. Esses resultados ressaltam a utilidade do modelo CIE na captura dos aspectos neurobiológicos e comportamentais da dependência do álcool, tornando-o uma ferramenta valiosa para elucidar os mecanismos do AUD e testar possíveis intervenções terapêuticas. Em modelos pré-clínicos de AUD, como a exposição crônica intermitente ao vapor de etanol (CIE), os camundongos exibem sinais comportamentais e fisiológicos paralelos à intoxicação e dependência humana do álcool. Durante as fases de intoxicação, os camundongos podem apresentar sinais como ataxia, sedação, diminuição do comportamento exploratório e reflexo de endireitamento prejudicado. Dados esses riscos, os animais foram monitorados de perto durante e após a exposição ao vapor de etanol para identificar sinais de intoxicação grave ou deterioração da saúde.
Em ratos, o modelo CIE geralmente envolve a autoadministração operante de álcool para medir a escalada da ingestão40,41,42, enquanto o modelo de camundongo envolve CIE e escolha de duas garrafas (2BC) bebendo43,44. Modelos pré-clínicos de dependência de álcool mostraram consistentemente que os animais aumentam sua ingestão de etanol após exposição crônica ao vapor de etanol23,45,46,47. Em camundongos especificamente, ciclos repetidos de CIE demonstraram aumentar a ingestão voluntária de etanol3,21,48,49,50. No geral, estudos anteriores demonstram que o modelo CIE é suficiente para aumentar o consumo de etanol e o modelo AUD em roedores.
Este estudo tem como objetivo destacar o método CIE para estudar AUD e, mais especificamente, focar no modelo de camundongo 2BC/CIE. Passamos por um processo detalhado das etapas necessárias para a realização do 2BC/CIE e apresentamos um exemplo da escalada do consumo de álcool após o CIE.

<table><tbody><tr><td>500 Eppendorf Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>L203896J</td><td></td></tr><tr><td>95% etanol</td><td>Decon laboratories</td><td>2816</td><td></td></tr><tr><td>Analox machine</td><td>Analox Instruments</td><td>Analox-AM1</td><td></td></tr><tr><td>Animal Weighing Scale</td><td>Kent Scientific</td><td>SCL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Binder Clips</td><td>Office Depot</td><td>560394</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J ratos</td><td>O Centrífuga</td><td>000664</td><td></td>Jackson</tr><tr><td>Laboratory</td><td>Eppendorf</td><td>5418R</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de vapor intermitente crônica</td><td>La Jolla Alcohol Research Inc</td><td></td><td>Materiais feitos sob medida</td></tr><tr><td>Heparina / EDTA</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>TS / DRUGS / 2/2015</td><td></td></tr><tr><td>Cama de rato</td><td>Bed-o' Cobs</td><td>8B</td><td>preencher com 1/8 "de profundidade</td></tr><tr><td>Mouse bebendo</td><td></td><td></td><td>garrafa Materiais feitos sob medida</td></tr><tr><td>Pyrazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>bccc6397</td><td></td></tr><tr><td>Teklad global 18% de proteína (comida para ratos)</td> <td>Teklad global</td><td>Envigo 2018</td><td></td></tr></tbody></table>

exposição crônica intermitente ao vapor de etanol emparelhada com escolha de duas garrafas para modelar o transtorno por uso de Álcool

Chronic Intermittent Ethanol Vapor Exposure Paired with Two-Bottle Choice to Model Alcohol Use Disorder

O transtorno por uso de álcool (AUD) é um transtorno crônico relacionado ao álcool que normalmente se apresenta como consumo descontrolado e preocupação com álcool. Um componente-chave da pesquisa AUD é o uso de modelos pré-clínicos translacionalmente relevantes. Nas últimas décadas, uma variedade de modelos animais tem sido usada para estudar o AUD. Um modelo proeminente de AUD é o modelo de exposição crônica intermitente ao vapor de etanol (CIE), que é uma abordagem bem estabelecida para induzir a dependência de álcool em roedores por meio de ciclos repetidos de exposição ao etanol por inalação. Para modelar o AUD em camundongos, a exposição ao CIE é emparelhada com uma escolha voluntária de duas garrafas (2BC) de consumo de álcool e água para medir a escalada do consumo de álcool. O procedimento 2BC/CIE envolve semanas alternadas de consumo de 2BC e CIE, que se repetem até que a escalada do consumo de álcool seja alcançada. No presente estudo, descrevemos os procedimentos para a realização de 2BC / CIE, incluindo o uso diário da câmara de vapor CIE, e fornecemos um exemplo de consumo de álcool em camundongos C57BL / 6J usando essa abordagem.

No presente estudo representativo, a ingestão de etanol (g/kg) durante o teste de escolha binária (2BC) é relatada durante a fase inicial de consumo e após semanas de exposição ao etanol inalado (pós-vapor). Resumidamente, conforme descrito no protocolo, durante o teste de escolha binária, os camundongos tinham acesso a duas garrafas: uma contendo água e a outra contendo etanol a 15% (p/v). Após a determinação das ingestões basais, os animais foram divididos e distribuídos igualmente entre o grupo CIE ou o grupo Ar. A in...

Apresentado aqui está um protocolo para o modelo 2BC/CIE de dependência de álcool em camundongos para estudar o transtorno por uso de álcool.

Exposição Crônica Intermitente ao Vapor de Etanol Emparelhada com Escolha de Duas Garrafas para Modelar o Transtorno por Uso de Álcool

Alcohol use disorder (AUD) is a chronic alcohol-related disorder that typically presents as uncontrolled drinking and preoccupation with alcohol. A key ...

chronic-intermittent-ethanol-vapor-exposure-paired-with-two-bottle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Transtorno de uso de álcool (AUD) é um problema de saúde nacional e o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes é necessário para compensar as necessidades desta população de pacientes. Para este fim, o seguinte protocolo utiliza dois modelos simples roedores bebendo para avaliar a eficácia pré-clínica de compostos de chumbo anti-álcool.

Murino bebendo modelos no desenvolvimento de farmacoterapias para alcoolismo: beber na escolha escura e dois-garrafa

Este protocolo descreve um paradigma padrão de consumo doméstico de duas garrafas de acesso intermitente para modelar o consumo de álcool em ratos. Além disso, fornece instruções passo a passo para aumentar o protocolo padrão com um sistema de detecção de lambedura DIY que permite a análise microestrutural do comportamento de beber.

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