Name: Geração de Podócitos Derivados do Paciente a partir de Biópsias de Pele (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda a gerar podócitos derivados do paciente a partir de fibroblastos dérmicos usando reprogramação episomal em células-tronco pluripotentes induzidas. Este método permite modelar doenças renais de forma personalizada.

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Este trabalho foi financiado pelo Centro Interdisciplinar de Pesquisa Clínica (IZKF) da Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg com o número de bolsa M4-IZKF-F009 dado a Janina Müller-Deile, e pelo Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) sob o nome de projeto STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS, número de concessão 01GM2202D dado a Janina Müller-Deile. Agradecemos a Annalena Kraus pelo apoio na obtenção de imagens MEV.

Usando biópsias de pele para gerar podócitos derivados de pacientes

<ol><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li>
<li>Grgic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+podocyte+foot+processes+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).</li>
<li>Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+podocyte+slit+diaphragm-from+a+thin+grey+line+to+a+complex+signalling+hub%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub.</a> Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).</li>
<li>Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+glomerular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of glomerular permeability.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 281 (4), F579-F596 (2001).</li>
<li>Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+complexity+of+the+podocyte+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).</li>
<li>Muller-Deile, J., Schiffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+directed+therapy+of+nephrotic+syndrome-can+we+bring+the+inside+out%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out.</a> Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).</li>
<li>Boehlke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hantavirus+infection+with+severe+proteinuria+and+podocyte+foot-process+effacement%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Kidney+Diseases%22%5BJournal%5D)">Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement.</a> American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).</li>
<li>Schiffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+actin-dependent+dynamin+oligomerization+ameliorates+chronic+kidney+disease+in+diverse+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models.</a> Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).</li>
<li>Kopp, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Podocytopathies.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 68(2020).</li>
<li>Wiggins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+podocytopathies%3A+a+unifying+view+of+glomerular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases.</a> Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).</li>
<li>Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+differentiation+in+cultured+rat+and+human+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).</li>
<li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li>
<li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+line+demonstrating+nephrin+and+podocin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).</li>
<li>Eto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+protection+by+darbepoetin%3A+preservation+of+the+cytoskeleton+and+nephrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression.</a> Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).</li>
<li>Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+methods+of+glomerular+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+%26+Blood+Pressure+Research%22%5BJournal%5D)">Culture methods of glomerular podocytes.</a> Kidney & Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).</li>
<li>Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker+expression%2C+behaviors%2C+and+responses+vary+in+different+lines+of+conditionally+immortalized+cultured+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).</li>
<li>Shih, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD2AP+localizes+to+the+slit+diaphragm+and+binds+to+nephrin+via+a+novel+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain.</a> The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).</li>
<li>Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+is+critical+for+the+plasma+membrane+localization+of+nephrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).</li>
<li>Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipping+your+feet+in+the+water%3A+podocytes+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Dipping your feet in the water: podocytes in urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).</li>
<li>Camici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+detection+of+podocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Urinary detection of podocyte injury.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 61 (5), 245-249 (2007).</li>
<li>Muller-Deile, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+preeclampsia+induced+microRNA-26a-5p+leads+to+proteinuria+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3621(2018).</li>
<li>Schenk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+focal+segmental+glomerulosclerosis+%28FSGS%29+factor+suPAR+using+CytoSorb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Apheresis%22%5BJournal%5D)">Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb.</a> Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).</li>
<li>Petermann, A., Floege, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+damage+resulting+in+podocyturia%3A+a+potential+diagnostic+marker+to+assess+glomerular+disease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron.+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity.</a> Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).</li>
<li>Vogelmann, S. U., Nelson, W. J., Myers, B. D., Lemley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+excretion+of+viable+podocytes+in+health+and+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 285 (1), F40-F48 (2003).</li>
<li>Petermann, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes+that+detach+in+experimental+membranous+nephropathy+are+viable%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable.</a> Kidney International. 64 (4), 1222-1231 (2003).</li>
<li>Sakairi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+lines+established+from+urine%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).</li>
<li>Rauch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+iPSCs+into+functional+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human iPSCs into functional podocytes.</a> PLoS One. 13 (9), e0203869(2018).</li>
<li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0069(2017).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+human+somatic+reprogramming+to+iPS+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell.</a> Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).</li>
<li>Bang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+episomal+reprogramming+for+generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts.</a> Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+mature+kidney+podocytes+and+establishment+of+a+Glomerulus+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip.</a> Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).</li>
<li>Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+differentiation+of+mature+kidney+podocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+under+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61299(2020).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e3779(2013).</li>
<li>Hoffding, M. K., Hyttel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+visualization+of+the+Mesenchymal-to-Epithelial+Transition+during+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).</li>
<li>Bharathan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+markers+used+for+the+identification+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells.</a> Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).</li>
<li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ki-67+protein%3A+from+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).</li>
<li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67%3A+more+than+a+proliferation+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li>
<li>Vaz, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+aberrations+after+induced+pluripotent+stem+cells+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming.</a> Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147(2021).</li>
<li>Reiser, J., Altintas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Podocytes.</a> F1000Research. 5, 114(2016).</li>
<li>Ohmori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+NEPHRIN+localization+in+kidney+organoids+derived+from+nephrotic+patient+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 3982(2021).</li>
<li>Morizane, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+nephron+progenitor+cells+and+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo baseado em cultura celular combina a reprogramação epissomal de fibroblastos dérmicos humanos em hiPSCs específicas do paciente e subsequente diferenciação em podócitos derivados de hiPSC. Isso nos permite estudar alterações relacionadas à mutação de podócitos de pacientes com doença genética glomerular em relação à lesão podocitária. O protocolo de reprogramação de fibroblastos dérmicos com método livre de integração por eletroporação é adaptado dos trabalhos publicados de Bang et al.32 e Okita et al.33. O protocolo para diferenciar podócitos de hiPSCs é adaptado do protocolo publicado de Musah et al.28,34,35. Já existem publicações disponíveis descrevendo a geração de podócitos a partir de hiPSCs27,34,35. No entanto, o protocolo aqui apresentado é otimizado e menos dispendioso quanto à diferenciação de hiPSCs em podócitos. Em comparação com o protocolo publicado de Musah et al., testamos este protocolo em diferentes reagentes de revestimento, como vitronectina, laminina silk-511 e matriz de membrana basal solubilizada. As concentrações de vitronectina e laminina seda-511 puderam ser reduzidas para 2,5 μg/mL em vez de 5 μg/mL 28,34,35. Além disso, foi possível diminuir as concentrações de BMP7 e activina A-dois fatores de crescimento muito caros- em 50%, de 100 ng/mL para 50 ng/mL.
Isso permite uma diferenciação menos dispendiosa. As células progenitoras de néfrons a partir do 7º dia ainda estavam proliferando, e a possibilidade de congelamento foi mostrada antes. Expandimos essas células após o descongelamento e antes da diferenciação final em meio básico contendo meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) e B27 por vários dias, diminuindo ainda mais os custos. Além das etapas de diferenciação, este protocolo descreve o crescimento de fibroblastos de biópsias de pele com subsequente geração de hiPSCs específicas do paciente via reprogramação epissomal. A combinação desses dois métodos permite a geração de podócitos específicos para o paciente. Portanto, um protocolo passo-a-passo completo para gerar podócitos derivados de hiPSC específicos para pacientes é fornecido aqui que não foi descrito antes com tantos detalhes.
Como o protocolo geral inclui vários tipos celulares diferentes, é crucial caracterizar os tipos celulares gerados em diferentes etapas. As células estão em cultura por um longo período de tempo, portanto, o controle de qualidade deve ser realizado em diferentes passagens. Ao trabalhar com hiPSCs, a alimentação diária, bem como o monitoramento do comportamento e morfologia celular são necessários. A esterilidade do meio de diferenciação deve ser assegurada pela esterilização do filtro através de um filtro de 0,2 μm. Todo o protocolo, desde a biópsia de pele até os podócitos derivados da hiPSC, leva vários meses, mas é possível congelar as células em etapas distintas do processo. Fibroblastos, clones selecionados de hiPSC e células progenitoras proliferativas de néfrons após 7 dias em meio de diferenciação de progenitores de néfrons podem ser congelados, e um banco de células em funcionamento pode ser gerado.
Embora os podócitos saudáveis derivados da hiPSC desenvolvam uma rede distinta de processos primários e secundários do pé (Figura 5A,B) e expressem marcadores típicos específicos de podócitos (Figura 6A-C), diafragmas de fenda característicos, como visto in vivo, são difíceis de imitar em modelos clássicos de cultura celular bidimensional. Além disso, a comunicação intercelular com outros tipos de células glomerulares não é possível neste ambiente de monocultura.
Devido ao seu estado terminal diferenciado e à falta de capacidade de proliferação, é difícil estudar podócitos ex vivo. Com a ajuda da imortalização condicional dos podócitos primários, é possível superar essa limitação com a inserção de um interruptor termossensível, resultando em um modelo de cultura celular em que as células proliferam a 33 °C e se diferenciam a 37 °C13,14. Embora esses CDovócitos tenham alto potencial para pesquisa de podócitos, existem limitações, como a falta de expressão de marcadores, morfologia desdiferenciada e falha na formação de processospodais15,16.
A diferenciação de podócitos de células somáticas derivadas de pacientes permite a geração e comparação de podócitos doentes com células controle saudáveis ex vivo. Isso nos permite estudar danos em podócitos devido a mutações em genes específicos de podócitos. Além disso, o trabalho com hiPSCs tem o potencial de criar modelos tridimensionais de cultura de células para doenças, ou melhor, organoides43,44. O co-cultivo de podócitos derivados de hiPSC com outras células glomerulares, como células endoteliais glomerulares ou células mesangiais, pode levar a novos conhecimentos sobre a comunicação intercelular na saúde e na doença glomerular.
Além disso, a caracterização e o tratamento dos podócitos específicos do paciente podem ser realizados ex vivo em análises de alto rendimento. A abordagem individualizada abre a oportunidade para investigar novos alvos terapêuticos para mutações específicas e realizar medicina individualizada no futuro.

Os podócitos são células epiteliais renais pós-mitóticas especializadas que formam a barreira de filtração glomerular do rim, juntamente com a membrana basal glomerular (MBG), células endoteliais glomerulares e glicocálice. Fenotipicamente, os podócitos consistem de um corpo celular e extensões primárias de membrana conduzidas por microtúbulos, bem como extensões secundárias denominadas processos podais 1,2. A barreira de filtração glomerular que filtra a urina do sangue é constituída por endotélio fenestrado, GBM, e um tipo especializado de junção intercelular que conecta processos podocitários vizinhos do pé, chamado diafragma de fenda de podoctyes3. Em condições saudáveis, proteínas maiores que a albumina são retidas da barreira de filtração devido ao seu tamanho e carga4.
Mutações em genes específicos do citoesqueleto ou podócitos, bem como fatores circulantes que afetam as vias de sinalização podocitária, são conhecidos por induzir apagamento, descolamento ou apoptose de podócitos, resultando em proteinúria e esclerose glomerular. Em particular, o rearranjo citoesquelético, mudanças na polaridade podocitária ou danos dos processos podais com perda associada das junções da fenda sãofundamentais5. Devido ao seu status terminalmente diferenciado, os podócitos dificilmente podem ser substituídos após o descolamento do GBM. No entanto, se os podócitos estiverem aderidos ao GBM, eles ainda podem se recuperar do apagamento e reformar os processos interdigitais do pé 6,7,8. Uma maior compreensão dos eventos que levam a danos podocitários em várias desordens glomerulares pode fornecer novos alvos terapêuticos que ajudarão no desenvolvimento de tratamentos para essas doenças. O dano podocitário é uma característica de diferentes doenças glomerulares, incluindo glomeruloesclerose segmentar e focal (GESF), nefropatia diabética, doença de lesões mínimas e glomerulonefropatia membranosa, exigindo modelos confiáveis ex vivo de podócitos para estudar os mecanismos patológicos e as abordagens potenciais de tratamento para essas doenças 9,10. Os podócitos podem ser estudados ex vivo por cultura celular primária clássica baseada no isolamento de glomérulos por peneiramentodiferencial11. No entanto, devido ao estado terminalmente diferenciado com capacidade de proliferação limitada, a maioria dos pesquisadores usa linhagens celulares de camundongos ou humanos que expressam variantes sensíveis à temperatura do antígeno T grande SV40. Alternativamente, os ciPodócitos são isolados de camundongos transgênicos que abrigam o gene imortalizante SV40 Tag 1,12.
Os crivócitos proliferam a 33 °C, mas entram em parada de crescimento e começam a se diferenciar a 37 °C13,14. Deve-se ter em mente que os dados experimentais obtidos com essas células devem ser interpretados com certa cautela, uma vez que as células são geradas por inserção gênica não natural15. Como essas células abrigam um gene imortalizante, a fisiologia celular é alterada devido à proliferação contínua12. Linhagens de podocitários geradas por essa abordagem têm sido recentemente questionadas, uma vez que ciPodócitos de camundongos, humanos e ratos expressam menos de 5% de sinaptopodina e nefrina em nível de proteína, bem como NPHS1 e NPHS2 em nível de RNAm em comparação com a expressão glomerular16. Além disso, a maioria das linhagens de podocitários não expressa nefrina17,18. Chittiprol e col. também descreveram diferença significativa na motilidade celular e nas respostas à puromicina e doxorrubicina em ciPodócitos16. Podócitos podem ser encontrados na urina após descolamento do GBM em diferentes doenças glomerulares 19,20,21,22. Podócitos urinários viáveis podem ser cultivados ex vivo por até 2-3 semanas, mas a maioria das células sofre apoptose23,24. Curiosamente, os podócitos não são encontrados apenas na urina de pacientes com doença glomerular, mas também na urina de indivíduos saudáveis, provavelmente quando estão senescentes novamente com um potencial limitado de replicação em cultura24. Além disso, o número de podócitos derivados da urina é limitado, e as células se desdiferenciam em cultura, apresentam menos processos podais, mudam a morfologia e, mais importante, têm capacidade de proliferação limitada. A expressão de genes podocito-específicos está ausente, desaparece em poucas semanas ou varia entre esses clones celulares. Algumas células positivas para o marcador podocitário específico co-expressaram o marcador de células epiteliais tubulares ou miofibroblastos e células mesangiais, o que sugere desdiferenciação e/ou transdiferenciação dos podócitos urinários cultivados24,25.
Recentemente, foi descrita a geração de linhagens celulares de ciPodócitos derivadas da urina de pacientes e voluntários sadios por transdução com antígeno T grande SV40 termossensível e hTERT26. A expressão de RNAm para sinaptopodina, nestina e proteína associada a CD2 foi detectada, mas o RNAm da podocina esteve ausente em todos os clones. Além dos problemas com podócitos urinários, essas células também contêm o gene imortalizante inserido, resultando nas desvantagens discutidas acima.
Em contraste, as células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) têm uma enorme capacidade de se auto-renovar e se diferenciar em vários tipos celulares sob condições apropriadas. Já foi demonstrado anteriormente que as hiPSCs podem servir como uma fonte quase ilimitada de podócitos27,28.
Aqui é descrito um protocolo de duas etapas para gerar podócitos específicos do paciente a partir de fibroblastos dérmicos de biópsias de punch de pele com subsequente reprogramação epissomal em hiPSCs e uma diferenciação final em podócitos derivados de hiPSC (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig01.jpg"> Figura 1: Protocolo para geração de podócitos derivados da hiPSC específicos do paciente. Visão gráfica do protocolo de geração de podócitos específicos do paciente a partir de fibroblastos dérmicos de uma biópsia de pele através da reprogramação em hiPSCs e diferenciação em podócitos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Como primeiro passo, fibroblastos somáticos dérmicos foram superados de uma biópsia por punch de pele e reprogramados em hiPSCs usando um método livre de integração por eletroporação com plasmídeos expressando os fatores de transcrição OCT3/4, KLF4, SOX2 e c-MYC 29,30,31. Colônias de hiPSC emergentes foram posteriormente selecionadas e expandidas. A diferenciação iniciou-se com a indução da linhagem mesodérmica pela ativação da via de sinalização WNT, seguida pela geração de células progenitoras de néfrons que ainda eram capazes de proliferar. Finalmente, as células foram diferenciadas em podócitos. Nesse procedimento, modificamos e combinamos protocolos de reprogramação epissomal para geração de hiPSCs de Bang et al.32 e Okita et al.33 publicados anteriormente, bem como um protocolo de diferenciação de hiPSCs em podócitos de Musah et al.28,34,35.
De fato, os podócitos gerados pelo nosso protocolo apresentaram um fenótipo mais próximo dos podócitos in vivo, no que diz respeito ao desenvolvimento de uma rede distinta de processos podais primários e secundários e à expressão de marcadores podocitários específicos, como sinaptopodina, podocina e nefrina. Com o uso de podócitos derivados da hiPSC, o background genético do paciente é mantido durante a reprogramação e diferenciação. Isso permite a modelagem da doença podocitária específica do paciente e a descoberta de potenciais substâncias terapêuticas ex vivo em um número de células quase ilimitado. Além disso, esse protocolo é minimamente invasivo, custo-eficiente, eticamente aceitável e pode facilitar novos caminhos para o desenvolvimento de fármacos.

<table><tbody><tr><td>0,2 &micro; m filtro estéril</td><td>Rotilab</td><td>P668.1</td><td>para esterilização de meio de diferenciação</td></tr><tr><td>ácido all-trans retinóico</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72262</td><td>suplemento para diferenciação</td></tr><tr><td>Suplemento B27 (50 x), suplemento</td><td>de 17504044</td><td>Gibco</td> sem <td>soro para meio de diferenciação sem soro</td></tr><tr><td>BG iMatrix-511 Silk</td><td>biogems</td><td>RL511S</td><td>opção adicional de reagente de matriz extracelular usado em solução de revestimento para revestir plásticos de cultura de células adequados para cultura de hiPSC</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)&nbsp;</td><td>Frascos</td> de Cultura de Células com Tampa de Filtro Roth <td>8076.4</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR, T75, 250 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>82050-856</td><td>plásticos de cultura de células adequados para CHIR99021 de cultura de fibroblastos</td></tr><tr><td>(5 mg)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>252917-06-9&nbsp;</td><td>Suplemento para diferenciação</td></tr><tr><td>Matriz qualificada Corning Matrigel hESC</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>opção adicional de reagente de matriz extracelular usado em solução de revestimento para revestir plásticos de cultura celular adequados para cultura hiPSC (matriz de membrana basal solubilizada)</td></tr> <tr><td>countess Cell Counting Chamber</td><td>Slides Invitrogen</td><td>C10283</td><td>para células de contagem</td></tr><tr><td>countess II FL&nbsp; Contador de Células Automatizado</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>para contagem de células</td></tr><tr><td>crioTubos puros, 2 ml, tampa de rosca QuickSeal, branco</td><td>Sarstedt</td><td>72380</td><td>criogenials para congelamento de células</td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)&nbsp;</td><td>Roth</td><td>A994.1</td><td>para meio de congelamento de fibroblastos</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1 x)</td><td>Gibco</td><td>11320074</td><td>meio básico para diferenciação</td></tr><tr><td>DMEM/F12 + Glutamax</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td>meio básico para meio de fibroblastos</td></tr><tr><td>EVOS M5000 Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>microscópio de contraste de</td><td>fase</td>AMF5000</tr><tr><td>soro bovino fetal premium, inativado (FCS)</td><td>Soro P301902 PAN Biotech</td><td></td><td>para meio de fibroblastos, meio de congelamento de fibroblastos e meio de manutenção de podócitos</td></tr><tr><td>fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm de folga, 800 &micro; L capacidade, cubeta estéril</td><td>Fisherbrand</td><td>FB104</td><td>usada para eletroporação/reprogramação episódica de fibroblastos (lacuna de 4 mm)</td></tr><tr><td>Meio de montagem fluoromount-G, com</td> meio de montagem DAPI <td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td> contendo agulha de calibre <td>dapi</td></tr><tr><td>(0,6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance3</td><td>300700</td><td>para separação de colônias hiPSC em pequenos pedaços</td></tr><tr><td>de proteína Activin A</td> <td>recombinante humana78001.1</td><td>Suplemento de tecnologias de células-tronco</td><td>para diferenciação</td></tr><tr><td>proteína morfogenética óssea recombinante humana 7 (BMP7)</td><td>Suplemento Peprotech</td><td>120-03P</td><td>para diferenciação</td></tr><tr><td>de proteína recombinante humana VEGF-165</td><td>Thermo Scientific</td><td>PHC9394</td><td>suplemento para diferenciação</td></tr><tr><td>insulina-transferrina-selênio (ITS-G) (100 x)</td><td>Suplemento</td><td>41400045</td><td>Gibco para meio de manutenção de podócitos</td></tr><tr><td>LB médio</td><td>Roth</td><td>X964.1</td><td>para teste de esterilidade de cultura hiPSC</td></tr><tr><td>lookOut Kit de detecção de micoplasma PCR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MP0035-1KT</td><td>kit comercial de detecção de micoplasma</td></tr><tr><td>lâminas de microscópio</td><td>Diagonal GmbH & Co.KG</td><td>21.102</td><td></td></tr><tr><td>microtubo 1,5 mL&nbsp;</td><td>Kit Completo Sarstedt</td><td>72706400</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85850</td><td>meio básico para hiPSC sem soro recipiente</td></tr><tr><td>de congelamento nalgene Mr.Frosty</td><td>Roth</td><td>AC96.1&nbsp;</td><td>para garantir condições ideais de congelamento</td></tr><tr><td>Soro de Cabra Normal</td><td>Abcam</td><td>AB 7481</td><td>para Solução Pré-incubação e Diluente de Anticorpos</td></tr><tr><td>Nunc 24 Placas de Poços</td><td>Thermo Scientific</td><td>142485</td><td>Plásticos de Cultura de Células adequados para Placas de Cultura HiPSC</td></tr><tr><td>nunc 48 Poços&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>152640</td><td>plásticos de cultura de células adequados para placas de cultura hiPSC</td></tr><tr><td>nunc 6 poços&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>140685</td><td>plásticos de cultura de células adequados para cultura hiPSC</td></tr><tr><td>nunc EasYDish Pratos 100 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150466</td><td>plásticos de cultura de células adequados para cultura hiPSC</td></tr><tr><td>microWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>plásticos de cultura de células adequados para cultura hiPSC</td></tr><tr><td>nutriFreez D10 Cryopreservation Medium</td><td>Sartorius</td><td>05-713-1E&nbsp;</td><td>meio de criopreservação sem soro para criopreservação de hiPSC e células progenitoras de néfrons</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td>meio de eletroporação&nbsp;</td></tr><tr><td>plasmídeo pCXLE-hMLN</td><td>Addgene</td><td>#27079</td><td>para reprogramação episómica</td></tr><tr><td>plasmídeo pCXLE-hOCT3/4 plasmídeo</td><td>Addgene</td><td>#27077</td><td>para reprogramação episómica</td></tr><tr><td>plasmídeo pCXLE-hSK plasmídeo</td><td>Addgene</td><td>#27078</td><td>para reprogramação episómica</td></tr><tr><td>penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td>para evitar contaminação bacteriana</td></tr><tr><td>plástico lamínulas</td><td>Sarstedt</td><td>&nbsp; 83.1840.002</td><td>para colorações imunofluorescentes de hiPSCs e podócitos derivados de hiPSC</td></tr><tr><td>ROTI Histofix</td><td>Roth</td><td>P087.3</td><td>paraformaldeído comercial (4%) para fixação de células</td></tr><tr><td>RPMI 1640 + L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>21875034</td><td>meio básico para manutenção de podócitos</td></tr><tr><td>câmara de coloração StainTray Tampa preta</td><td>Roth</td><td>HA51.1</td><td></td></tr><tr><td>stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>solução enzimática de desprendimento celular usada para dissociação de hiPSCs</td></tr> solução <tr><td>salina tamponada com fosfato estéril (PBS) (1 x)</td> <td>Gibco</td><td>14190094</td><td>usado para lavar e revestir</td></tr><tr><td>água estéril</td><td>Seringa Roth</td><td>T1432</td><td></td></tr><tr><td>sem agulha 20 mL</td><td>BD Plastipak</td><td>300629</td><td>para filtrar esterilizar meio de diferenciação</td></tr><tr><td>TC dish 100 mm</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,902</td><td>plásticos de cultura de células estéreis usados para cortar a biópsia de pele e cultura de fibroblastos</td></tr><tr><td>TC dish 35 mm</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,900</td><td>plásticos de cultura de células estéreis usados para superar fibroblastos de biópsia de pele</td></tr><tr><td>triton X 100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td>para solução de pré-incubação&nbsp;</td></tr><tr><td>Mancha Azul de Tripano (0,4%) para uso com o Contador de Células Automatizado Countess</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>para contar células</td></tr><tr><td>tripsina-EDTA (10 x)&nbsp;</td><td>Reagente</td> de dissociação Biowest <td>X0930-100</td><td>usado para fibroblastos e células progenitoras</td></tr><tr><td>de néfrons tubo 15 mL</td><td>Tubo Greiner bio-one</td><td>188271-N</td><td></td></tr><tr><td>50 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>vitronectina ACF</td><td>Sartorius</td><td>05-754-0002</td><td>reagente de matriz extracelular usado em solução de revestimento para revestir plásticos de cultura celular adequados para cultura</td></tr> <tr><td>hiPSCCloridrato de Y-27632 (10 mg)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>para evitar a apoptose de hiPSCs durante a divisão</td></tr><tr><td><forte>Anticorpos primários</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT4&nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60093.1</td><td>marcador de pluripotência, diluição 1:200</td></tr><tr><td>SSEA-4 Stem</td><td>Cell Technologies</td><td>60062FI.1</td><td>marcador de pluripotência, diluição 1:100</td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>marcador de proliferação, diluição 1:300</td></tr><tr><td>sinaptopodina</td><td>Proteintech</td><td>21064-1-AP</td><td>marcador específico de podócitos, diluição 1:200</td></tr><tr><td>nefrina</td><td>Progen</td>Marcador específico de podócitos <td>GP-N2</td><td>, diluição 1:25</td></tr><tr><td>podocin</td><td>proteintech</td><td>20384-1-AP</td><td>marcador específico de podócitos, diluição 1:100</td></tr><tr><td><forte>Anticorpos secundários</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cabra anticorpo secundário altamente adsorvido de cobaia IgG (H+L), Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21435</td><td>secundário e corpo, diluição 1:1000</td></tr><tr><td>alexa Fluor 647 Kit SFX anti-coelho para cabras, corpo</td> secundário <td>Invitrogen</td><td>A31634</td> com adsorção cruzada altamente adsorvido<td>, diluição 1:1000</td></tr><tr><td>anticorpo secundário anti-coelho IgG (H+L) altamente adsorvido cruzado, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>corpo secundário, diluição 1:1000</td></tr><tr><td>anticorpo secundário anti-IgG de camundongo (H+L) para cabras, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td>secundário e corpo, diluição 1:1000</td></tr><tr><td>anticorpo secundário de adsorção cruzada IgG de camundongo (H+L) de cabra, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>secundário e corpo de proteção, diluição 1:1000</td></tr></tbody></table>

geração de podócitos derivados do paciente a partir de biópsias de pele

Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies

Os podócitos são células epiteliais situadas no sítio urinário da barreira de filtração glomerular que contribuem para a função filtrante seletiva do glomérulo. Mutações em genes específicos de podócitos podem causar glomeruloesclerose segmentar e focal (GESF), e podócitos também são afetados em muitas outras nefropatias primárias e secundárias. Devido à sua natureza diferenciada, os modelos de cultura celular primária são limitados para podócitos. Portanto, células comumente imortalizadas condicionalmente são usadas. No entanto, esses podócitos condicionalmente imortalizados (ciPodócitos) têm várias limitações: as células podem se desdiferenciar em cultura, especialmente quando atingem confluência, e vários marcadores específicos de podócitos são apenas ligeiramente ou não são expressos. Isso coloca em questão o uso de ciPodócitos e sua aplicabilidade para alcance fisiológico, fisiopatológico e clínico. Aqui, descrevemos um protocolo para a geração de podócitos humanos - incluindo podócitos específicos do paciente - a partir de uma biópsia por punch de pele por reprogramação epissomal de fibroblastos dérmicos em hiPSCs e posterior diferenciação em podócitos. Esses podócitos se assemelham muito melhor aos podócitos in vivo em termos de características morfológicas, como o desenvolvimento de processos podais e a expressão do marcador específico de podócitos. Finalmente, mas importante, essas células mantêm as mutações dos pacientes, resultando em um modelo ex vivo aprimorado para estudar doenças podocitárias e potenciais substâncias terapêuticas em uma abordagem individualizada.

Com este protocolo passo-a-passo que combina reprogramação e diferenciação epissomal, é possível gerar podócitos portadores da mutação de um paciente em um gene relevante para podócitos. Isso permite a análise de alterações podocitárias doença-específicas ex vivo. O background genético do paciente é preservado durante o protocolo durante todos os diferentes estágios celulares. Além disso, a limitação do número insuficiente de células de podócitos não proliferantes terminalmente diferenciados pode ser superada com o uso de podócitos derivados de hiPSC. Embora os hiPSC-podócitos sejam gerados a partir de fibroblastos dérmicos crescidos por meio de reprogramação em hiPSCs e posterior diferenciação em podócitos, é possível congelar as células em três etapas diferentes do protocolo (Figura 2). O congelamento é possível para fibroblastos, hiPSCs e células progenitoras de néfrons após diferenciação em meio de diferenciação de progenitores de néfrons por 7 dias. Portanto, a geração de bancos de células em funcionamento e experimentos em larga escala é possível.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig02.jpg"> Figura 2: Etapas individuais do protocolo através de microscópio de contraste de fase. (A) Fibroblastos dérmicos crescidos. (B) formação de colônias hiPSC após reprogramação. (C) Cultura hiPSC selecionada. (D) Células mesodérmicas após 2 dias de diferenciação. (E) Células progenitoras de néfrons após 14 dias de diferenciação em meio de diferenciação de progenitores de néfrons. (F) Podócitos terminais diferenciados derivados de hiPSC. As barras de escala representam 300 μm (A,B,D-F) e 150 μm (C). O floco de neve destaca possíveis etapas de congelamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Como os podócitos derivados da hiPSC gerados atravessam um longo protocolo com mudanças drásticas em relação ao tipo e morfologia celular, a caracterização celular é obrigatória. A morfologia celular, como tamanho e forma celular, bem como o comportamento de crescimento, podem ser monitorados usando um microscópio de contraste de fase. Os fibroblastos apresentam fenótipo fusiforme longo, com tamanho de 150 μm a 300 μm (Figura 2A). Após a reprogramação, ocorrem colônias com 50 μm de pequenas hiPSCs. Essas colônias exibem bordas distintas e hiPSCs distinguem-se com uma alta relação núcleo-corpo e aumento da taxa de proliferação (Figura 2C). Como os podócitos são células terminalmente diferenciadas, a taxa de proliferação diminui com a diferenciação progressiva, e a morfologia celular muda para 300 μm de grandes podócitos estrelados com processos proeminentes nos pés (Figura 2F).
A confluência é um ponto crítico da cultura hiPSC, e a diferenciação espontânea pode aparecer quando as colônias crescem muito densas (Figura 3). Essas colônias devem ser removidas antes da passagem, raspando as partes afetadas da placa de cultura.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig04.jpg"> Figura 3: Exemplos de hiPSCs de diferentes qualidades. Imagens de contraste de fase de (A) colônias hiPSC reprogramadas com sucesso e (B) hiPSCs selecionadas, bem como (C) diferenciação espontânea, (D,E) colônias não-hiPSC e (F) uma cultura hiPSC muito densa. As barras de escala representam 300 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os diferentes tipos celulares deste protocolo devem ser validados quanto à expressão de um marcador específico. Após a reprogramação, as hiPSCs recuperam a capacidade de pluripotência e expressam marcadores de proliferação e pluripotência como SSEA4, OCT3/4 e Ki67 (Figura 4)38,39,40. Sabe-se que a reprogramação, assim como a longa cultura das hiPSCs e diferenciação, pode levar a um cariótipo anormal, ou melhor, induzir mutações41. Portanto, o background genético das células cultivadas deve ser monitorado ao longo do tempo e em diferentes passagens por bandas G e sequenciamento completo do exoma.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig03.jpg"> Figura 4: Caracterização das hiPSCs geradas pela coloração por imunofluorescência. Caracterização das hiPSCs geradas pela coloração para (A) o marcador proliferativo Ki67, bem como os marcadores de pluripotência (B) OCT3/4 e (C) SSEA4. As barras de escala representam 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Morfologicamente, os podócitos derivados da hiPSC aparecem em forma de estrela e expressam uma rede distinta de processos longos primários e secundários do pé em comparação com os ciPodócitos (Figura 5). Os podócitos derivados da HiPSC expressam proteínas marcadores específicas para podócitos, como sinaptopodina, nefrina e podocina (Figura 6A-C)42.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig05.jpg"> Figura 5: Morfologia dos podócitos derivados da hiPSC em comparação com os iiPodócitos. Comparação de podócitos derivados de (A,B) hiPSC de um doador saudável com ciPodócitos (C,D) em relação à morfologia celular e filópodes usando um microscópio de contraste de fase (A,C) e microscópio eletrônico de varredura (B,D). As barras de escala representam 150 μm (A,C) e 20 μm (B,D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Portanto, a comparação de podócitos derivados da hiPSC não apenas de doadores saudáveis, mas também de pacientes com mutações em genes específicos de podócitos, permite caracterizar de forma individualizada a mutação do paciente ex vivo.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig06.jpg"> Figura 6: Caracterização de um marcador podocito-específico em podócitos e ciPodócitos derivados de hiPSC. Comparação de podócitos derivados de hiPSC (A-C) de um doador saudável com ciPodócitos (D-F) em relação às proteínas marcadores específicas de podócitos sinaptopodina (A,D), nefrina (B,E) e podocina (C,F). As barras de escala representam 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1. Composição de todos os meios de cultura celular e soluções utilizadas no estudo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/Table%201_REv2.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Este manuscrito descreve um protocolo de duas etapas para gerar podócitos específicos do paciente a partir de fibroblastos dérmicos via reprogramação epissomal em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) e subsequente diferenciação em podócitos.

Geração de Podócitos Derivados do Paciente a partir de Biópsias de Pele

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the ...

Descrevemos um protocolo para geração de podócitos humanos por reprogramação epissomal de fibroblastos dérmicos em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. Essas células assemelham-se muito melhor aos podócitos in vivo do que os podócitos imortalizados em termos de processos alimentares podocitários e expressão de marcador específico para podócitos. Os podócitos são células terminalmente diferenciadas.Portanto, essas células não proliferam mais e a análise primária de podócitos em cultura celular é limitada. Embora o problema do número limitado de células tenha sido superado com o uso de podócitos imortalizados condicionalmente, esses podócitos apresentam fenótipo e comportamento desdiferenciados, o que questiona seu uso em pesquisa básica. Com a ajuda de células-tronco pluripotentes induzidas, podócitos podem ser gerados in vitro em um número quase ilimitado de células com morfologia típica de podócitos, incluindo processos alimentares distintos e expressão de marcadores específicos para podócitos.Ao usar as células-tronco específicas do paciente para se diferenciar em podócitos, é possível estudar as alterações doença-específicas da célula ex vivo. No caso, a biópsia de pele inicial foi realizada de um paciente com doença genética podocitária. Os podócitos gerados com nosso protocolo são células doentes personalizadas que carregam a mutação do paciente.Assim, essas células representam um modelo aprimorado ex vivo para estudar doenças podocitárias e potenciais substâncias terapêuticas em uma abordagem individualizada.

generation-of-patient-derived-podocytes-from-skin-biopsies

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, descrevemos o protocolo para derivar podócitos renais humanos de células-tronco pluripotentes induzidas por meio da diferenciação celular sob condições químicas definidas. Os podócitos gerados podem ser usados para testes de nefrotoxicidade e modelagem de doenças.

Derivação de podócitos renais humanos de células-tronco pluripotentes induzidas: um procedimento para diferenciação direcionada de podócitos renais maduros de células-tronco

O objetivo deste artigo é fornecer um protocolo abrangente e detalhado sobre como gerar pele organotípica humana geneticamente modificada a partir de queratinócitos epidérmicos e derme humana desvitalizada.

Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organotï¿½icas Usando desvitalizado derme humana

Propomos um protocolo que mostra como diferenciar pluripotentes induzidas células-tronco derivadas de queratinócitos e fibroblastos e gerar uma pele 3D organoides, usando estes queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo contém uma etapa adicional de gerar um modelo de ratos humanizados. A técnica aqui apresentada vai melhorar pesquisa dermatológica.

Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes

Apresentado aqui é um protocolo quimicamente definido para a derivação de podocitos renais humanos de células-tronco pluripotentes induzidas com alta eficiência (&gt;90%) e independente de manipulações genéticas ou seleção de subpopulação. Este protocolo produz o tipo de célula desejada dentro de 26 dias e pode ser útil para testes de nefrocoxicidade e modelagem de doenças.

Diferenciação guiada de podocitos renais maduros de células-tronco pluripotentes induzidas humanas sob condições quimicamente definidas

Apresentamos aqui um protocolo para projetar um sistema personalizado de organ-on-a-chip que recapitula a estrutura e a função da barreira de filtração glomerular renal, integrando células endoteliais epiteliais e vasculares geneticamente combinadas diferenciadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. Este sistema de bioengenharia pode avançar a medicina de precisão renal e aplicações relacionadas.

Chip de glomérulo renal isogênico projetado a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Dissociar as células de tipos de tecido específico requer parâmetros específicos para aggitation tecido para obter um volume elevado de viáveis, as células cultiváveis. A Miltenyi gentleMACS Dissociator otimiza essa tarefa com um protocolo simples e prática. Nesta publicação o uso deste aparelho no tecido nerual é explicado.

Geração de Single-Cell Tissue Suspensões de rato Neural

Uma maneira rápida e robusta de isolar células-tronco adultas viável epiteliais da pele humana é descrito. O método utiliza a digestão enzimática da matriz de colágeno da pele, seguido por arrancar dos folículos pilosos e isolamento de células em suspensão simples ou fragmentos de tecido para cultura de células.

Isolamento e Cultura de Células-Tronco Adultas epitelial da pele humana

Gerando pluripotentes induzidas de células-tronco (IPSC) produz linhas de linhas de diferentes potencial de desenvolvimento, mesmo quando eles passam por testes padrão pluripotência. Aqui nós descrevemos um protocolo para produzir ratos derivadas inteiramente de iPSCs, que define as linhas iPSC como possuindo pluripotência...

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

As proteínas podem adotar uma estrutura nativa ou se dobrar em amilóide insolúvel. As condições que favorecem a via de desdobramento levam à formação de diferentes tipos de fibrilas amilóides. Os métodos descritos aqui permitem a rápida conversão de proteínas nativas em amilóide in vitro.

Geração rápida de amilóide a partir de proteínas nativas in vitro

Aqui, nós descrevemos um protocolo baseado em reprogramação epigenética de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) para a geração de uma população homogênea de células progenitoras musculares esqueléticas que, sob condições de cultura permissiva formam aglomerados tridimensionais de miofibras contráteis (myospheres), que recapitulam características biológicas do ser humano músculos esqueléticos.

Geração de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramação

Aprenda a gerar podócitos derivados do paciente a partir de fibroblastos dérmicos usando reprogramação episomal em células-tronco pluripotentes induzidas. Este método permite modelar doenças renais de forma personalizada.

Geração de Podócitos Derivados do Paciente a partir de Biópsias de Pele

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