Name: Avaliação do impacto de um novo sistema de processador de células de resfriamento na instalação de isolamento de células de ilhotas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-11T12:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Aprenda a usar um processador refrigerado de células para isolar células mononucleares humanas com alta viabilidade em ambiente asseptico. Este método melhora a recuperação celular em aplicações clínicas.

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Os autores gostariam de agradecer ao Instituto Europeu de Genômica para Diabetes (ANR-10- LABEX-0046 a FP) e ao Instituto Metabólico do Catar - Hamad Medical Corporation, Catar. Os autores também agradecem ao Centro de Pesquisa Médica da Hamad Medical Corporation pelo suporte às taxas de processamento de artigos.

Este protocolo utilizou sangue integral descartado, impróprio para uso conforme as diretrizes institucionais de descarte. A aprovação do comitê de ética e o consentimento informado não são aplicáveis.
1. Configuração do processador de células refrigerado
OBSERVAÇÃO: Todos os procedimentos devem ser realizados em um ambiente de sala limpa, e a equipe deve respeitar os procedimentos de vestimenta para sala limpa.
<ol>
	<li>Compra de equipamentos
	<ol>
		<li>Adquira uma tampa sobressalente de plexiglás. Compre o sistema de equipamento de refrigeração, refrigerador com controlador de temperatura de fluxo de gás refrigerado mecanicamente, secador de ar, regulador de pressão e vazão, e a garantia (opcional). Veja a Tabela de Materiais para referências. 
		OBSERVAÇÃO: O custo total é de $16.133 sem frete ou taxas alfandegárias.</li>
		<li>Pedir ar seco médico, um gás comprimido médico que atenda ao padrão de qualidade (referência da Farmacopeia Europeia 1238), junto ao fornecedor local de gases médicos. Adquirir 2 cilindros de 6,8 m3 (47 L: 23 cm x 153 cm; diâmetro x comprimento).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalação dos equipamentos (Figura 1 e Figura 2)
	<ol>
		<li>Introduza os equipamentos na sala limpa GMP (desinfete antes de entrar na sala limpa de acordo com os procedimentos GMP).</li>
		<li>Para o ar comprimido de grau médico, instale uma linha de gás em vez de colocar o cilindro diretamente na sala limpa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Modificação do processador celular para refrigeração
	<ol>
		<li>Primeiro, remova a tampa de plexiglás. Guarde a tampa original de plexiglás caso haja algum problema com a garantia. Faça um furo na tampa sobressalente do processador celular com diâmetro correspondente ao diâmetro externo da ponta do bocal do dispositivo de refrigeração, para evitar rachaduras na tampa da centrífuga (recomenda-se 13,3 mm).</li>
		<li>Fixe os suportes juntamente com um pedaço circular de espuma. Isso é feito para evitar quebra e/ou arranhões na tampa, para manter o bocal do refrigerador posicionado acima do processador celular, para proteger a tampa de deformações excessivas devido à alta pressão do ar injetado, para suportar o peso do bocal e, por fim, para garantir a máxima segurança ao operador, permitindo acesso livre e seguro a todas as funções necessárias do processador celular durante o procedimento experimental.</li>
		<li>Conecte o sistema de refrigeração ao processador celular fixando o bocal de refrigeração ao orifício na tampa de plexiglás. Fixe-o com suportes e almofadas de espuma.</li>
		<li>Posicione a unidade de refrigeração até 2,44 m (8 pés) de distância do bocal. Coloque o controlador de temperatura em um gabinete separado e posicione-o a até 1,83 m (6 pés) da unidade de refrigeração.</li>
		<li>Defina o ponto de ajuste do refrigerador em -40 °C para resfriar o fluxo de ar no refrigerador. A temperatura do ar na saída é indicada continuamente no indicador digital com resolução de 0,1 °C. Ajuste digitalmente a temperatura de saída para 0,1 °C utilizando o controlador de temperatura.</li>
		<li>Controle a pressão e a vazão do suprimento de ar no módulo regulador de pressão e vazão (Figura 2) antes de alimentar o refrigerador. Ajuste-os para 55 psi e 4 SCFM, respectivamente, para alcançar as condições ideais em um fluxo de ar resfriado a -30 °C ± 2 °C.</li>
		<li>Verifique se o suprimento de gás médico está regulado com pressão de saída de 5 bar e pode durar pelo menos 90 minutos, pois isso é necessário para que o ar comprimido alcance -30 °C. 
		&#8203;OBSERVAÇÃO: O ar seco médico é um gás comprimido médico, e o ar seco totalmente pressurizado atende ao padrão de qualidade.</li>
		<li>Forneça 5 bar por meio de um bocal do refrigerador conectado à tampa do processador celular através de um orifício feito na tampa da centrífuga. Injete o ar médico resfriado dentro da cuba de centrifugação do processador celular (Figura 2). Escolha a posição da injeção de ar de modo que o ar resfriado seja direcionado perpendicularmente à borda de alumínio do rotor da centrífuga.</li>
		<li>Ao preparar o processador celular, certifique-se de que o rotor esteja à temperatura ambiente (18 °C). Defina o termorregulador automático do sistema de refrigeração em -30 °C e direcione injeções de ar frio ao rotor. 
		OBSERVAÇÃO: Diferentes condições experimentais foram testadas para alcançar um gradiente de temperatura ideal de +4 °C, necessário para superar a termorresistência do sistema separador de células do processador celular e o aquecimento do rotor durante a centrifugação. O termorregulador programado manterá a temperatura-alvo ideal dentro da máquina de processamento celular durante o procedimento, especialmente durante a centrifugação, em uma temperatura de sala limpa de +18 °C.
		<ol>
			<li>Configure o processador celular com a primeira fase de pré-resfriamento para resfriar o processador (sem o kit do processador celular) a +3 °C por 30 a 45 minutos, e a segunda fase de pré-resfriamento deve ser com o kit pré-resfriado a +4 °C a 134 x g, por 5 minutos.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Contagem de partículas em suspensão no ar
<ol>
	<li>Avalie a conformidade do dispositivo de refrigeração com o ambiente de sala limpa GMP conforme a norma ISO 14644-1, para avaliar o impacto de dispositivos térmicos durante a fase de operação.</li>
	<li>Utilize monitoramento de contagem de partículas para comprovar que o nível exigido de limpeza é alcançado nos pontos críticos de controle em repouso e em operação.
	<ol>
		<li>O número mínimo de locais de amostragem depende da área medida. Calcule este valor usando a equação 
		<img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/65321/65321eq01.jpg" style="margin: auto;" /> 
		&#8203;em que A é a área da sala limpa ou do espaço controlado com ar limpo em m2, e NL é o número de locais de amostragem arredondado para o número inteiro imediatamente superior.</li>
		<li>O volume de amostragem aérea é o volume mínimo em cada local. Assegure-se de que o volume de ar seja suficientemente grande para contar 20 partículas do maior tamanho especificado. Calcule o volume de amostragem aérea pela equação 
		V= 20/C x 1000 
		em que V é o volume mínimo de amostra individual por local, expresso em L, e C é o limite de classe (número de partículas/m3).</li>
		<li>Para cada local, dependendo da área, utilize uma ou mais amostras. Assegure-se de que o volume mínimo amostrado em cada local seja de 2 L e que o tempo mínimo de amostragem seja de pelo menos 1 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Antes da amostragem, purgue o dispositivo contador de partículas com um filtro de purgação. Remova o filtro e posicione-o com a sonda isocinética para a amostragem.</li>
	<li>Posicione o instrumento contador de partículas no local de amostragem identificado. Inicie a coleta de amostra pela tela principal do dispositivo contador de partículas.</li>
	<li>Após a conclusão da amostragem, leve o dispositivo contador de partículas para o próximo local. Quando todos os locais de amostragem forem concluídos, revise os dados e imprima um relatório.</li>
	<li>Quando a concentração média de partículas em todos os pontos de amostragem na área estiver abaixo do limite de classe indicado na Tabela 1, considere que a sala atende ao requisito de concentração permitida de partículas.</li>
</ol>
3. Preparação do gradiente e processamento da separação celular
<ol>
	<li>Antes da experimentação, pré-resfrie os gradientes de densidade leve e pesado e os kits do processador de células durante a noite a +4 °C em uma geladeira.</li>
	<li>Pré-resfrie o processador de células por 45 min em repouso (ou seja, ligue o processador de células antes do uso). Mantenha a temperatura entre +2 °C e +5 °C. Insira o kit do processador de células pré-resfriado a +4 °C.</li>
	<li>Para o fabricante de gradiente padrão com jaqueta dupla resfriada com etanol (opcional; Figura 3), conecte as 2 câmaras de vidro e coloque-as sobre um agitador magnético. Prenda o tubo entre as 2 câmaras. Resfrie o fabricante de gradiente com um chiller de circulação de etanol a 0 °C.</li>
	<li>Primeiramente, prepare-se para carregar a camada pesada na parte inferior do saco, enchendo a câmara com 130 mL de gradiente de densidade pesada (HD; 1,087 g/mL). Carregue com velocidade de bomba de 150 mL/min.</li>
	<li>Uma vez que o gradiente pesado estiver no saco, adicione 130 mL de densidade alta (HD) ao béquer frontal e 140 mL de gradiente de densidade baixa (LD; 1,063 g/mL) ao traseiro (pinça fechada).</li>
	<li>Solte a pinça/hemostato entre as duas câmaras e crie um gradiente contínuo com velocidade de bomba de 50 mL/min.</li>
	<li>Prepare com antecedência células mononucleares de camada de buffy coat humano para purificação a partir de múltiplos buffy coats anônimos agrupados coletados de resíduos de sangue total (40 mL a 60 mL de sangue total foram adicionados a 10 bolsas de buffy coat), dependendo da disponibilidade do banco de sangue.
	<ol>
		<li>Separacão de MNC
		<ol>
			<li>Utilize centrifugação em gradiente de densidade para o isolamento de células mononucleares humanas de baixa densidade. Para isso, siga os passos descritos abaixo.</li>
			<li>Para o preparo das células, calcule o volume de sangue (sangue total anticoagulado ou buffy coat suspenso). Dilua o sangue com solução tampão 2x-4x misturando por inversão. Quanto mais diluído o sangue, melhor será a pureza das células mononucleares.</li>
			<li>Prepare o tampão misturando tampão fosfato com um anticoagulante. Calcule o número de tubos necessários dividindo o volume de sangue por 35 mL e despeje 15 mL de solução de gradiente de densidade 1,073 em cada tubo.</li>
			<li>Camadeie gradualmente 35 mL da suspensão de sangue diluída sobre o gradiente de densidade, passando suavemente sobre a superfície do gradiente usando uma seringa de 60 mL conectada a uma agulha; para volumes pequenos, use uma pipeta. Evite perturbar a interface, pois isso resultará em uma camada de mononucleares de baixa qualidade.</li>
			<li>Centrifugue a 400 x g por 20 min a 20 °C sem nenhuma interrupção (aceleração&#160;0, desaceleração&#160;0). Após a centrifugação, colete cuidadosamente a camada de interface das células mononucleares usando uma pipeta de transferência estéril. Transfira as células para outro tubo cônico novo de 50 mL.</li>
			<li>Lave as células 2x com tampão (PBS com anticoagulante adicionado). Para a primeira lavagem, encha o tubo contendo as células com tampão até 50 mL. Centrifugue a 300 x g por 10 min a 20 °C para formar o pellet celular (aceleração&#160;9, desaceleração&#160;0). Remova cuidadosamente todo o sobrenadante.</li>
			<li>Realize a segunda lavagem para remoção de plaquetas. Re-suspenda o pellet em um volume final de 50 mL com tampão. Centrifugue a 200-300 x g por 10 min a 20 °C (aceleração&#160;9, desaceleração&#160;0).</li>
			<li>Reconstitua as células em um volume final de 5 mL; essas células devem ter gravidade específica semelhante à das MNC de baixa densidade &#60;1,073. Meça a densidade específica do gradiente com um densímetro.</li>
			<li>Re-suspenda o pellet em um volume final de 100 mL com 95 mL de meio de gradiente de alta densidade (1,083 g/mL) em um saco de transferência. Use este produto para purificação utilizando um separador de células. O volume final de 100 mL contém células e meio de gradiente de alta densidade 1,083. 
			NOTA: O buffy coat pode ser armazenado na geladeira durante a noite em PBS contendo 0,5% de BSA ou plasma autólogo. O buffy coat também pode ser lavado.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Carregue por cima os gradientes pré-formados com no máximo 30 mL de MNC isoladas do buffy coat, suspensas em 100 mL de meio concentrado de conservação, usando uma bomba peristáltica a 25 mL/min. Mantenha o gradiente a +4 °C.</li>
	<li>Meça continuamente a temperatura interna do processador de células com uma termoprova pré-calibrada. Usando um termopar digital conectado a uma termoprova estéril, monitore a temperatura dos gradientes e das células durante o processo.</li>
</ol>
4. Otimização de diferentes etapas do carregamento em gradiente
<ol>
	<li>Insira o kit do processador celular pré-resfriado a +4 °C. Carregue o gradiente denso (130 mL) a +4,5 °C. Ao final do carregamento do gradiente, configure a centrífuga em uma velocidade relativamente baixa (537 x g) para minimizar o calor gerado pelo rotor.</li>
	<li>Desligue o processador celular para permitir que o sistema hidráulico retorne aos níveis anteriores ao início do procedimento e libere o ar.</li>
	<li>Reinicie o processador celular a 537 x g e adicione os gradientes de alta (130 mL) e baixa (140 mL) densidade para criar um gradiente de densidade contínuo a +4,3 °C e com uma taxa de fluxo de 50 mL/min.</li>
	<li>Carregue a camada de buffy coat (30 mL) com 100 mL de meio de armazenamento frio a +6 °C e uma taxa de fluxo de 25 mL/min. Adicione 50 mL (25 mL x 2) de solução de lavagem.</li>
	<li>Após 5 min a +5 °C, colete o gradiente centrifugado em 12 frascos com uma taxa de fluxo de 100 mL/min.</li>
	<li>Encha os tubos com meio de lavagem (M199 + 20% de albumina humana + 10% de penicilina-estreptomicina). Encha o tubo 1 com 100 mL de meio de lavagem e 150 mL de células, e os tubos 2-12 com 225 mL de meio de lavagem e 25 mL de células.</li>
</ol>

Advancements in Cooling Cell Processors for Enhanced Viability in Cell Therapy

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Vesilind, G. W., Simpson, M. B., Colman, R. E., Kao, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+centrifugal+blood+cell+processor+for+washing+platelet+concentrates%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a centrifugal blood cell processor for washing platelet concentrates.</a> Transfusion. 28 (1), 46-51 (1988).</li>
<li>Lake, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+purification+of+human+islets+utilizing+discontinuous+albumin+gradient+on+IBM+2991+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator.</a> Diabetes. 38, 143-145 (1989).</li>
<li>Ricordi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+and+allotransplantation+in+22+consecutive+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases.</a> Transplantation. 53 (2), 407-414 (1992).</li>
<li>Friberg, A. S., Stahle, M., Brandhorst, H., Korsgren, O., Brandhorst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+separation+utilizing+a+closed+automated+purification+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet separation utilizing a closed automated purification system.</a> Cell transplantation. 17 (12), 1305-1313 (2008).</li>
<li>Bampton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Australian+experience+with+total+pancreatectomy+with+islet+autotransplantation+to+treat+chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22ANZ+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Australian experience with total pancreatectomy with islet autotransplantation to treat chronic pancreatitis.</a> ANZ Journal of Surgery. 91 (12), 2663-2668 (2021).</li>
<li>Doppenberg, J. B., Engelse, M., de Koning, E. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRISM%3A+A+Novel+Human+Islet+Isolation+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">PRISM: A Novel Human Islet Isolation Technique.</a> Transplantation. 106 (6), 1271-1278 (2021).</li>
<li>Shimoda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+purification+method+using+large+bottles+effectively+achieves+high+islet+yield+from+pig+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Islet purification method using large bottles effectively achieves high islet yield from pig pancreas.</a> Cell Transplantation. 21 (2-3), 501-508 (2012).</li>
<li>Noguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Islet+Purification+from+Large+Mammals+and+Humans+Using+a+COBE+2991+Cell+Processor+versus+Large+Plastic+Bottles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Islet Purification from Large Mammals and Humans Using a COBE 2991 Cell Processor versus Large Plastic Bottles.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (1), 10(2021).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+trial+of+the+Edmonton+protocol+for+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation.</a> The New England Journal of Medicine. 355 (13), 1318-1330 (2006).</li>
<li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Institutes+of+Health-Sponsored+Clinical+Islet+Transplantation+Consortium+Phase+3+Trial%3A+Manufacture+of+a+Complex+Cellular+Product+at+Eight+Processing+Facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">National Institutes of Health-Sponsored Clinical Islet Transplantation Consortium Phase 3 Trial: Manufacture of a Complex Cellular Product at Eight Processing Facilities.</a> Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).</li>
<li>Swift, S., Kin, T., Mirbolooki, M., Wilson, R., Lakey, J. R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cooling+systems+during+islet+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of cooling systems during islet purification.</a> Cell Transplantation. 15 (2), 175-180 (2006).</li>
<li>Rilo, H. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+islet+number+and+viability+obtained+during+purification+on+Euro-Collins-Ficoll+gradients+processed+on+a+refrigerated+or+nonrefrigerated+COBE+2991+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Comparison of islet number and viability obtained during purification on Euro-Collins-Ficoll gradients processed on a refrigerated or nonrefrigerated COBE 2991 cell separator.</a> Transplantation Proceedings. 26 (6), 3430(1994).</li>
<li>Chadwick, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+purification+using+bovine+serum+albumin%3A+The+importance+of+density+gradient+temperature+and+osmolality%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet purification using bovine serum albumin: The importance of density gradient temperature and osmolality.</a> Cell Transplantation. 2 (4), 355(1993).</li>
<li>Nano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+pancreatic+islet+isolation+around+Europe%3A+results+of+a+survey+study%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human pancreatic islet isolation around Europe: results of a survey study.</a> Transplantation. 104 (1), 190-196 (2020).</li>
<li>Chadwick, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+of+pancreatic+digest+before+islet+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Storage of pancreatic digest before islet purification.</a> Transplantation. 58 (1), 99-104 (1994).</li>
<li>Amrani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detrimental+effects+of+temperature+on+the+efficacy+of+the+University+of+Wisconsin+solution+when+used+for+cardioplegia+at+moderate+hypothermia.+Comparison+with+the+St.+Thomas+Hospital+solution+at+4+degrees+C+and+20+degrees+C%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Detrimental effects of temperature on the efficacy of the University of Wisconsin solution when used for cardioplegia at moderate hypothermia. Comparison with the St. Thomas Hospital solution at 4 degrees C and 20 degrees C.</a> Circulation. 86, 280-288 (1992).</li>
<li>Fremes, S. E., Li, R. K., Weisel, R. D., Mickle, D. A., Tumiati, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+hypothermic+cardiac+storage+with+University+of+Wisconsin+solution.+An+assessment+with+human+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Prolonged hypothermic cardiac storage with University of Wisconsin solution. An assessment with human cell cultures.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 102 (5), 666-672 (1991).</li>
<li>Adewola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+cooling+systems+for+the+COBE+2991+cell+separator+used+in+the+purification+of+human+pancreatic+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Letters%22%5BJournal%5D)">Comparing cooling systems for the COBE 2991 cell separator used in the purification of human pancreatic islets of Langerhans.</a> Cryo Letters. 31 (4), 310-317 (2010).</li>
<li>Keymeulen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+standardized+beta-cell+grafts+in+a+liver+segment+of+IDDM+patients%3A+graft+and+recipients+characteristics+in+two+cases+of+insulin-independence+under+maintenance+immunosuppression+for+prior+kidney+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Implantation of standardized beta-cell grafts in a liver segment of IDDM patients: graft and recipients characteristics in two cases of insulin-independence under maintenance immunosuppression for prior kidney graft.</a> Diabetologia. 41 (4), 452-459 (1998).</li>
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<li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84 (9), 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lemarie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+single-platform+method+for+the+enumeration+of+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A new single-platform method for the enumeration of CD34+ cells.</a> Cytotherapy. 11 (6), 804-806 (2009).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

As instalações de isolamento de ilhotas em todo o mundo adotaram por décadas a purificação humana de ilhotas em um processador de células reaproveitado. Embora algumas instalações de produção de ilhotas continuem a processar ilhotas em um processador de células não refrigerado, a maioria dos centros usa uma versão refrigerada do processador de células 10,11,15. Os centros colocam o processador de células em uma câmara fria que t...

O transplante de ilhotas para diabetes tipo 1 grave pode restaurar a secreção endógena de insulina e se tornou o padrão de tratamento em vários países1. O isolamento das ilhotas é um procedimento de várias etapas que inclui a digestão enzimática e mecânica quente do pâncreas, seguida de fases resfriadas para recuperação do tecido digerido e purificação das ilhotas com gradientes de densidade contínuos ou descontínuos em um processador celular. O resfriamento rápido retarda a fase de digestão enzimática e protege as ilhotas das enzimas digestivas liberadas pela contaminação das células acinares. O processador de células foi originalmente projetado para separar os componentes do sangue celular à temperatura ambiente2. Foi reaproveitado para purificar ilhotas pancreáticas humanas de Langerhans em 19893. Por três décadas, as ilhotas humanas foram purificadas para ensaios clínicos e, mais recentemente, padrão de atendimento, seja em um processador de células com gradientes descontínuos4 ou gradientes de densidade contínuos1 feito com um gradiente maker1 ou misturador operado por computador equivalente5,6,7. Outros grupos relataram purificação de ilhotas de grandes mamíferos e humanos usando grandes garrafas plásticas cilíndricas8,7,9, o que melhorou substancialmente a eficácia da purificação e a qualidade das ilhotas.
De fato, considerando o padrão-ouro para purificar ilhotas humanas para transplante clínico10,11, o processador de células fabricado estava sem refrigeração. Como consequência direta da falta de refrigeração, as ilhotas foram expostas a temperaturas crescentes durante a etapa de purificação. Durante a centrifugação, ocorre um aumento descontrolado da temperatura devido ao atrito mecânico do rotor12,13. Os processadores celulares foram adaptados com um sistema de resfriamento em centros de isolamento de ilhotas que aumentou estatisticamente a secreção de insulina induzida por glicose e a viabilidade celular, confirmando a vantagem de manter ilhotas pancreáticas em baixas temperaturas durante o procedimento de purificação14,15.
Deve-se notar que, no final da década de 1980, 10 protótipos refrigerados foram construídos para reduzir os danos às ilhotas durante a purificação do gradiente de densidade, mas não receberam mais atenção. Os protótipos do processador de células foram baseados no resfriamento do fuso e da tigela com polietilenoglicol resfriado. Em particular, as soluções de purificação de ilhotas, incluindo soluções de preservação de órgãos e gradientes de densidade de polissacarídeos, podem ser deletérias para a viabilidade das ilhotas quando usadas à temperatura ambiente ou acima dela16,17,18. Uma comparação de diferentes estratégias de resfriamento do processador de células para purificação de células de ilhotas versus o processador de células não refrigeradas original foi avaliada para combater o aumento descontrolado de temperatura que ocorre devido ao atrito do rotor. Várias tentativas foram feitas para resfriar o processador celular durante a purificação das ilhotas humanas. O processador de células pode ser alojado temporária ou permanentemente em uma câmara fria especialmente projetada para manter uma temperatura de 0-8 °C19 durante a centrifugação gradiente que é atualmente usada nos centros de isolamento de ilhotas da Universidade de Illinois Chicago19, University of Miami14, instalações da Universidade de Oxford15e a Universidade de São Francisco (a unidade de resfriamento personalizada envolve o processador da célula). Outra modificação inclui o resfriamento do núcleo do fuso do processador de células com um sistema de resfriamento usando resfriamento de nitrogênio líquido controlado eletronicamente em Genebra, Suécia e República Tcheca15,19. Outra alternativa em meados de 2000 foi o resfriamento do núcleo do processador da célula com uma unidade de ar condicionado12 ou por resfriamento líquido do eixo na Universidade de Lille.
As modificações de resfriamento do processador de célula não estão prontamente disponíveis e apresentam riscos (umidade, acúmulo de condensação) dentro de ambientes de sala limpa GMP, incluindo perda de garantia e recusa do construtor em fazer a manutenção da máquina. Consequentemente, alguns centros de ilhotas, incluindo Milão, Itália, Oslo, Noruega e Edimburgo, Escócia, não usam um sistema de resfriamento para processadores de células durante o processo de purificação das ilhotas15.
O estudo atual foi projetado para testar a eficácia de um cooler recém-desenvolvido e prontamente disponível em conjunto com um sistema de processador de célula minimamente modificado. Resumidamente, o resfriador à base de ar descrito aqui é um trocador de calor refrigerado mecanicamente que controla a temperatura de 1 pé cúbico padrão por minuto (SCFM) de gás seco entre -40 °C a -100 °C. Este sistema de resfriamento requer um suprimento de ar medicinal seco. O ar fluirá através da linha e do trocador de calor e sairá pelo bico (7.9 mm). Um aquecedor localizado dentro do bico fornece calor para controlar a temperatura do fluxo de ar. Uma tampa de centrífuga de plástico sólido sobressalente foi comprada e modificações mínimas foram feitas. Um orifício de 13,3 mm de diâmetro foi perfurado na tampa e o ar resfriado foi fornecido do bico do resfriador para o processador da célula através do orifício na tampa da centrífuga. O ar medicinal resfriado foi injetado dentro do recipiente de centrifugação do processador de células com controle constante da temperatura dos líquidos ou gradientes de densidade.
Avaliamos o desempenho técnico do processador de célula resfriada e o impacto do elemento de resfriamento no ambiente de sala limpa GMP. O foco principal era atingir uma temperatura robustamente baixa (<10 ° C) durante a purificação das ilhotas humanas para preservar a viabilidade. Usando uma separação de densidade de revestimento leucocitário como um proxy para o isolamento das ilhotas, determinamos a eficácia desse protocolo de resfriamento na viabilidade celular.

<table><tbody><tr><td><forte>Equipamento</forte>Contador de partículas de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ar</td><td>Lasair III&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AirJet XR40</td><td>Sistema FTS da SP Scientific</td><td>XR40</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de Biossegurança</td><td>Thermo Scientific</td><td>EQ-1301</td><td></td></tr><tr><td>Chiller de Resfriamento Circulante</td><td>Julabo</td><td>CF30</td><td></td></tr><tr><td>COBE 2991&nbsp;</td>Bandeja de Resfriamento Cônica <td>Terumo BCT</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biorep</td><td>CCT-01</td><td></td></tr><tr><td>Fabricante de gradiente duplo revestido&nbsp;</td><td>personalizado em casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KJT-Termômetro de Termopar</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI93551N</td><td>Para medir a temperatura de líquidos</td></tr><tr><td>Agitador magnético&nbsp;</td><td>Bomba</td><td>peristáltica Thermo Scientific 88880014</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Termômetro MasterFlex</td><td>MK-77921-79</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Extech Instruments</td><td>RMS 430</td><td>Para Banho</td></tr> de <tr><td>Contas Sem Água</td> de Temperatura COBE <td>Cole-Parmer</td><td>10122-00</td><td></td></tr><tr><td>Materiais e reagentes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD kit de enumeração de células-tronco</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>344563</tr><tr><td>Kit de tubulação COBE 2911</td><td>Terumo BCT</td><td>90819</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos 250ml</td><td>Corning</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>Densidade gradiente 1.1</td><td>Biochrom&nbsp;</td><td>L6155</td><td></td></tr><tr><td>Garrafas descartáveis graduadas</td><td>Thermo fisher</td><td>382019-1000</td><td></td></tr><tr><td>Albumina humana 20%&nbsp;</td><td>Kedrion Biopharma</td><td>8091600</td><td></td></tr><tr><td>M199 solução de lavagem&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>99-784-CM&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Masterflex</td><td>Masterflex</td><td>96400-6</td><td></td></tr><tr><td>Medical Dry Air</td><td>Linde Healthcare</td><td>Medi On 22</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin-estreptomicina&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Thermoprobe</td><td>Biorep</td><td>TC-02</td><td>Thermosensor</td></tr><tr><td>Trypan blue&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Universidade de Wisconsin Belzer (UW)&nbsp;</td><td>Ponte da Vida&nbsp;</td><td>RM/N 4055</td><td>Meio de Conservação</td></tr></tbody></table>

avaliação do impacto de um novo sistema de processador de células de resfriamento na instalação de isolamento de células de ilhotas

Evaluation of the Impact of a New Cooling Cell Processor System on Islet Cell Isolation Facility

O equipamento de terapia celular padrão, incluindo o processador de células padrão-ouro para purificar ilhotas humanas para transplante clínico, raramente é refrigerado, potencialmente expondo as células a temperaturas elevadas durante a etapa de centrifugação. Os sistemas de resfriamento personalizados têm um benefício direto na viabilidade e função das ilhotas humanas. O estudo atual foi projetado para testar a eficácia de um sistema de processador de célula resfriado recém-desenvolvido e prontamente disponível que requer modificações mínimas e para avaliar seu impacto na viabilidade da célula humana e no ambiente de sala limpa GMP. O sistema de resfriamento, um trocador de calor refrigerado mecanicamente ajustado a -30 ° C, foi usado para fornecer ar seco de grau médico resfriado ao recipiente do processador de células através de um orifício perfurado na tampa da centrífuga. Com a disponibilidade limitada de doadores de pâncreas no Catar, a validação do sistema foi feita com purificação contínua por gradiente de densidade do revestimento buffy da medula óssea humana. Esterilidade, turbulência e contagem de partículas foram medidas em ambientes de sala limpa classe C e classe B. Nenhuma turbulência se desenvolveu em torno do processador de célula resfriada e nenhum excesso de partículas transportadas pelo ar de 0,5 μm e 5 μm foi gerado de acordo com os padrões GMP de sala limpa. No início e no final das etapas de coleta, a temperatura subiu respectivamente para 21,50 °C ± 0,34 °C e 21,93 °C ± 0,20 °C no processador de célula não refrigerada e para apenas 10,9 °C ± 0,17 °C e 11,16 °C ± 0,35 °C no processador de célula resfriada (p <0,05). O processador de células resfriadas levou a uma melhor recuperação (98%) da fração de células mononucleares e viabilidade (100% ± 2%) pós-processamento. O novo sistema de resfriamento reduz efetivamente o calor produzido pelo processador da célula, sem ter impacto de partículas no ambiente da sala limpa GMP. O processador de célula resfriada descrito aqui é um método barato (US$ 16.000 sem incluir impostos, desembaraço aduaneiro e transporte) e minimamente invasivo para fornecer resfriamento robusto. Atualmente, essa tecnologia na instalação de terapia celular GMP está sendo aplicada ao isolamento e transplante de células de ilhotas humanas para o programa clínico.

O impacto do processador de células refrigerado na sala limpa GMP foi primeiramente quantificado. Métodos padronizados utilizaram um contador de partículas para medir a contaminação por partículas aéreas em ambientes de salas limpas de classe C e classe B segundo a classificação GMP, em pontos críticos próximos ao processador de células e ao sistema de refrigeração a ar pressurizado. Os resultados demonstraram que nenhuma turbulência se desenvolveu ao redor do equipamento. Os dados registrados mostraram que não houve exc...

O protocolo aqui descreve um sistema de processador de célula de resfriamento personalizado que é compatível com uma sala limpa de boas práticas de fabricação (GMP) para melhorar a viabilidade da célula pós-processamento.

Avaliação do impacto de um novo sistema de processador de células de resfriamento na instalação de isolamento de células de ilhotas

Standard cell therapy equipment, including the gold standard cell processor to purify human islets for clinical transplantation, is rarely refrigerated, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Alcançar alta qualidade e quantidade adequada de ilhotas humanas é um dos pré-requisitos importantes para o transplante de ilhotas bem sucedido. Neste vídeo, descrevemos passo a passo os procedimentos para o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas (parte I: a digestão e coleta de tecido pancreático), utilizando um método modificado automatizado.

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte I: Digestão e Coleta de tecido pancreático

Alcançar alta qualidade e quantidade adequada de ilhotas humanas é um dos pré-requisitos importantes para o transplante de ilhotas bem sucedido. Neste vídeo, descrevemos passo a passo os procedimentos para o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas (parte II: purificação e cultura de ilhotas humanas) utilizando um método modificado automatizado.

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte II: Purificação e Cultura de Ilhotas Humanos

Um dispositivo perifusion microfluídicos ilhota foi desenvolvido para a avaliação dinâmica da secreção de insulina de ilhotas múltiplo e imagens de fluorescência simultânea de influxo de cálcio e mitocondrial possíveis mudanças.

A Multi-Parametric Sistema Perifusion Islet dentro de um dispositivo Perifusion microfluídicos

Transplante de ilhotas isoladas foi proposto para ser um potencial tratamento para diabetes tipo 1. Aqui nós descrevemos um método para isolar ilhotas de rato pancreata e transplantá-las para o espaço subcapsular do rim.

Um método para isolamento de ilhotas murino e transplante renal subcapsular

O fornecimento de diabéticos tipo 2 ilhotas para pesquisa é insuficiente. Aqui nós compartilhamos nosso protocolo para isolar ilhotas de pacientes submetidos à pancreatectomia parcial. Esta abordagem representa um local único para a obtenção de ilhotas de diabéticos tipo 2 e clinicamente combinado não-diabéticos em número adequado para estudos básicos e clínicos.

Isolamento de Ilhotas Humanos de pacientes parcialmente pancreatectomizado

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Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos

Este protocolo fornece um guia passo a passo para a aquisição de um pâncreas suíno para isolamento e purificação de ilhotas.

Perfusão Cirúrgica e Isolamento do Pâncreas Suíno para Isolamento de Ilhotas

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Um método simples e rápido para isolamento simultâneo de ilhotas primárias e células acinares pancreáticas primárias de camundongos

Este protocolo descreve um método padronizado para colheita cirúrgica, digestão enzimática e purificação por gradiente de densidade de ilhéus pancreáticos de rato Lewis, permitindo preparações de alto rendimento e alta pureza para uso direto em transplantes ou estudos in vitro .

Isolamento e purificação de ilhotas pancreáticas a partir de ratos Lewis usando digestão enzimática e separação por gradiente de densidade

Ole Isacson dá uma visão geral concisa da doença de Parkinson é, suas causas, as estratégias terapêuticas e avanços na pesquisa de Parkinson.

Ole Isacson: desenvolvimento de novas terapias para a doença de Parkinson

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Avaliação do impacto de um novo sistema de processador de células de resfriamento na instalação de isolamento de células de ilhotas (Vídeo) | JoVE Journal

Avaliação do impacto de um novo sistema de processador de células de resfriamento na instalação de isolamento de células de ilhotas

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