Name: Enriquecimento de mRNA e preparação de bibliotecas de bissulfito-mRNA para sequenciamento de próxima geração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprenda o enriquecimento de mRNA e preparação de bibliotecas de bissulfito-mRNA para sequenciamento de próxima geração. Este método permite identificar RNAs diferencialmente metilados envolvidos na progressão tumoral em câncer de pâncreas.

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Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia de Taiwan. [NSTC 111-2314-B-006-003]

1. Purificação do RNA poli(A)
NOTA: Use o RNA total tratado com DNase I e examine a qualidade e integridade do RNA total por eletroforese capilar ou gel convencional antes de proceder à purificação do RNA poli(A). Os investigadores devem ser capazes de identificar as bandas ribossomais 28S e 18S rRNA no campo de alto peso molecular e a banda 5.8S rRNA no campo de baixo peso molecular sem bandas de esfregaço significativas no eletroferograma. As etapas de purificação seguem essencialmente as instruções do fabricante, com pequenas modificações indicadas nas etapas específicas. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais e instrumentos utilizados neste protocolo.
<ol><li>Preparação<ol><li>Aquecer o reagente, tampão de lavagem, esferas de oligo(dT) e tampão de lise à temperatura ambiente por 30 minutos antes de realizar os procedimentos a seguir.</li>
		<li>Para o isolamento de RNA enriquecido com poli(A), prepare 10-20 μg de uma alíquota de RNA total de alta qualidade como material de partida, transferindo uma quantidade adequada de RNA para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL livre de nuclease. Incubar no bloco de calor a 70 °C durante 5 minutos e, em seguida, manter no gelo durante 2 minutos. NOTA: As quantidades de ARN total como material de partida devem ser ajustadas adequadamente em função da quantidade desejada de ARNm e da natureza das células utilizadas. Empiricamente, o RNA enriquecido com poli(A) pode ser responsável por 1-5% de abundância no RNA total. Uma alíquota de 10 μg de RNA total de alta qualidade deve fornecer RNA enriquecido com poli(A) de alta qualidade na faixa de 100-500 ng para a conversão de bissulfito a jusante.</li>
		<li>Enquanto isso, ressuspenda totalmente as contas oligo(dT). Transfira as quantidades necessárias de suspensão de contas para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e, em seguida, coloque no ímã por 3 minutos até que as esferas magnéticas formem um grânulo. NOTA: Use 50 μL de esferas oligo(dT) para 10 μg de entrada total de RNA. O volume de contas nesta etapa pode ser ainda mais otimizado dependendo das células usadas.</li>
		<li>Retire o sobrenadante e ressuspenda as esferas oligo(dT) com quantidades iguais (o volume da suspensão de esferas utilizada na etapa 1.1.3.) do tampão de lise e coloque no íman durante 3 minutos antes de remover o sobrenadante. OBS: Não seque demais as contas; O usuário deve avançar rapidamente para a etapa 1.2.1.</li>
	</ol></li>
	<li>A primeira rodada de purificação<ol><li>Adicione tampão de lise ao tubo de amostra de RNA (relação de volume 4:1) e misture completamente antes de transferir para as esferas de oligo(dT). NOTA: Se o volume da amostra de ARN for de 20 μL, adicione 80 μL de tampão de lise.</li>
		<li>Ressuspenda totalmente a mistura de RNA: tampão de lise e esferas de oligo(dT) pipetando pelo menos 10x.</li>
		<li>Deixar incubar as amostras com rotação contínua durante 15 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Colocar a amostra no íman durante 5 min ou até que o sobrenadante esteja límpido; Descarte o sobrenadante.</li>
		<li>Adicione 600 μL de Wash Buffer 1 às contas e misture cuidadosamente para ressuspender as contas.</li>
		<li>Colocar o tubo sobre o íman durante 5 minutos ou até que o sobrenadante esteja límpido, elimine o sobrenadante e repita o passo de lavagem 1.2.5 uma vez.</li>
		<li>Lave as contas adicionando 300 μL de Wash Buffer 2 e ressuspenda suavemente as contas.</li>
		<li>Colocar o tubo no iman durante 5 minutos ou até que o sobrenadante esteja límpido, eliminar o sobrenadante e repetir o passo de lavagem 1.2.7 uma vez.</li>
		<li>Adicionar 30 μL de Tris-HCl (tampão de eluição) a frio de 10 mM ao tubo de amostra e incubar a 70 °C durante 5 minutos.</li>
		<li>Transfira rapidamente o tubo para o ímã e, quando a suspensão estiver límpida após 20 s ou mais, transfira o sobrenadante contendo RNA enriquecido com poli(A) eluído para o novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>A segunda rodada de purificação<ol><li>Adicionar 120 μL (4x o volume da amostra eluída) tampão de lise à amostra de RNA eluída e misturar completamente.</li>
		<li>Lave as contas usadas na primeira rodada de purificação com uma quantidade igual de tampão de lise como etapa 1.1.4, pipetar 10x para ressuspender as contas e, em seguida, colocá-las no ímã por 5 min antes de descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Transfira a mistura de RNA: tampão de lise para as esferas lavadas e misture completamente pipetando pelo menos 10x.</li>
		<li>Incubar a amostra com rotação contínua durante 15 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Repita as etapas 1.2.4 a 1.2.8 para remover o sal e outros subtipos de RNA. NOTA: O volume do tampão de lavagem pode ser reduzido para 300 μL de tampão de lavagem 1 e 150 μL de tampão de lavagem 2.</li>
		<li>Adicionar 25 μL (volume desejado) de Tris-HCl (tampão de eluição) a frio de 10 mM ao tubo de amostra e incubar a 70 °C durante 5 minutos.</li>
		<li>Transfira rapidamente o tubo para o ímã e, quando a suspensão estiver límpida após 20 s ou mais, transfira o sobrenadante contendo RNA enriquecido com poli(A) eluído para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Transferir tubos de 2,2 μL para 8 tiras para avaliação da qualidade da quantidade e qualidade do RNA usando ensaios de alta sensibilidade de RNA.</li>
		<li>Conservar a amostra a -20 °C por curtos períodos e -70 °C por um período mais longo. Observação : isso pode ser um ponto de pausa no protocolo.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Conversão de bissulfito
OBS: As etapas de centrifugação foram todas realizadas à temperatura ambiente. Os procedimentos são essencialmente realizados de acordo com as instruções do fabricante, mas com uma etapa adicional 2.2 para adicionar a(s) sequência(s) de mRNA de controle spike-in antes da etapa 2.3 da reação de bissulfito.
<ol><li>Transfira 19 μL de amostra purificada de RNA enriquecido com poli(A) para um tubo de 8 tiras de 0,2 mL.</li>
	<li>Adicionar 1,0 μL de controle spike-in, que está livre de quaisquer modificações na razão de quantidade predeterminada de 1:10.000 (ou seja, 0,1 ng de mRNA de luciferase: 1 μg de RNA purificado enriquecido com poli(A) na amostra de RNA da etapa 2.1. NOTA: A sequência de controle de spike-in pode ser Firefly luciferase RNA, Renilla luciferase, ou sequência de RNA transcrito in vitro sem citosinas metiladas.</li>
	<li>Adicione 130 μL de regente de conversão ao tubo e inverta suavemente várias vezes para uma mistura completa.</li>
	<li>Coloque o tubo na máquina de PCR e execute três ciclos de aquecimento a 70 °C por 10 min, seguido de incubação a 64 °C por 45 min cada e, em seguida, uma etapa final para resfriar até 4 °C.</li>
	<li>Coloque a coluna no tubo de coleta e transfira 250 μL de tampão de ligação de RNA para a coluna.</li>
	<li>Transferir a amostra do passo 2.4 para a coluna do passo 2.5 e pipetar completamente.</li>
	<li>Adicione 400 μL de 95-100% de etanol à coluna, feche rapidamente a tampa e inverta várias vezes.</li>
	<li>Centrifugar a 10.000 × g por 30 s a 25 °C e descartar o fluxo.</li>
	<li>Adicionar 200 μL de tampão de lavagem de RNA à coluna.</li>
	<li>Centrifugar a 10.000 × g por 30 s a 25 °C e descartar o fluxo.</li>
	<li>Adicionar 200 μL de tampão de dessulfonação e incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos.</li>
	<li>Centrifugar a 10.000 × g por 30 s a 25 °C e descartar o fluxo.</li>
	<li>Adicionar 400 μL de tampão de lavagem de ARN e centrifugar a 10.000 × g durante 30 s a 25 °C e eliminar o fluxo. Repita esta etapa uma vez.</li>
	<li>Centrifugar novamente a 10.000 × g durante 2 min a 25 °C para remover completamente o tampão de lavagem residual. NOTA: O outro passo de centrifugação 2.14 durante 2 minutos antes da eluição é remover completamente o tampão de lavagem. A etapa de lavagem é realizada duas vezes para lavar o componente com alto teor de sal do reagente de bissulfito e o tampão de dessulfonação na coluna.</li>
	<li>Transfira a coluna para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Adicionar 20-30 μL de H2O sem nuclease à coluna e repousar à temperatura ambiente durante 1 min.</li>
	<li>Centrifugar a 10.000 × g por 30 s a 25 °C.</li>
	<li>Transferir 2,2 μL para tubos de 8 tiras para a avaliação da quantidade e qualidade do RNA.</li>
	<li>Conservar a amostra de ARN tratada com bissulfito a -20 °C por curtos períodos e -70 °C por um período mais longo. Observação : isso pode ser um ponto de pausa no protocolo.</li>
</ol>3. Preparação da biblioteca de mRNA tratada com bissulfito
NOTA: Siga a seção 4 do protocolo de instrução de preparação da biblioteca para uso com mRNA purificado ou RNA depletado. O primeiro priming deve seguir o protocolo de RNA FFPE, uma vez que o tratamento com bissulfito fragmenta o RNA. Execute cada etapa na capela de fluxo laminar e adicione a mistura de reação em um rack de resfriamento refrigerado por gelo.
<ol><li>Priming do RNA de entrada<ol><li>Transfira a quantidade desejada de amostra de mRNA tratada com bissulfito em um máximo total de 5 μL ou adicione H2O livre de nuclease para fazer um total de 5 μL. NOTA: Um mínimo de 10 ng de mRNA tratado com bissulfito como entrada é recomendado para este tipo de preparação de biblioteca de RNA e para gerar a molaridade final do produto de biblioteca de 4nM.</li>
		<li>Adicionar 1 μL de primer aleatório (lilás) à amostra e misturar por pipetagem.</li>
		<li>Colocar o tubo de amostra na máquina de PCR preajustada a 65 °C e tampar a 105 °C durante 5 min e segurar a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese de cDNA de primeira fita<ol><li>Adicionar 4 μL de tampão de reação de síntese (lilás), 8 μL de reagente de especificidade de fita (marrom) e 2 μL de mistura enzimática de síntese (marrom) à amostra, o que perfaz um volume total de 20 μL. Misture bem pipetando pelo menos 10x e gire rapidamente para baixo.</li>
		<li>Colocar o tubo de amostra na máquina de PCR predefinida a 25 °C durante 10 min, 42 °C durante 50 min, 70 °C durante 15 min e segurar a 4 °C. NOTA: Para pastilhas acima de 200 bases, sugere-se um período de incubação de 42 °C de 50 min; para o tamanho da pastilha inferior a 200 bases, sugere-se um período de incubação de 42 °C de 15 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese de cDNA de segunda fita<ol><li>Adicionar 8 μL de tampão de reação de síntese com mistura de dUTP (laranja), 4 μL de mistura de enzimas de síntese (laranja) e 48 μL de H2O livre de nuclease. Misture completamente pipetando pelo menos 10x e gire rapidamente para baixo.</li>
		<li>Colocar o tubo de amostra na máquina de PCR preajustada a 16 °C durante 1 h com a tampa afastada ou ≤40 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificação de cDNA de fita dupla com esferas de purificação de DNA<ol><li>Pré-aqueça as contas de purificação de DNA 30 minutos antes de realizar a purificação e vórtice para ressuspender as contas.</li>
		<li>Adicionar 144 μL de contas de purificação de ADN ressuspensas à amostra de cADN do passo 3.3.2 e misturar cuidadosamente pipetando pelo menos 10x.</li>
		<li>Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.</li>
		<li>Coloque o tubo de amostra em um rack magnético por 5 min até que a solução esteja límpida e, em seguida, remova o sobrenadante e mantenha as esferas que contêm DNA.</li>
		<li>Adicionar 200 μL de etanol 80% recém-feito ao tubo com as contas, mantendo a amostra no rack magnético e incubar à temperatura ambiente por 30 s.</li>
		<li>Retire o sobrenadante e repita o passo 3.4.5 uma vez, mas desta vez remova cuidadosamente todo o sobrenadante residual.</li>
		<li>Seque as contas ao ar por 1-5 min, mantendo a amostra no ímã. OBS: Não seque demais as contas; A cor deve ser marrom escuro.</li>
		<li>Remova a amostra do rack magnético e elute o DNA adicionando 53 μL de tampão 0,1x TE (10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA, pH 8,0) às contas. Misture bem pipetando pelo menos 10x e incube à temperatura ambiente durante 2 min.</li>
		<li>Coloque o tubo no rack magnético por 5 min ou até que a solução esteja límpida.</li>
		<li>Transferir 50 μL de sobrenadante contendo cDNA de fita dupla para um novo tubo de 8 tiras. NOTA: O protocolo pode ser interrompido neste ponto e a amostra pode ser armazenada a -30 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação final da biblioteca de cDNA<ol><li>Adicionar 7 μL de tampão de reação de polimento final (verde) e 3 μL de mistura enzimática de polimento final (verde) à amostra de cDNA de fita dupla eluída.</li>
		<li>Misture a mistura pipetando 10x com uma configuração de volume de 50 μL sem criar bolhas e, em seguida, gire rapidamente a amostra.</li>
		<li>Colocar a amostra numa máquina de PCR e incubar a 20 °C durante 30 min, 65 °C durante 30 minutos e segurar a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligadura do adaptador<ol><li>Diluir o adaptador (vermelho) de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Adicionar 2,5 μL do adaptador diluído, 1 μL de intensificador de ligadura (vermelho) e 30 μL de Ligation Master Mix (vermelho) à amostra.</li>
		<li>Misture a mistura pipetando 10x com uma configuração de volume de 80 μL sem criar bolhas e, em seguida, gire rapidamente a amostra.</li>
		<li>Colocar a amostra numa máquina de PCR e incubar a 20 °C durante 15 minutos.</li>
		<li>Adicionar 3 μL da mistura de uracila DNA glicosilase e DNA glicosilase-liase endonuclease VIII (azul) à amostra e pipetar completamente.</li>
		<li>Recolocar a amostra na máquina de PCR e incubar a 37 °C durante 15 min com a tampa regulada para 75 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificação de cDNAs tratados com reação de ligadura NOTA: A seleção de tamanho com contas SPRIselect ou, opcionalmente, com contas AMpure XP pode ser usada para essa finalidade18.<ol><li>Pré-aqueça as contas 30 min antes de realizar a purificação e vórtice para ressuspendê-las.</li>
		<li>Transferir 25 μL de contas ressuspensas para a amostra de cDNA a partir do passo 3.6.6 e misturar cuidadosamente pipetando pelo menos 10x.</li>
		<li>Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.</li>
		<li>Coloque o tubo de amostra em um rack magnético por 5 min até que a solução esteja límpida e, em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de 8 tiras e descarte as contas.</li>
		<li>Adicionar 10 μL de contas ressuspensas ao sobrenadante e misturar cuidadosamente pipetando pelo menos 10x.</li>
		<li>Coloque o tubo de amostra num rack magnético durante 5 minutos até que a solução esteja límpida e, em seguida, elimine o sobrenadante e não perturbe as contas.</li>
		<li>Adicionar 200 μL de etanol 80% recém-feito ao tubo com as contas, mantendo a amostra no rack magnético e incubar à temperatura ambiente por 30 s.</li>
		<li>Remova o sobrenadante e repita o passo 3.7.7 uma vez, mas desta vez remova cuidadosamente todo o sobrenadante residual.</li>
		<li>Seque as contas ao ar por 1-5 min, mantendo a amostra no ímã. OBS: Não seque demais as contas; A cor deve ser marrom escuro.</li>
		<li>Remova a amostra do rack magnético e elimine o DNA adicionando 17 μL de tampão 0,1x TE às contas. Misture bem pipetando pelo menos 10x e incube à temperatura ambiente durante 2 min.</li>
		<li>Coloque o tubo no rack magnético por 5 min até que a solução esteja límpida.</li>
		<li>Transferir 15 μL de sobrenadante, que contém dsDNA preparado para o alvo para um novo tubo de 8 tiras.</li>
	</ol></li>
	<li>Enriquecimento por PCR de DNA ligado a adaptadores<ol><li>Adicionar 25 μL da mistura principal (azul), 5 μL do primer adaptador de 5' e 5 μL do primer do adaptador de 3' à amostra de ADN ligada ao adaptador. Misture bem pipetando pelo menos 10x.</li>
		<li>Colocar a amostra na máquina de PCR e realizar a amplificação da PCR seguindo os seguintes passos: (1) 98 °C por 30 s, (2) 98 °C por 10 s, (3) 65 °C por 75 s, (4) 65 °C por 5 min e (5) segurar a 4 °C; em que os passos (2) e (3) devem repetir-se para um número de ciclo N+2 em que N é igual à quantidade de RNA de entrada no manual de instruções. Isso significa que 2 ciclos adicionais são necessários devido à seleção de tamanho de dupla face das amostras realizada na etapa 3.7. NOTA: Por exemplo, 8 ng da entrada de mRNA purificada seriam recomendados com 9-10 ciclos de PCR; mas com cDNA ligado, selecionado em tamanho duplo, na etapa 3.7, o ciclo de PCR recomendado seria de 11-12 ciclos.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificação de bibliotecas amplificadas por PCR<ol><li>Pré-aqueça as contas de purificação de DNA por 30 minutos antes de realizar a purificação e o vórtice para ressuspender as contas.</li>
		<li>Transferir 45 μL (0,9x) de contas ressuspensas para o produto de PCR a partir da etapa 3.8.2 e misturar completamente pipetando pelo menos 10x.</li>
		<li>Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.</li>
		<li>Coloque o tubo de amostra em um rack magnético por 5 min até que a solução esteja límpida e, em seguida, remova o sobrenadante e mantenha as contas que contêm DNA.</li>
		<li>Adicione 200 μL de etanol 80% recém-feito ao tubo com as contas, deixe a amostra no rack magnético e deixe repousar à temperatura ambiente por 30 s.</li>
		<li>Retire o sobrenadante e repita o passo 3.9.5 uma vez, mas desta vez remova cuidadosamente todo o sobrenadante residual.</li>
		<li>Seque as contas ao ar por 1-5 min, mantendo a amostra no ímã. OBS: Não seque demais as contas; A cor deve ser marrom escuro.</li>
		<li>Retire a amostra do rack magnético e adicione 22 μL de tampão 0,1x TE às esferas para eluir o DNA. Misture bem pipetando pelo menos 10x e incube à temperatura ambiente durante 2 min.</li>
		<li>Coloque o tubo no rack magnético e deixe-o repousar por 5 min ou até que a solução esteja límpida à temperatura ambiente.</li>
		<li>Transfira 20 μL de sobrenadante para um novo tubo de 8 tiras.</li>
		<li>Transferir tubos de 2,2 μL para 8 tiras para avaliação da qualidade da quantidade e qualidade da biblioteca. NOTA: A quantidade da biblioteca também pode ser detectada por qPCR (consulte a Tabela de Materiais).</li>
		<li>Conservar a amostra da biblioteca bsRNA-seq a -20 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>

Criando bibliotecas robustas de bissulfito-mRNA para mapeamento em toda a transcritoma

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<li>Mateos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+m6A+and+m5C+RNA+modifications+at+single-molecule+resolution+from+Nanopore+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+parameters+in+RNA+bisulfite+sequencing+data+generation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22NAR+Genomics+and+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis.</a> NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045(2022).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+calibration+of+epitranscriptomic+maps+using+a+synthetic+modification-free+RNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library.</a> Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).</li>
<li>Chao, H. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Neste protocolo, um pipeline detalhado de enriquecimento de poli(A), conversão de bissulfito e preparação de bibliotecas foi obtido utilizando componentes padronizados. Análises posteriores de sequenciamento forneceram a identificação do RNAm 5-metilcitosina nas amostras de interesse.
A etapa crítica é a qualidade do material de partida - RNA total - uma vez que a degradação do RNA impactaria a taxa de recuperação da purificação do RNA poli(A). A amostra deve ser cuidadosamente manuseada e a c...

Entre mais de 150 tipos de modificações pós-transcricionais1, a modificação da 5-metilcitosina (m5C) foi identificada em vários tipos de RNAs, incluindo RNA ribossomal, RNA de transferência, RNA mensageiro, micro RNA, RNA longo não codificante, RNA de abóbada, RNA intensificador e RNAs específicos do corpo cajalpequeno 2. O RNA m 5 C está associado a diversos mecanismos biológicos e patológicos, tais como regulação do desenvolvimento radicular de plantas3, expressão gênica viral4 e progressão do câncer5. O objetivo deste protocolo é fornecer pipelines simplificados para caracterizar o perfil de modificação do mRNA m5C do transcriptoma de amostras biológicas em diferentes estágios de desenvolvimento ou no cenário da doença. O sequenciamento transcriptoma-amplo de bissulfito foi desenvolvido para caracterizar as posições e os níveis quantitativos de metilação da citosina no RNA convertido em bissulfito na resolução do par de bases 6,7,8,9. Isto é particularmente útil quando se estuda a associação de m5C com a expressão gênica e o destino do RNA que está envolvido nos mecanismos biológicos regulatórios em células. Na célula de mamíferos, existem dois leitores m 5 C conhecidos: ALYREF pode reconhecer m 5 C no núcleo e serve como um transportador de núcleo de RNAm para citosol10, enquanto YBX1 pode reconhecer m5C no citoplasma e aumentar a estabilização de RNAm11. Foram relatados mRNAs5 Caberrantes relacionados a vias imunes em células T CD4+ do lúpus eritematoso sistêmico12. Estudos têm revelado associação entre modificação do RNAmm 5C e modulação da imunidade do câncer e progressão do câncer13,14. Assim, o mapeamento do perfil demodificação dom5 C no RNAm pode fornecer informações cruciais para elucidar o potencial maquinário regulatório.
Para investigar os papéis funcionais da modificação do RNAm 5 C sob certas condições biológicas, as abordagens baseadas na conversão de bissulfito (bsRNA-seq) e no enriquecimento por afinidade de anticorpos, como m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq e 5-Aza-seq, podem ser combinadas com a plataforma de sequenciamento de alto rendimento para fornecer detecção eficiente de regiões e sequências alvo com as modificações de m5C em uma escala de transcriptoma15, 16º. A vantagem deste protocolo fornece a paisagem abrangente do RNA m 5 C em uma resolução de base única, uma vez que a abordagem baseada no enriquecimento por afinidade de anticorpos depende da disponibilidade de anticorpos de alta qualidade e poderia alcançar a resolução de fragmentoúnico da paisagem de metilação de m5C17.
Todas as amostras de RNA serão processadas com duas rodadas de enriquecimento de RNAm usando esferas de oligo(dT), três ciclos de reação de bissulfito e a preparação da biblioteca de sequenciamento. Para monitorar a qualidade do RNA, cada amostra de RNA será examinada por eletroforese em gel capilar antes e após os procedimentos de purificação do RNAm e reação de bissulfito para avaliar a distribuição dos fragmentos. As bibliotecas purificadas serão examinadas por suas qualidades de amplificação de PCR, fragmentos de distribuição de tamanho de DNA por eletroforese em gel capilar e suas quantidades totais examinadas por ensaios quantitativos baseados em corantes de fluorescência antes do sequenciamento. O sistema também pode ser usado para analisar um amplo espectro de amostras biológicas, como produtos agrícolas, vírions isolados, linhagens celulares, organismos modelo e espécimes patológicos.

<table><tbody><tr><td>Sistema de bioanalisador de eletroforese Agilent 2100</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td></td><td>Detecção de qualidade de RNA</td></tr><tr><td>Grânulos AMpure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>purificar</td></tr><tr><td>DNA Bioanalyzer DNA kit de alta sensibilidade</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td>5067-4626 Detecção de</td><td>qualidade de DNA</td></tr><tr><td>Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td>5067-1513</td><td>RNA detecção de qualidade</td></tr><tr><td>DiaMag02 - rack magnético</td><td>Diagenode, Denville, NJ</td><td>B04000001</td><td>auxiliar na preparação da biblioteca</td></tr><tr><td>DiaMag1.5 - rack magnético</td><td>Diagenode, Denville, NJ</td><td>B04000003</td><td>auxiliar a purificação de RNA poli(A)</td></tr><tr><td>Kit de purificação Dynabeads mRNA DIRECT</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>61011</td><td>purificação de RNA poli(A); Tampão de Lavagem 1 e Tampão de Lavagem 2</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>J.T.Baker</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit de metilação de RNA EZ</td><td>Zymo, Irvine, CA</td> Tratamento com <td>bissulfito</td><td>R5002</td></tr><tr><td>Firefly luciferase mRNA</td><td>Promega, Madison, WI, EUA</td><td>L4561</td><td>pico na seqüência de controle </td></tr><tr><td>Kits de quantificação da biblioteca KAPA</td><td>Roche, Suíça</td><td>Quantificação da biblioteca</td><td>KK4824</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td></td><td>Detecção total da quantidade de RNA</td></tr><tr><td>NEBNext multiplex Oligos para illumina (índice Primer set1)</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>Preparação da</td><td></td></tr> <tr><td>biblioteca E7335SNEBNext Ultra <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/65352/65352eq01.jpg" style="margin: auto; "> Kit de Preparação de Biblioteca de RNA Direcional para Illumina</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>E7760S</td><td></td></tr><tr><td>preparação de biblioteca Água livre de nuclease</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>P2 pipetman</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>4641010</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 fluorômetro </td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td></td><td>Detecção de quantidade de RNA</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Q32854</td><td>Detecção de quantidade de DNA</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Q32852</td><td>Detecção de quantidade de RNA</td></tr></tbody></table>

enriquecimento de mrna e preparação de bibliotecas de bissulfito-mrna para sequenciamento de próxima geração

Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing

Modificações pós-transcricionais de RNA em vários tipos de transcritos de RNA estão associadas à regulação de diversos RNA em células eucarióticas. Modificações aberrantes do RNA 5-metilcitosina e a expressão desregulada de RNA metiltransferases têm se mostrado associadas a várias doenças, incluindo cânceres. O sequenciamento de bissulfito transdescritor largo foi desenvolvido para caracterizar as posições e os níveis quantitativos de metilação da citosina no RNA convertido em bissulfito na resolução do par de bases. Este protocolo apresenta os procedimentos de duas rodadas de purificação de RNA poli(A), três ciclos de reação de bissulfito e preparação de biblioteca em detalhes para permitir o mapeamento em todo o transcriptoma dos sítios de modificação do RNAm 5-metilcitosina. A avaliação da quantidade e qualidade do RNA após a reação principal é essencial para monitorar a integridade do RNA e é um passo crítico para garantir bibliotecas de sequenciamento de alta qualidade. O ideal é que os procedimentos possam ser concluídos em até três dias. Com este protocolo, o uso de RNA total de alta qualidade como entrada pode praticamente construir bibliotecas robustas de bissulfito-mRNA para sequenciamento de próxima geração a partir da amostra de interesse.

Uma série de bibliotecas bsRNA-seq de linhagens celulares19 foi gerada seguindo os procedimentos deste relatório (Figura 1). Após purificação total do RNA acompanhada do tratamento com DNase realizado em amostras de linhagem celular e a qualidade verificada por eletroforese em gel e espectrofotometria UV-Vis (A260/A280), a amostra de RNA pode prosseguir para o enriquecimento de RNA poli(A). Para determinar se a purificação dupla poderia remover a maio...

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho fácil de seguir para conduzir a purificação de RNA poli(A), conversão de bissulfito e preparação de biblioteca usando equipamentos padronizados para uma amostra biológica de interesse.

Enriquecimento de mRNA e preparação de bibliotecas de bissulfito-mRNA para sequenciamento de próxima geração

RNA post-transcriptional modifications in various types of RNA transcripts are associated with diverse RNA regulation in eukaryotic cells. Aberrant RNA ...

Esta pesquisa tem como objetivo estudar o papel da metilação do RNA, especificamente da modificação da 5-metilcitosina, no câncer de pâncreas. As perguntas que queremos responder são como upregulation ou downregulation de certos RNA metiltransferase afeta fenótipos de células cancerosas e também, através de quais substratos de RNA. Este estudo fornece a paisagem abrangente de RNA m5C em uma resolução de base única com equipamentos padronizados.A partir deste estudo utilizando sequência de RNA bissulfito, os resultados relacionam a associação da modificação do RNA m5C com a pobre diferenciação de células cancerosas. Isso deve abrir caminho para estudos futuros em discernir os efeitos do passageiro versus o condutor da doença do m5C específico nos transcritos do RNA. Com essa técnica, podemos identificar o conjunto de RNAs diferencialmente metilados que podem participar da progressão tumoral.Além disso, experimentos de base de molécula única podem fornecer um papel regulatório mais detalhado do RNA específico m5C.

enrichment-mrna-bisulfite-mrna-library-preparation-for-next

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui nós descrevemos um método para a preparação de ambos única leitura e emparelhado final Illumina mRNA Seq-libraries seqüenciamento para análise de expressão gênica com base na amplificação T7 RNA linear. Este protocolo requer apenas 10 nanogramas de começar RNA total e gera bibliotecas altamente consistentes representando transcrições todo.

Leia única e emparelhados End mRNA-Seq Bibliotecas Illumina de 10 nanogramas RNA total

Um fluxo de trabalho simplificado para estudar a metilação do DNA e alterações de expressão gênica em início de vida estresse é mostrado. A partir de separação materno de ratos recém-nascidos e isolamento de tecidos cerebrais discretas, que representam um protocolo para simultaneamente isolar DNA e RNA de punções de tecido cerebral para a sequenciação bissulfito subsequente e RT-PCR.

Análise otimizado de metilação do DNA e expressão gênica de pequenas áreas anatomicamente definidos do Cérebro

MicroRNAs (miRNAs) são uma classe amplamente conservada de moléculas reguladoras. Aqui descrevemos um método de clonagem de miRNA que se baseia em duas etapas de ligação potentes seguidas de sequenciamento de alto rendimento. Nosso método permite a quantificação precisa de miRNAs em todo o genoma.

Ligadura altamente eficiente de pequeno RNA moléculas microRNA para quantificação por sequenciamento de alto rendimento

O sequenciamento de bissulfito de representação reduzida aprimorada é um método para a preparação de bibliotecas de sequenciamento para análise de metilação de DNA com base na digestão de enzimas de restrição combinada com conversão de bissulfito de citosina. Este protocolo requer 50 ng de material de partida e produz dados de resolução de pares de bases em regiões genômicas ricas em GC.

Aprimorada Redução Representação Bisulfite Sequencing para a Avaliação de metilação de DNA na resolução de pares de bases

O sequenciamento de amplicon de bissulfito (BSAS) é um método para quantificar a metilação da citosina em regiões genômicas alvo de interesse. Este método usa conversão de bissulfito emparelhada com amplificação de PCR de regiões-alvo antes do sequenciamento de próxima geração para produzir quantificação absoluta da metilação do DNA em um nível específico de base.

Alvejado DNA análise de metilação por Sequenciação de próxima geração

Este protocolo descreve um método para mapeamento pre-mRNA' a extremidade 3 sites de processamento.

3' final de preparação da biblioteca com A-seq2 de sequenciamento

Aqui, descrevemos o protocolo e a implementação de metil-Seq, uma plataforma de epigenomic, usando um modelo do rato para identificar alterações epigenéticas associadas com exposição de estresse crônico. Os resultados demonstram que a plataforma de metil-Seq rato é capaz de detectar diferenças de metilação que surgem a partir da exposição de estresse em ratos.

Uma plataforma de Metil-Seq de Rato para identificar alterações epigenéticas associadas à exposição ao estresse

Nós apresentamos um protocolo pequeno detalhado da reparação da biblioteca do RNA com menos viés do que métodos padrão e uma sensibilidade aumentada para 2 '-O-methyl RNAs. Este protocolo pode ser seguido usando reagentes caseiros para economizar custos ou usar kits para conveniência.

Melhorando O RNA-Seq pequeno: menos polarização e melhor deteção de 2 '-O-methyl RNAs

Aqui descrevemos os estágios de coleta e preparação da amostra para RIBO-seq em bactérias. O sequenciamento das bibliotecas preparadas de acordo com essas diretrizes resulta em dados suficientes para análise bioinformática abrangente. O protocolo que apresentamos é simples, utiliza equipamentos de laboratório padrão e leva sete dias desde a lise até a obtenção de bibliotecas.

RIBO-seq em Bactérias: um Protocolo de Coleta de Amostras e Preparação de Bibliotecas para Sequenciamento NGS

Aqui, apresentamos um protocolo para a seleção in vitro de repressores transcricionais projetados (ETRs) com alta, longa duração, estável, eficiência de silenciamento no alvo e baixa atividade fora do alvo em todo o genoma. Esse fluxo de trabalho permite reduzir um repertório inicial e complexo de ETRs candidatos a uma lista curta, adequada para avaliação adicional em cenários terapeuticamente relevantes.

In vitro Seleção de Repressores Transcricionais Projetados para Silenciamento Epigenético Direcionado

Aprenda o enriquecimento de mRNA e preparação de bibliotecas de bissulfito-mRNA para sequenciamento de próxima geração. Este método permite identificar RNAs diferencialmente metilados envolvidos na progressão tumoral em câncer de pâncreas.

Enriquecimento de mRNA e preparação de bibliotecas de bissulfito-mRNA para sequenciamento de próxima geração

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