Isolamento de Núcleos de Células Progenitoras Cardíacas de Camundongos para Perfil de Epigenoma e Expressão Gênica em Resolução Unicelular
May 12th, 2023
Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo a preparação de núcleos celulares. Após microdissecção e dissociação enzimática do tecido cardíaco em células únicas, as células progenitoras foram congeladas, seguidas pelo isolamento de células viáveis puras, que foram usadas para sequenciamento de RNA de núcleo único e o ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com análises de sequenciamento de alto rendimento.
O principal objetivo deste protocolo é estudar a interação de fatores genéticos e ambientais no contexto do desenvolvimento cardíaco e sua contribuição para as cardiopatias congênitas. Abordagens de núcleos únicos, como RNA-seq de núcleo único e núcleo único atáxico, estão emergindo como métodos-chave para estudar a heterogeneidade celular na saúde e na doença durante o desenvolvimento cardíaco. Uma etapa limitante desses experimentos é que toda a amostra deve ser executada simultaneamente.
Ao trabalhar com todas as condições experimentais, coletar material fresco o suficiente para todas as condições simultaneamente pode ser um desafio. Embora tenha havido um progresso significativo no campo em célula única nos últimos anos, a principal dificuldade é o processamento de amostras livres. Evitar a dificuldade é extremamente benéfico para identificar o mecanismo molecular subjacente aos defeitos congênitos da cardiopatia.
Este protocolo descreve os passos a seguir para isolar com sucesso núcleos de alta qualidade de suspensão de células cardíacas congeladas obtidas de embriões de camundongos. E nosso protocolo é compatível com RNA-seq de núcleo único a jusante e atáxico de núcleo único. Esperamos que este procedimento ajude os pesquisadores interessados e os encoraje a usar este poderoso método em suas pesquisas.
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Visão Geral
Este protocolo descreve a preparação de núcleos celulares a partir de tecido cardíaco para estudar o desenvolvimento do coração e defeitos cardíacos congênitos. Ele enfatiza a importância das abordagens de núcleos únicos na compreensão da heterogeneidade celular em saúde e doença.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia cardíaca
- Heterogeneidade celular
- Defeitos cardíacos congênitos
Fundo
- O sequenciamento de RNA de núcleos únicos é um método-chave para estudar o desenvolvimento do coração.
- Compreender as interações genéticas e ambientais é crucial para abordar defeitos cardíacos congênitos.
- Processar amostras frescas continua sendo um desafio significativo nesses estudos.
- Identificar os mecanismos moleculares subjacentes às doenças cardíacas congênitas é essencial para avançar no tratamento.
Objetivo do Estudo
- Investigar a interação de fatores genéticos e ambientais no desenvolvimento do coração.
- Contribuir para a compreensão dos defeitos cardíacos congênitos.
- Utilizar abordagens de núcleos únicos para estudar a heterogeneidade celular.
Métodos Utilizados
- Microdissecção do tecido cardíaco.
- Dissacarização enzimática para obter células únicas.
- Congelamento e isolamento de células progenitoras viáveis.
- Sequenciamento de RNA de núcleo único e ensaios de acessibilidade da cromatina.
Principais Resultados
- Preparação bem-sucedida de núcleos celulares viáveis puros.
- Insights sobre a heterogeneidade celular durante o desenvolvimento do coração.
- Identificação de mecanismos moleculares relacionados a defeitos cardíacos congênitos.
- Demonstração da viabilidade das abordagens de núcleos únicos na pesquisa cardíaca.
Conclusões
- As técnicas de núcleos únicos são eficazes para estudar o desenvolvimento do coração.
- Compreender a heterogeneidade celular é vital para abordar defeitos cardíacos congênitos.
- Mais pesquisas são necessárias para refinar esses métodos e melhorar o processamento das amostras.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Single-nucleus isolation from frozen mouse cardiac progenitor cells enables high-resolution epigenomic and transcriptomic profiling, overcoming the limitations of fresh tissue requirements. This capability supports robust investigation of cellular heterogeneity and regulatory mechanisms in heart development, directly impacting early discovery and target validation for congenital heart disease. Flexible sample handling and compatibility with dual-omics platforms enhance portfolio-wide experimental design and data integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene regulatory networks in cardiac progenitor populations.
- Supports functional target validation by linking chromatin state to gene expression at single-cell resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking of candidate pathways implicated in congenital heart defects.
- Improves predictive confidence in early-stage cardiac disease models.
Screening & Assay Development
- Provides high-quality nuclei preparations suitable for standardized snRNA-seq and snATAC-seq workflows.
- Reduces technical variability by allowing batch processing of frozen samples across experimental conditions.
- Enables reproducible quantitative outputs for downstream compound or genetic perturbation screens.
- Supports scalable integration with microfluidic and high-throughput sequencing platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant cardiac progenitor systems.
- Maintains translational continuity from discovery through preclinical validation by preserving sample integrity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust single-cell data.
- Supports identification of translational biomarkers for congenital heart disease research.
Pipeline & Workflow Integration
This nuclei isolation protocol positions itself at the interface of early discovery and preclinical research, enabling dual-omics profiling from frozen cardiac samples and supporting iterative hypothesis testing across the discovery continuum.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven analysis of gene expression and chromatin accessibility in cardiac progenitors.
- Screening: Delivers reproducible nuclei inputs for high-throughput sequencing assays.
- Analytics: Provides quantitative single-nucleus data for comparative condition analysis.
- Translational Research: Preserves disease-relevant cellular states for biomarker and mechanism studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable workflow for cardiac single-nucleus studies across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac target validation.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible, and scalable nuclei isolation from frozen samples.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization and cross-study data integration for cardiac research programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, cell handling, and nuclei isolation techniques.
- Demands access to microfluidic platforms and high-throughput sequencing infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and viability assessment protocols.
- Adaptable to various cardiac developmental stages and experimental models.
- Dependent on rigorous quality control of nuclei integrity and viability prior to sequencing.
