Name: Perfusão de máquina hepática normotérmica ex vivo em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-25T14:25:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Aprenda a perfusão hepática normotérmica ex vivo em camundongos para investigar vias moleculares e identificar aditivos de perfusado. Este método permite estudos com animais geneticamente modificados.

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Ao longo da redação deste artigo, recebi muito apoio e assistência. Eu particularmente gostaria de agradecer ao meu companheiro de equipe XinPei Chen por sua maravilhosa colaboração e apoio ao paciente durante minha operação.

Os experimentos com animais foram realizados de acordo com os regulamentos e diretrizes alemães atuais para o bem-estar animal e as diretrizes ARRIVE para relatar pesquisas com animais. O protocolo de experimentação animal foi aprovado pelo Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Turíngia, Alemanha (Número de aprovação: UKJ - 17 - 106).
NOTA: Camundongos machos C57BL/6J pesando 34 ± 4 g (média ± erro padrão da média [EPM]) foram utilizados como doadores de fígado. Eles foram mantidos sob condições ambientais controladas (50% de umidade e 18 - 23 °C) com livre acesso à ração padrão e água. Durante todo o procedimento cirúrgico, manteve-se a frequência respiratória superior a 60 ciclos/min e a temperatura corporal foi mantida acima de 34 °C.
1. Preparo
<ol><li>Configurando a tabela de operações
	<ol><li>Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos e consumíveis para fins de esterilização.</li>
		<li>Ligue todos os equipamentos, incluindo a placa de aquecimento e eletrocoagulação.</li>
		<li>Colocar uma seringa de 50 mL com 25 mL de solução salina heparinizada (2.500 U/L) em estufa aquecida (37 °C).</li>
		<li>Colocar os instrumentais cirúrgicos, a sutura de seda 6 - 0, aplicador pequeno de algodão estéril, soro fisiológico veterinário (500 mL) e compressas de gaze não tecida (10 cm x 10 cm) sobre a mesa de operação adequadamente.</li>
		<li>Coloque uma agulha 26 G na mesa de operação para criar um pequeno orifício na tampa do tubo de microcentrífuga de 0,5 mL para receber o tubo biliar para coleta de bile.</li>
		<li>Colocar a cânula (cânula de poliuretano 1 Fr ou cânula de polietileno UT - 03) e um tubo de microcentrífuga esterilizado de 0,5 mL para coleta de bile na mesa de operação.</li>
	</ol></li>
	<li>Cânula autoconfeccionada da veia porta
	<ol><li>Segurar a cânula de 2 Fr com pinça e puncionar a parede com uma agulha de 30 G a uma distância de 1 cm da extremidade da cânula. Empurre a agulha através da cânula até que a ponta da agulha fique visível.</li>
		<li>Corte a ponta da cânula resultando em um triângulo afiado.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparo de solução salina heparinizada
	<ol><li>Preparar 25 mL de solução salina heparinizada com concentração final de 2.500 UI/mL.</li>
		<li>Retire todas as bolhas de ar e coloque a seringa na incubadora a 40 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Demonstração do sistema de perfusão
	<ol><li>Veja a Figura 1 para os principais componentes do sistema de perfusão da máquina.</li>
	</ol></li>
	<li>Instalação da câmara de órgãos
	<ol><li>Veja a Figura 2 para o layout da câmara de órgãos.</li>
	</ol></li>
	<li>Configuração do sistema de perfusão
	<ol><li>Ative o programa de gráfico de laboratório para monitoramento de pressão.</li>
		<li>Conecte o calibrador de pressão e o sensor de pressão no nível da câmara do órgão.</li>
		<li>Ajuste o calibrador de pressão para ler 0 mmHg e verifique o valor correspondente no software de controle de pressão.</li>
		<li>Ajuste o calibrador de pressão para ler 20 mmHg e verifique novamente o valor correspondente no software de controle de pressão.</li>
		<li>Ligue o banho-maria e pré-aqueça a câmara de órgãos a 40 °C.</li>
		<li>Lave todo o sistema de encanamento duas vezes com água destilada deionizada por 30 min cada, garantindo a remoção completa da solução sanitizante.</li>
		<li>Inicie a circulação da solução de desinfecção por todo o sistema por uma duração de 20 minutos para garantir a desinfecção completa.</li>
		<li>Ligue a mistura de gases (95% de oxigênio (O 2) e 5% de dióxido de carbono (CO2).</li>
	</ol></li>
	<li>Enchimento com perfusato
	<ol><li>Suplemento de 250 mL de meio Williams' E com 50 mL de soro fetal bovino, 3 mL de penicilina/estreptomicina (1 mg/mL), 0,17 mL de insulina (100 IE/mL), 0,34 mL de heparina (5000 U/mL) e 0,07 mL de hidrocortisona (100 mg/2 mL) para preparar o meio E completo de Williams.</li>
		<li>Adicionar volumes iguais (150 mL) de perfusato ao reservatório e à câmara orgânica para preparar o sistema. OBS: Atenção especial deve ser dada à manutenção da esterilidade durante o processo de enchimento. O perfusato é constantemente bombeado através desses dois componentes-chave da perfusão da máquina recirculante fechada.</li>
		<li>Ligar a bomba peristáltica em velocidade média (15 mL/min) para iniciar o sistema de perfusão com o meio oxigenado.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Explante hepático
<ol><li>Preparo pré-operatório
	<ol><li>Pese o animal. Preparar o analgésico buprenorfina (0,3 mg/mL) (0,05 mg/kg de peso corporal).</li>
		<li>Conecte a câmara de indução com o soquete de parede. Vire o oxigênio para 0,5 L/min. Vire isoflurano para 3%.</li>
		<li>Colocar o animal na câmara até que se atinja a anestesia profunda (reflexo de retificação positivo).</li>
		<li>Use uma microseringa para aplicar dose de analgesia adaptada ao peso corporal por via subcutânea.</li>
		<li>Use um barbeador elétrico para aparar o pelo na pele abdominal.</li>
		<li>Transfira o mouse para a mesa de operação e ligue o vaporizador de isoflurano a 2,5% para manter a anestesia. Confirme a profundidade da anestesia testando o reflexo interdigital do dedo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do abdome do rato
	<ol><li>Coloque o rato em decúbito dorsal.</li>
		<li>Teste o reflexo interdigital para confirmar a profundidade adequada da anestesia. Fixe os quatro membros com fita adesiva.</li>
		<li>Desinfetar ambos os lados do abdome até a linha axilar média usando três rodadas consecutivas de iodo-álcool. Use gaze esterilizada não tecida para cobrir a área ao redor do campo cirúrgico.</li>
		<li>Faça uma incisão transversal de 3 cm 1 cm abaixo do xifoide na área abdominal do camundongo usando tesoura de bebê Metzenbaum e pinça cirúrgica.</li>
		<li>Estender a incisão da pele bilateralmente à linha axilar média em ambos os lados.</li>
		<li>Faça cuidadosamente uma incisão longitudinal de 2 cm ao longo da linha alba usando uma tesoura de mola.</li>
		<li>Corte a camada muscular abdominal com eletrocoagulação e tesoura de mola Vannas.</li>
		<li>Coloque cuidadosamente um pedaço de gaze úmida para proteger o fígado da eletrocoagulação.</li>
		<li>Use uma sutura de seda 6 - 0 com a agulha redonda para retrair o processo xifoide para melhor exposição do ligamento coronariano.</li>
		<li>Use dois afastadores de costela para expor totalmente a cavidade abdominal do mouse.</li>
		<li>Mova cuidadosamente o intestino delgado para fora da cavidade abdominal com um cotonete molhado para expor totalmente o hilo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do ducto biliar comum
	<ol><li>Transeccionar os ligamentos falciformes, frênicos e gastro-hepáticos com tesouras afiadas.</li>
		<li>Liberte cuidadosamente o ducto biliar comum usando pinças curvas finas sem dentes. NOTA: O ducto biliar comum é muito facilmente danificado e quebra. Uma vez que quebra, não pode ser canulado. Devido à direção da posição anatômica, pinças curvas são melhores para serem utilizadas.</li>
		<li>Coloque duas alças de sutura de seda 6 - 0 sobre o ducto biliar comum em preparação para o próximo passo.</li>
	</ol></li>
	<li>Canulação do ducto biliar comum
	<ol><li>Puncione cuidadosamente o ducto biliar com uma agulha de 30 G. Use pinças curvas pontiagudas para ampliar o pequeno orifício para encaixar a canulação do ducto biliar.</li>
		<li>Use pinça de canulação do vaso para agarrar a cânula do ducto biliar e empurrá-la para dentro do ducto biliar.</li>
		<li>Dupla fixação da cânula com alças de sutura predefinidas 6 - 0. NOTA: Durante a canulação, a resistência pela bile é sentida. Se a força não for bem controlada, a cânula será empurrada para fora do trato biliar pela pressão de saída da bile. Ajuste cuidadosamente a profundidade da cânula. Se for muito profundo, pode danificar o ducto biliar e, se não for profundo o suficiente, pode escapar.</li>
		<li>Observe o fluxo biliar na cânula após a canulação bem-sucedida.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparo da veia porta
	<ol><li>Aperte a veia porta com pinça plana e libere cuidadosamente o tecido conjuntivo com pinça curva. Não puxe com força para evitar causar ruptura da veia porta. Uma vez que a veia porta é lesada, é difícil recanular a veia porta.</li>
		<li>Dissecar o VP logo superior à bifurcação e colocar a primeira alça de sutura com fio de seda 6 - 0 no PV próximo à confluência para uso posterior.</li>
		<li>Colocar a segunda alça de sutura para posterior fixação das VVPP o mais próximo possível do hilo hepático.</li>
	</ol></li>
	<li>Canulação da veia porta
	<ol><li>Use um clipe arterial para fechar a veia porta distal.</li>
		<li>Com muito cuidado, puncione a veia porta com uma das cânulas da veia porta acima. O fluxo sanguíneo pode ser claramente observado dentro da cânula após uma punção bem-sucedida.</li>
		<li>Fixar a cânula PV com a alça de sutura 6 - 0 pré-colocada.</li>
	</ol></li>
	<li>Rubor hepático
	<ol><li>Aumentar o isoflurano para 5% e eutanasiar o rato com uma sobredose de inalação de isoflurano.</li>
		<li>Tome solução salina de heparina pré-aquecida da incubadora. Remova todas as bolhas de ar formadas no interior do soro fisiológico heparinizado.</li>
		<li>Fixe a seringa com soro fisiológico heparinizado pré-aquecido na bomba da seringa.</li>
		<li>Conecte o tubo de extensão da bomba de seringa à cânula da veia porta, ajuste a velocidade para 2 mL/min e inicie a lavagem hepática.</li>
		<li>Observe a cor do fígado no final do procedimento de lavagem. Excise o fígado uma vez que a cor se transforma em um amarelo homogêneo.</li>
		<li>Transeccionar o diafragma, a veia cava inferior supra-hepática, a veia cava infra-hepática, a artéria hepática, a veia porta distal e qualquer tecido conjuntivo remanescente.</li>
		<li>Coloque o fígado na placa de Petri.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Conexão do fígado e da câmara
<ol><li>Transferência hepática
	<ol><li>Transfira cuidadosamente o fígado para a câmara do órgão usando uma placa de Petri.</li>
		<li>Mantenha uma pequena quantidade de soro fisiológico na placa de Petri para evitar que o fígado seque. NOTA: A veia porta e o ducto biliar podem ser facilmente torcidos durante este procedimento, o que pode afetar a perfusão hepática e a coleção biliar.</li>
	</ol></li>
	<li>Conexão da cânula da veia porta
	<ol><li>Infundir lentamente soro fisiológico normal na cânula da veia porta com uma seringa para evacuar as bolhas de ar na cânula.</li>
		<li>Conecte a cânula da veia porta ao tubo de saída do perfusato na câmara do órgão.</li>
	</ol></li>
	<li>Conexão da cânula do ducto biliar
	<ol><li>Guie a cânula do ducto biliar do rato através da válvula de uma tampa de borracha que está conectada à câmara do órgão.</li>
		<li>Insira a cânula do ducto biliar em um microtubo pré-preparado de 0,5 mL com um pequeno orifício na tampa.</li>
		<li>Coloque o microtubo na argila fora da câmara do órgão.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Ajuste a taxa de fluxo de acordo com a pressão PV
<ol><li>Ligue a bomba peristáltica a partir de 1 mL/min.</li>
	<li>Verifique a leitura da pressão da veia porta para ajustar a vazão.</li>
	<li>Manter a pressão da veia porta na faixa fisiológica entre 7 - 10 mmHg ajustando o fluxo. NOTA: A vazão nominal pode variar ligeiramente dependendo do uso e posicionamento dos tubos.</li>
</ol>5. Coleta de amostras
<ol><li>Obter amostras de perfusato de entrada do tubo de entrada da veia porta e amostras de perfusato de saída da câmara de órgãos em intervalos de 3h.</li>
	<li>Coletar amostras de todos os lobos hepáticos para análise histológica ao final do período de perfusão de 12 h.</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse financeiros a serem divulgados.

Etapas críticas do protocolo As duas etapas cruciais no explante hepático são a canulação da veia porta (VP) e a subsequente canulação do ducto biliar (BD). Essas etapas são de suma importância para garantir o sucesso da recuperação de órgãos e subsequentes procedimentos de perfusão ou transplante.
Desafios e soluções A canulação das VVPP apresenta três desafios: lesão da parede do vaso, deslocamento do cateter e praticabilidade do processo de inserção. ...

O transplante hepático representa o tratamento padrão-ouro para indivíduos com doença hepática terminal. Lamentavelmente, a demanda por órgãos de doadores supera a oferta disponível, levando a uma escassez significativa. Em 2021, aproximadamente 24.936 pacientes estavam na lista de espera por um enxerto de fígado, enquanto apenas 9.234 transplantes foram realizados com sucesso1. A significativa disparidade entre a oferta e a demanda de enxertos hepáticos destaca a necessidade premente de investigar estratégias alternativas para ampliar o pool de doadores e melhorar a acessibilidade dos enxertos hepáticos. Uma forma de ampliar o pool de doadores é utilizar doadores marginais2. Os doadores marginais incluem aqueles com idade avançada, esteatose moderada ou grave. Embora o transplante de órgãos marginais possa produzir resultados favoráveis, os resultados gerais permanecem subótimos. Como resultado, o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que visem melhorar a função de doadores marginais está atualmente em andamento 3,4.
Uma das estratégias é utilizar a máquina de perfusão, especialmente a máquina de oxigenação normotérmica, para melhorar a função desses órgãos marginais5. No entanto, ainda há uma compreensão limitada dos mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos benéficos da perfusão de máquina oxigenada normotérmica (NEVLP). Camundongos, com sua abundante disponibilidade de cepas geneticamente modificadas, servem como modelos valiosos para a investigação de vias moleculares. Por exemplo, a importância das vias de autofagia na atenuação da lesão de isquemia-reperfusão hepática tem sido cada vez maisreconhecida6,7. Uma importante via molecular na lesão de isquemia-reperfusão hepática éa via miR-20b-5p/ATG78. Atualmente, há uma série de linhagens de camundongos knockout e knock-out condicional disponíveis para ATG, mas nenhuma cepa de rato correspondente9.
Com base nesse contexto, o objetivo foi gerar uma plataforma NEVLP miniaturizada para enxertos hepáticos de camundongos. Essa plataforma facilitaria a exploração e avaliação de potenciais estratégias geneticamente modificadas destinadas a melhorar a funcionalidade do fígado do doador. Além disso, era essencial que o sistema fosse adequado para perfusão a longo prazo, possibilitando o tratamento ex vivo do fígado, comumente referido como "reparo de órgãos".
Considerando a disponibilidade limitada de dados in vitro relevantes sobre a perfusão hepática em camundongos, a revisão da literatura concentrou-se em estudos realizados em ratos. Uma busca sistemática da literatura de 2010 a 2022 foi realizada usando palavras-chave como "normothermic liver perfusion", "ex vivo or in vitro" e "rats". Esta pesquisa teve como objetivo identificar condições ótimas em roedores, permitindo determinar a abordagem mais adequada.
O sistema de perfusão consiste de um reservatório tampão de vidro vedado com camisa d'água, uma bomba de rolos peristálticos, um oxigenador, um coletor de bolhas, um trocador de calor, uma câmara de órgãos e um sistema fechado de tubos de ciclagem (Figura 1). O sistema garante a manutenção precisa de uma temperatura de perfusão constante de 37 °C usando uma máquina termostática dedicada. A bomba de rolos peristálticos conduz o fluxo do perfusato por todo o circuito. O circuito de perfusão inicia-se no reservatório isolado encamisado de água. Posteriormente, o perfusato é direcionado através do oxigenador, que recebe uma mistura gasosa de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono de uma garrafa de gás dedicada. Após a oxigenação, o perfusato passa através da armadilha de bolhas, na qual quaisquer bolhas aprisionadas são redirecionadas de volta para o reservatório pela bomba peristáltica. O perfusato remanescente flui através do trocador de calor e entra na câmara do órgão, de onde retorna ao reservatório.
Aqui, relatamos nossas experiências no estabelecimento de uma NEVLP para fígados de camundongos e compartilhamos os resultados promissores de um experimento piloto realizado usando o meio oxigenado sem carreadores de oxigênio.

<table><tbody><tr><td>Micro Tubo PP de 0,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72699</td><td></td></tr><tr><td>1 Fr Cânula de Borracha</td><td>Vygon</td><td>Amostra Cânula</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L Micro Seringa</td><td>Hamilton</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>2 Fr Cânula de Borracha</td><td>Vygon</td><td>Cânula</td><td></td>de Amostra</tr><tr><td>24 G Cânula Borboleta</td><td>Terumo</td><td>SR+OF2419</td><td></td></tr><tr><td>26 G Cânula Borboleta</td><td>Terumo</td><td>SR+DU2619WX</td><td></td></tr><tr><td>30 G Agulha Hipodérmica</td><td>Sterican</td><td>100246</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Bomba de Seringa</td><td>Braun</td><td>110356</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Perma-Hand Seide</td><td>Ethicon</td><td>639H</td><td></td></tr><tr><td>Clipe Arterial</td><td>Braun</td><td>BH014R</td><td></td></tr><tr><td>Câmara Úmida Autoclavável</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>73-4733</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de Algodão Grande&nbsp;</td><td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td><td>974018</td><td></td></tr><tr><td>Armadilha de Bolhas</td><td>Hugo-Sachs-Elektronik</td><td>V83163</td><td></td></tr><tr><td>Buprenovet (0,3 mg / ml)</td><td>Solução de OPA Elanco</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>CIDEX (2 L)</td><td>Cilag GmbH</td><td>20391</td><td></td></tr><tr><td>Unidade Eletrocirúrgica para Corte Monopolar VIO&reg; 50 C</td><td>ERBE</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino(500 ml)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de Gases (95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono)</td><td>Banhos de Circulação de Abastecimento</td> <td>Doméstico/</td><td></td></tr><tr><td>Aquecimento</td><td>Harvard-Apparatus</td><td>75-0310</td><td></td></tr><tr><td>Heparina 5000 (ou seja, /5 ml)</td><td>Braun</td><td>1708.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona (100 mg / 2 ml)</td><td>Pfizer</td><td>15427276</td><td></td></tr><tr><td>Insulina(100 IE / ml)</td><td>Tesoura de</td> Íris Sigma <td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Instrumentos de Ciência Fina</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (250 ml)</td><td>Cp-Pharma</td><td>1214</td><td></td></tr><tr><td>Oxigenador de Membrana</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>T18728</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Microcirurgia&nbsp;</td><td></td> Conjunto de Retrator de Mouse Leica <td>M60</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Esponjas Carfil Quality</td><td>180000056</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0 HT</td><td>Hamamatsu</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Não-Tecidas&nbsp;</td><td>Kompressen</td><td>866110</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina (1 mg / ml)&nbsp;</td><td>Tubo</td> de Extensão de Perfusão <td>C.C.Pro Z-13-M</td><td></td></tr><tr><td>(30 cm)</td><td>Braun</td><td>4256000</td><td></td></tr><tr><td>Bomba Peristáltica</td><td>Harvard-Apparatus</td><td>P-70</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishc 100x15 mm</td><td>VWR&reg;</td><td>391-0578</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-Jod (Vet-Sep Spray)</td> <td>Livisto</td><td>799-416</td><td></td></tr><tr><td>Simulador de Transdutor de Pressão</td><td>UTAH Medical Products</td><td>650-950</td><td></td></tr><tr><td>Transdutores de Pressão Arterial Reutilizáveis</td><td>AD Instruments</td><td>MLT-0380 / D</td><td></td></tr><tr><td>S & Pinça de Punção de Vaso T</td><td>Fine Science Instruments</td><td>00608-11</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de Algodão Pequeno</td><td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Reta 10 cm&nbsp;</td><td>Fine Science Instruments</td><td>00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Sutura Amarrando Fórceps</td><td>Fine Science Instruments</td><td>11063-07</td><td></td></tr><tr><td>Seringa 50ml Original Perfusor</td><td>Braun</td><td>8728810F-06</td><td></td></tr><tr><td>UT - 03 Cânula</td><td>Unique Medical, Japão</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Instruments</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Solução Salina Veterinária (500 ml)</td><td>WDT</td><td>18X1807</td><td></td></tr><tr><td>Reservatório com Camisa de Água&nbsp; 2 L</td><td>Harvard-Apparatus</td><td>73-3441</td><td></td></tr><tr><td>William's E Medium (500 ML)</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>A1217601</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusão de máquina hepática normotérmica ex vivo em camundongos

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

Este protocolo apresenta um sistema NEVLP livre de eritrócitos otimizado usando fígados de camundongos. A preservação ex vivo de fígados de camundongos foi obtida empregando-se cânulas modificadas e técnicas adaptadas de equipamentos comerciais convencionais de perfusão ex vivo . O sistema foi utilizado para avaliar os resultados de preservação após 12 h de perfusão. Camundongos C57BL/6J serviram como doadores de fígado, e os fígados foram explantados canulando a veia porta (VP) e o ducto biliar (BD) e, posteriormente, lavando o órgão com solução salina heparinizada aquecida (37 °C). Em seguida, os fígados explantados foram transferidos para a câmara de perfusão e submetidos à máquina de perfusão oxigenada normotérmica (NEVLP). Amostras de perfusato de entrada e saída foram coletadas em intervalos de 3 h para análise do perfusato. Ao término da perfusão, amostras de fígado foram obtidas para análise histológica, com integridade morfológica avaliada pelo Suzuki-Score modificado através da coloração pela Hematoxilina-Eosina (HE). Os experimentos de otimização produziram os seguintes achados: (1) camundongos pesando mais de 30 g foram considerados mais adequados para o experimento devido ao maior tamanho de seu ducto biliar (BD). (2) uma cânula de poliuretano 2 Fr (diâmetro externo = 0,66 mm) foi mais adequada para canulação da veia porta (VP) quando comparada a uma cânula de polipropileno. Isso foi atribuído à maior aderência do material de poliuretano, resultando em menor deslizamento do cateter durante a transferência do corpo para a câmara do órgão. (3) para a canulação do ducto biliar (BD), uma cânula de poliuretano 1 Fr (diâmetro externo = 0,33 mm) mostrou-se mais eficaz em comparação com a cânula de polipropileno UT - 03 (diâmetro externo = 0,30 mm). Com este protocolo otimizado, fígados de camundongos foram preservados com sucesso por uma duração de 12 h sem impacto significativo na estrutura histológica. A coloração pela hematoxilina-eosina (HE) revelou uma arquitetura morfológica do fígado bem preservada, caracterizada por hepatócitos predominantemente viáveis com núcleos claramente visíveis e discreta dilatação dos sinusóides hepáticos.

Estabelecimento do procedimento cirúrgico Um total de 17 animais foi utilizado para este experimento: 14 camundongos foram empregados para otimizar o processo de captação de órgãos, incluindo a canulação da veia porta (PV) e do ducto biliar (BD), enquanto 3 camundongos foram usados para validar o procedimento (Tabela 1). Os resultados histológicos (Figura 3) foram comparados para facilitar a identificação da condição ótima de perfusão.
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Um sistema normotérmico ex vivo de perfusão hepática (NEVLP) foi criado para fígados de camundongos. Este sistema requer experiência em microcirurgia, mas permite resultados reprodutíveis de perfusão. A capacidade de utilizar fígados de camundongos facilita a investigação de vias moleculares para identificar novos aditivos de perfusato e permite a execução de experimentos focados no reparo de órgãos.

Perfusão de máquina hepática normotérmica ex vivo em camundongos

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing ...

Perfusão Normotérmica Ex-Vivo em Máquina de Fígado em Camundongo. A perfusão hepática oxigenada normotérmica é uma estratégia promissora para o resgate de órgãos marginais e foi recentemente introduzida na prática clínica. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes não são bem compreendidos.Um modelo de camundongo é necessário para aprofundar o estudo das vias moleculares, aproveitando animais geneticamente modificados, como camundongos transgênicos, aguardando, portanto, o estabelecimento de um sistema normotérmico de perfusão por máquina oxigenada para fígados de camundongos. Aqui está um esquema de todo o nosso sistema. Primeiro, todo o sistema é controlado a 37 graus centígrados por um controlador termostático através da circulação da água.O perfusato é bombeado do reservatório por uma bomba peristáltica para um oxigenador. Há um fluxo ininterrupto de gás de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono no oxigenador. O perfusato então passa por uma armadilha de bolhas.O perfusato com bolhas de ar é bombeado de volta para o reservatório sob pressão. O perfusato remanescente flui para a câmara do órgão, onde o tubo é conectado à veia porta. O perfusato é drenado do fígado através da cava supra-hepática para a câmara do órgão.A saída do perfusato da câmara orgânica é direcionada de volta ao reservatório pela bomba peristáltica. Um tubo de drenagem biliar é conectado à câmara do órgão para coletar a bile. Esta é a nossa mesa de operação.Todas as cirurgias são feitas ao microscópio. Mantemos condições cirúrgicas semi-estéreis durante todo o procedimento cirúrgico. Segure a cânula do tubo francês com pinças.Penetrar na parede da cânula com uma agulha 30G a um centímetro de distância da extremidade da cânula. Empurre a agulha através da cânula até que a ponta da agulha fique visível. Aqui está uma imagem de comparação do cateter 26G e da cânula autofabricada; ambos são adequados para canulação portal de camundongos.Prepare 25 mililitros de solução salina heparinizada com uma concentração final de 2.500 unidades internacionais por mililitro e coloque a seringa em incubadora regulada a 40 graus centígrados. Aqui estão os principais componentes do sistema de perfusão de máquina normotérmica ex-vivo. Os componentes incluem principalmente a câmara de órgãos, máquina termostática, bomba de roletes, oxigenador e reservatório.Aqui, você pode ver uma configuração detalhada da nossa câmara de órgãos. Basicamente, ele é composto por um corpo de câmara de órgãos, um sensor de pressão, um trocador de calor e uma armadilha de bolhas. Montamos uma entrada de perfusato, uma saída de perfusato e uma porta de drenagem biliar.Este é o sistema de monitorização da DDA que usamos para monitorar a pressão da veia porta. O sistema ADI consiste em um sensor de pressão, um controlador central e monitores. Ative o programa LabChart para monitoramento de pressão.Calibração e zeragem são necessárias antes de cada uso do sensor de pressão. Use mercúrio de zero milímetro e mercúrio de 20 milímetros como marcas para calibrar o sensor de pressão para a calibração em duas etapas. Com base na monitorização constante da pressão portal, podemos ajustar o flurano portal de acordo com as mudanças de pressão.Em volumes iguais de perfusato para o reservatório e a câmara de órgãos para preparar o sistema, atenção especial deve ser dada para manter a esterilidade durante o processo de enchimento. Conecte a câmara de indução com um soquete de parede. Vire o oxigênio para 0,5 litro por minuto.Vire o isoflurano para 3% Coloque o animal na câmara até que a anestesia profunda seja atingida. Use microseringa para aplicar dose de analgesia adaptada ao peso corporal. Aqui, sete microlitros de buprenorfina.Agora, iniciamos a operação cirúrgica. Faça uma incisão transversal na área abdominal do rato. A incisão cutânea estende-se para a linha axilar bilateral da carne em ambos os lados.Faça cuidadosamente uma incisão longitudinal ao longo da linha alba. Corte a camada muscular abdominal com eletrocoagulação e tesoura. Coloque cuidadosamente um pedaço de gaze úmida para proteger o fígado da eletrocoagulação.Expor totalmente a cavidade abdominal do rato. Mova cuidadosamente o intestino delgado para fora da cavidade abdominal com um cotonete molhado para expor totalmente o hilo. Mostramos aqui um diagrama esquemático de canulação da veia porta e canulação do ducto biliar.Basicamente, escolhemos a cânula apropriada de acordo com o tamanho do camundongo e usamos fio de seda 6-0 para a fixação da cânula. Liberte cuidadosamente o ducto biliar comum usando pinças curvas finas sem dentes. O ducto biliar comum é muito facilmente danificado e quebrar.Uma vez que quebra, não pode ser canulado. Devido à direção da posição anatômica, pinças curvas são mais fáceis de operar. Coloque duas alças de sutura de seda 6-0 sobre o ducto biliar comum em preparação para a próxima etapa.Puncione cuidadosamente o ducto biliar com uma agulha 30G. Use pinças curvas pontiagudas para ampliar os pequenos orifícios, para que possa alimentar a canulação do ducto biliar. Use pinças de canulação do vaso através da cânula do ducto biliar e empurre-a para dentro do ducto biliar. Nota.No momento da canulação, você sentirá a resistência trazida pela bile. Se a força não for bem controlada, a cânula será empurrada para fora do trato biliar pela pressão de saída da bile. Ajuste cuidadosamente a profundidade da cânula.Se for muito profundo, pode danificar o ducto biliar e, se não for profundo o suficiente, pode escapar. O fluxo biliar pode ser observado na cânula após a canulação bem-sucedida. Aperte a veia porta com pinça plana e libere cuidadosamente o tecido conjuntivo com pinça curva.Não puxe com força aqui, para não causar ruptura da veia porta. Uma vez que a veia porta é danificada, é difícil canular a veia porta. Coloque duas suturas de seda 6-0 Loop sobre a veia porta livre.Use um clipe arterial para fechar a veia porta distal. Puncione cuidadosamente a veia porta com uma das cânulas da veia porta acima. O fluxo sanguíneo pode ser claramente observado dentro da cânula após uma punção bem-sucedida.Tome solução salina de heparina pré-aquecida da incubadora. Remova todas as bolhas de ar. Fixe a seringa com soro fisiológico heparinizado pré-aquecido na bomba da seringa.Conecte o tubo de extensão da bomba de seringa à cânula da veia porta. Ajuste a velocidade para dois mililitros por minuto e inicie a lavagem hepática. Aumentar o isoflurano para 5% e eutanasiar o rato com uma sobredosagem inalação de isoflurano.Observe a cor do fígado no final do procedimento de lavagem. Excise o fígado uma vez que a cor se transformou em um amarelo homogêneo. Transfira cuidadosamente o fígado para a câmara do órgão usando uma placa de Petri.Mantenha uma pequena quantidade de soro fisiológico na placa de Petri para evitar que o fígado seja esmagado. Nota. A veia porta e o ducto biliar podem ser facilmente torcidos durante esse procedimento, o que pode afetar a perfusão hepática e a coleção biliar. Infundir lentamente soro fisiológico normal na cânula da veia porta com uma seringa para evacuar as bolhas de ar na cânula.Conecte a cânula da veia porta ao tubo de saída do perfusato na câmara do órgão. A cânula do ducto biliar do camundongo é guiada através de uma válvula da câmara do órgão, que é fechada com uma tampa de borracha. Em seguida, o tubo biliar é inserido em um microtubo pré-preparado de 0,5 mililitro com um pequeno orifício no chumbo.Depois que tudo estiver conectado, ligue a bomba peristáltica. Verifique a leitura da pressão da veia porta para ajustar a vazão. Mantenha a pressão da veia porta entre sete a 10 milímetros de mercúrio ajustando a taxa de fluxo. Nota.O fluxo nominal pode variar ligeiramente dependendo da idade e do posicionamento dos tubos. Esta é a seleção do meio de perfusato, volume de perfusato e pressão de perfusão com base em uma investigação da literatura de estudos normotérmicos de perfusão de máquina de fígado oxigenado em ratos. Este é um estudo passo a passo para estabelecer o modelo de perfusão em camundongos.Foram necessários cerca de 14 experimentos para selecionar os cateteres mais adequados. Em nossas mãos, o uso de dois cateteres de borracha French para a veia porta, juntamente com um cateter de borracha French para o ducto biliar, é a melhor combinação para obter perfusão homogênea com todos os cateteres no local. O pH e o nível de potássio mantiveram-se estáveis durante 12 horas de perfusão.O pH variou de 7,26 a 7,71 e o de potássio de 5,9 a 6,8 milimoles por litro. A coloração HE mostra que, após 12 horas de perfusão, a integridade histológica do fígado de camundongos estava relativamente bem preservada. Em conjunto, demonstramos aqui o estabelecimento bem-sucedido de um sistema normotérmico de perfusão em máquina oxigenada para o fígado de camundongos.A perfusão de fígado de camundongo por 12 horas resultou em boa preservação da morfologia hepática, embora não em todo o órgão. Esforços adicionais são necessários para alcançar uma perfusão homogênea completa por um período maior de tempo. Uma vez que isso seja alcançado, o uso de animais geneticamente modificados pode ser considerado, como o uso de camundongos knockout de IL-2 para investigar o papel da inflamação.

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Research

JoVE Journal

Engineering

Engenharia

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