Name: Um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprenda um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial em levedura, explorando o papel do CQD1 na importação de lipídios e na formação de cristas mitocondriais. Esta técnica avança o conhecimento em biologia celular.

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M.E.H. reconhece a Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projeto número 413985647, pelo apoio financeiro. Os autores agradecem ao Dr. Michael Kiebler, Ludwig-Maximilians University, Munique, por seu generoso e extenso apoio. Somos gratos a Walter Neupert por sua contribuição científica, discussões úteis e inspiração contínua. J.F. agradece à Graduate School Life Science Munich (LSM) pelo apoio.

1. Amortecedores e soluções de reserva
<ol><li>Fazer uma solução de ácido 3-morfolinopano-1-sulfónico (MOPS) 1 M em água deionizada, pH 7,4. Conservar a 4 °C.</li>
	<li>Preparar 500 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em água deionizada, pH 8,0. Conservar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar sorbitol 2,4 M em água deionizada. Armazenar à temperatura ambiente após autoclavagem.</li>
	<li>Preparar sacarose 2,5 M em água deionizada. Armazenar à temperatura ambiente após autoclavagem.</li>
	<li>Preparar fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) 200 mM em isopropanol. Conservar a -20 °C. CUIDADO: PMSF É TÓXICO se ingerido e causa queimaduras graves na pele e danos oculares. Não respire a poeira e use luvas e óculos de proteção.</li>
	<li>Preparar ácido tricloroacético (TCA) a 72% em água deionizada. Conservar a 4 °C. CUIDADO: O TCA pode causar irritação respiratória, queimaduras graves na pele e danos nos olhos. Não respire a poeira e use luvas e óculos de proteção.</li>
	<li>Prepare o tampão SM: MOPS 20 mM e sorbitol 0,6 M, pH 7,4.</li>
	<li>Prepare o tampão de intumescimento: MOPS 20 mM, EDTA 0,5 mM, PMSF 1 mM e coquetel inibidor de protease, pH 7,4.</li>
	<li>Preparar os tampões de gradiente de sacarose: 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M e 1,3 M em 20 mM MOPS, e 0,5 mM EDTA, pH 7,4. NOTA: Todos os buffers podem ser armazenados a 4 °C; no entanto, recomenda-se armazenar os tampões contendo sacarose a -20 °C para evitar o crescimento de fungos. Os inibidores de protease devem ser adicionados frescos antes da utilização.</li>
</ol>2. Geração de vesículas subsubcomdriais
<ol><li>Isole mitocôndrias de levedura bruta na hora de acordo com protocolos estabelecidos34,35. NOTA: Para este experimento, mitocôndrias foram isoladas de Saccharomyces cerevisiae. A geração de mitocôndrias puras em gradiente desprovidas de outras organelas não é necessária.</li>
	<li>Ressuspender 10 mg de mitocôndrias recém-isoladas em 1,6 mL de tampão SM (4 °C) por pipetagem (Figura 2, passo 1).</li>
	<li>Transferir a suspensão mitocondrial para um balão de Erlenmeyer pré-resfriado de 100 mL.</li>
	<li>Adicione lentamente 16 ml de tampão de inchamento utilizando uma pipeta de vidro de 20 ml. Aplique agitação suave constante sobre o gelo durante a adição. Este tratamento osmótico resulta na absorção de água para o espaço matricial. O inchaço da membrana interna mitocondrial irá romper a membrana externa. No entanto, ambas as membranas permanecerão em contato nos locais de contato9 (Figura 2, passo 2).</li>
	<li>Incubar as amostras sob agitação suave constante durante 30 min sobre gelo.</li>
	<li>Adicionar lentamente 5 mL de solução de sacarose 2,5 M usando uma pipeta de vidro de 5 mL para aumentar a concentração de sacarose nas amostras para aproximadamente 0,55 M. Esse tratamento osmótico resulta em um efluxo de água da matriz36. O encolhimento da membrana interna destina-se a maximizar sua distância aos fragmentos residuais da membrana externa. Isso diminui a probabilidade de gerar vesículas híbridas artificiais das membranas interna e externa através da sonicação (Figura 2, passo 3).</li>
	<li>Incubar as amostras sob agitação suave durante 15 minutos sobre gelo.</li>
	<li>Submeter as mitocôndrias à sonicação para gerar vesículas de membrana subocondrial (Figura 2, passo 4).<ol><li>Transfira a suspensão mitocondrial para uma célula de roseta pré-resfriada.</li>
		<li>Sonicar a suspensão mitocondrial a uma amplitude de 10% por 30 s enquanto resfria a célula de roseta em um banho de gelo.</li>
		<li>Descanse a suspensão por 30 s em um banho de gelo.</li>
		<li>Repita as etapas 2.8.2 e 2.8.3 mais três vezes. NOTA: As condições de sonicação variam de acordo com o sonicator usado. A otimização será necessária para máquinas individuais. A sonicação que é muito dura levará à formação artificial de vesículas consistindo de membranas internas e externas mitocondriais.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Separação das vesículas sub-ocondrais
<ol><li>Separe as vesículas geradas das mitocôndrias intactas remanescentes por centrifugação a 20.000 x g por 20 min a 4 °C. As mitocôndrias intactas serão peletizadas enquanto as vesículas permanecerão no sobrenadante.</li>
	<li>Concentrar a mistura de vesículas.<ol><li>Transfira o sobrenadante para tubos de ultracentrifugação frescos.</li>
		<li>Coloque uma almofada de 0,3 mL de solução de sacarose 2,5 M no fundo do tubo usando uma seringa de 1 mL equipada com uma cânula de 0,8 mm x 120 mm.</li>
		<li>Centrifugar a 118.000 x g por 100 min a 4 °C. OBS: Neste caso, foi utilizado rotor de caçamba oscilante com raio máximo de 153,1 mm. As condições de centrifugação dependem fortemente do rotor e terão que ser adaptadas quando outro rotor for usado.</li>
	</ol></li>
	<li>As vesículas aparecerão como um disco na parte superior da almofada de sacarose após a centrifugação. Descarte aproximadamente 90% do sobrenadante. Agora, colha as vesículas concentradas ressuspendendo-as no tampão restante, incluindo a sacarose de 2,5 M, pipetando para cima e para baixo. Transfira a suspensão para um homogeneizador Dounce gelado.</li>
	<li>Homogeneizar a suspensão com pelo menos 10 tempos utilizando um oleiro de politetrafluoretileno.</li>
	<li>Prepare o gradiente de sacarose.<ol><li>Para um gradiente de passo de 11 mL com cinco passos (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M e 0,8 M de sacarose em MOPS 20 mM e EDTA 0,5 mM, pH 7,4), cada camada possui 2,2 mL de solução de sacarose. NOTA: Um refratômetro é recomendado para medir e ajustar as concentrações de sacarose; no entanto, não é essencial. Aplicar 10 μL do tampão no refratômetro e detectar os respectivos índices de refração. O cálculo da concentração de sacarose é o seguinte: <img alt="Equação de concentração de sacarose em molaridade; Diagrama para análise de medição do índice de refração." src="/files/ftp_upload/65444/65444eq01v2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> 1,3333 representa o índice de refração da água. 0,048403 é um índice de conversão específico da sacarose obtido a partir da escalonamento linear da refratividade molar à concentração de sacarose em soluções aquosas 37.</li>
		<li>Adicione a maior concentração de sacarose ao tubo de centrifugação e coloque o tubo a -20 °C. Aguarde até que a camada esteja completamente congelada antes de aplicar a próxima. Prossiga em conformidade até que a última camada seja adicionada e armazene os gradientes a -20 °C. NOTA: Lembre-se de transferir os gradientes congelados para 4 °C ao iniciar o experimento para permitir que os gradientes descongelem. Isso levará aproximadamente 3 h. Para a centrifugação, utilizou-se um rotor basculante com capacidade de 13,2 mL. Quando um rotor diferente é usado, os volumes do passo de gradiente devem ser adaptados de acordo.</li>
	</ol></li>
	<li>Medir a concentração de sacarose das amostras utilizando um refratómetro. Se não houver acesso a um refratômetro, pode-se alternativamente supor que a concentração de sacarose é de 2 M. Essa suposta concentração de sacarose será então a base para o próximo passo.</li>
	<li>Ajustar a concentração de sacarose para 0,6 M pela adição de uma quantidade adequada de MOPS 20 mM, EDTA 0,5 mM, PMSF 1 mM e cocktail inibidor de protease, pH 7,4. Se a concentração de sacarose for estimada em 2 M em vez de ser medida, recomenda-se testar se a concentração é suficientemente baixa após o ajuste. Aplicar uma pequena alíquota da amostra (cerca de 50 μL) sobre 200 μL de sacarose 0,8 M num tubo de ensaio. A amostra deve ficar em cima da sacarose de 0,8 M.</li>
	<li>Carregar as amostras (aproximadamente 1 mL) sobre o gradiente de sacarose (manter 10% para referência posterior). A pipetagem cuidadosa é importante para evitar a perturbação do gradiente (Figura 2, passo 5).</li>
	<li>Separe as vesículas por centrifugação a 200.000 x g e 4 °C durante 12 horas. Se possível, ajuste a centrífuga para diminuir a aceleração e desaceleração para evitar a perturbação do gradiente (Figura 2, passo 6). OBS: Neste caso, foi utilizado rotor de caçamba oscilante com raio máximo de 153,1 mm. As condições de centrifugação dependem fortemente do rotor e terão que ser adaptadas quando outro rotor for usado.</li>
	<li>Colher o gradiente de cima para baixo em frações de 700 μL usando uma pipeta de 1 mL. Isso resultará em 17 frações, o que permite uma resolução suficiente.</li>
</ol>4. Análise das vesículas subocondriais
<ol><li>Concentrar as proteínas submetendo cada fração a duas precipitações de TCA realizadas sequencialmente38 para preparar as amostras de SDS-PAGE.<ol><li>Adicionar 200 μL de TCA a 72% às fracções individuais e misturar até que a solução fique homogénea. Incubar as frações por 30 min sobre gelo e pelar as proteínas precipitadas por centrifugação a 20.000 x g e 4 °C por 20 min. Eliminar o sobrenadante, adicionar 500 μL de solução de TCA a 28 %, misturar bem e repetir o passo de centrifugação.</li>
		<li>Lavar os pellets com 1 ml de acetona (-20°C) e centrifugar durante 10 minutos a 20.000 x g e 4 °C. Descarte o sobrenadante e deixe os pellets secarem ao ar. Ressuspender os pellets em 60 μL de tampão de amostra SDS e incubar as amostras por 5 min a 95 °C. NOTA: Uma grande quantidade de sacarose permanecerá, particularmente nas frações de alta densidade, após a primeira precipitação de TCA. Isso será removido através da precipitação adicional de TCA.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisar 20 μL de cada fração por SDS-PAGE39 e immunoblotting40,41,42,43.</li>
</ol>

Isolamento de locais de contato mitocondrial

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

O subfracionamento mitocondrial é um experimento complicado com várias etapas altamente complexas. Assim, buscou-se aprimorar ainda mais e, até certo ponto, simplificar nosso método estabelecido32. Aqui, os desafios foram a exigência de equipamentos complicados e altamente especializados, que muitas vezes são construções individuais, e o enorme consumo de tempo e energia. Para tanto, procurou-se remover as bombas e construções individuais utilizadas para fundição e colheita do gradiente linear e a...

As mitocôndrias desempenham uma variedade de funções diferentes em eucariotos, sendo a mais conhecida a produção de ATP através da fosforilação oxidativa. Outras funções incluem a produção de clusters ferro-enxofre, síntese lipídica e, em eucariotos superiores, sinalização de Ca2+ e indução de apoptose 1,2,3,4. Essas funções estão inseparavelmente ligadas à sua complexa ultraestrutura.
A ultraestrutura mitocondrial foi primeiramente descrita por microscopia eletrônica5. Foi demonstrado que as mitocôndrias são organelas bastante complexas que consistem em duas membranas: a membrana externa mitocondrial e a membrana interna mitocondrial. Assim, dois compartimentos aquosos são formados por essas membranas: o espaço intermembrana e a matriz. A membrana interna mitocondrial pode ser ainda mais dividida em diferentes seções. A membrana limite interna permanece próxima à membrana externa, e as cristas formam invaginações. As chamadas junções cristas conectam a membrana limite interna e as cristas (Figura 1). Além disso, micrografias eletrônicas de mitocôndrias osmoticamente encolhidas revelam que existem locais nos quais as membranas mitocondriais estão firmemente conectadas 6,7. Esses chamados sítios de contato são formados por complexos proteicos que abrangem as duas membranas (Figura 1). Acredita-se que esses sítios de interação sejam essenciais para a viabilidade celular devido à sua importância para a regulação da dinâmica e herança mitocondrial, bem como para a transferência de metabólitos e sinais entre o citosol e amatriz8.
O complexo MICOS na membrana interna mitocondrial é provavelmente o mais bem caracterizado e o mais versátil complexo formador de sítios de contato. O MICOS foi descrito em levedura em 2011 e consiste de seis subunidades 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 e Mic10. Estes formam um complexo de aproximadamente 1,5 MDa que se localiza nas junções cristais 9,10,11. A deleção de qualquer uma das subunidades principais, Mic10 ou Mic60, leva à ausência desse complexo 9,11, o que significa que essas duas subunidades são essenciais para a estabilidade da MICOS. Curiosamente, o MICOS forma não apenas um, mas múltiplos sítios de contato com várias proteínas e complexos da membrana externa mitocondrial: o complexo TOM 11,12, o complexo TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, o complexo Fzo1-Ugo19, Por1 10, OM45 10 e Miro 17. Isso indica fortemente que o complexo MICOS está envolvido em vários processos mitocondriais, como a importação de proteínas, o metabolismo de fosfolipídios e a geração da ultraestrutura mitocondrial18. Esta última função é provavelmente a principal função da MICOS, pois a ausência do complexo MICOS induzida pela deleção da CIM10 ou CIM60 leva a uma ultraestrutura mitocondrial anormal que praticamente carece completamente de cristas regulares. Em vez disso, as vesículas da membrana interna sem conexão com a membrana de contorno interno se acumulam19,20. É importante ressaltar que o MICOS é conservado em forma e função desde a levedura até o ser humano21. A associação de mutações nas subunidades do MICOS com doenças humanas graves também enfatiza sua importância para eucariotossuperiores22,23. Embora o MICOS seja altamente versátil, sites de contato adicionais devem existir (com base em nossas observações não publicadas). De fato, vários outros sítios de contato foram identificados, por exemplo, as máquinas de fusão mitocondrial Mgm1-Ugo1/Fzo124,25,26 ou Mdm31-Por1, que está envolvida na biossíntese da cardiolipina fosfolipídea mitocondrial específica27. Recentemente, aprimoramos o método que nos levou à identificação do MICOS para identificar Cqd1 como parte de um novo sítio de contato formado com o complexo de membrana externa Por1-Om1428. Curiosamente, esse sítio de contato também parece estar envolvido em múltiplos processos, como a homeostase da membrana mitocondrial, o metabolismo de fosfolipídios e a distribuição da coenzima Q28,29.
Aqui, utilizamos uma variação do fracionamento mitocondrial descrito anteriormente9,30,31,32,33. O tratamento osmótico das mitocôndrias leva à ruptura da membrana externa mitocondrial e a um encolhimento do espaço matricial, deixando as duas membranas apenas próximas nos locais de contato. Isso permite a geração de vesículas que consistem exclusivamente de membrana externa mitocondrial ou membrana interna mitocondrial ou em locais de contato de ambas as membranas através de sonicação leve. Devido à membrana interna mitocondrial possuir uma relação proteína-lipídio muito maior, as vesículas da membrana interna mitocondrial exibem uma densidade maior em comparação com as vesículas da membrana externa mitocondrial. A diferença de densidade pode ser usada para separar as vesículas da membrana através da centrifugação por gradiente de densidade flutuante de sacarose. Assim, as vesículas da membrana externa mitocondrial acumulam-se em baixas concentrações de sacarose, enquanto as vesículas da membrana interna mitocondrial são enriquecidas em altas concentrações de sacarose. As vesículas contendo sítios de contato concentram-se em concentrações intermediárias de sacarose (Figura 2). O protocolo a seguir descreve detalhadamente esse método aprimorado, que requer menos equipamentos, tempo e energia especializados em comparação com o nosso método previamente estabelecido32, e fornece uma ferramenta útil para a identificação de possíveis proteínas do sítio de contato.

<table><tbody><tr><td>13,2 mL, tubo ultratransparente de parede fina de topo aberto, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Instruments, Alemanha</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>50 mL, tubo de topo aberto de policarbonato de parede grossa, 29 x 104 mm</td><td>Beckman Instruments, Alemanha</td><td>363647</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ângulo fixo A-25.50 - Alumínio, 8 x 50 mL, 25.000 rpm, 75.600 x g</td><td>Beckman Instruments, Alemanha</td><td>363055</td><td></td></tr><tr><td>Refratômetro Abbe</td><td>Zeiss, Alemanha</td><td></td><td>descontinuado, qualquer refratômetro Abbe pode ser usado</td></tr><tr><td>accu-jet pro Pipet Controller</td><td>Brandtech, USA</td><td>BR26320</td><td>descontinuado, qualquer controlador de pipeta será suficiente</td></tr><tr><td>Beaker 1000 mL</td><td>DWK Life Science, Alemanha</td><td>C118.1</td><td></td></tr><tr><td>Branson&nbsp; Sonificador digital W-250 D</td><td>Branson Ultrasonics, EUA</td><td>FIS15-338-125</td><td></td></tr><tr><td>Branson Ultrassom 3mm Tapered MICROTIP</td><td>Branson Ultrasonics, EUA</td><td>101-148-062</td><td></td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics Sonifiers de 200 e 400 watts: Célula de resfriamento de roseta</td><td>Branson Ultrasonics, EUA</td><td>15-338-70</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Avanti JXN-26</td><td>Beckman Instruments, Alemanha</td><td>B37912</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Optima XPN-100 ultra</td><td>Beckman Instruments, Alemanha</td><td>8043-30-0031</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail</td><td>Roche, Suíça</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbit</td><td>Roth, Alemanha</td><td>6213</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (sal dissódico de ácido etilenodilamina-tetracético di-hidratado)</td> <td>Roth, Alemanha</td><td>8043</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer frasco, 100 mL</td><td>Roth, Alemanha</td><td>Pipeta graduada X747.1</td><td></td></tr><tr><td>, Kl. B, 25:0, 0.1</td><td>Hirschmann, Alemanha</td><td>Pipeta graduada 1180170</td><td></td></tr><tr><td>, Kl. B, 5:0, 0.05</td><td>Hirschmann, Alemanha</td><td>1180153</td><td></td></tr><tr><td>banho de gelo</td><td>neoLab, Alemanha</td><td>&nbsp; S12651</td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético RCT basic</td><td>IKA-Werke GmbH, Alemanha</td><td>Z645060GB-1EA</td><td></td></tr><tr><td>MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico)</td><td>Gerbu, Alemanha</td><td>1081</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P1000</td><td>Gilson, EUA</td><td>FP10006S</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P20</td><td>Gilson, EUA</td><td>FP10003S</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P200</td><td>Gilson, EUA</td><td></td><td></td>FP10005S</tr><tr><td>Omnifix 1 mL</td><td>Braun, Alemanha</td><td>4022495251879</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF)</td><td>Serva, Alemanha</td><td>32395.03</td><td></td></tr><tr><td>Cânula STERICAN 21 Gx4 4/5 0,8x120 mm</td><td>Braun, Alemanha</td><td>4022495052414</td><td></td></tr><tr><td>barra de agitação, 15 mm</td><td>VWR, EUA</td><td>442-0366</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Merck, Alemanha</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Rotor de balde oscilante</td><td>Beckman Instruments, Alemanha</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensaio</td><td>Eppendorf, Alemanha</td><td>3810X</td><td></td></tr><tr><td>Trituradores de tecidos, tipo Potter-Elvehjem, recipiente de vidro de 2 mL</td><td>VWR, EUA</td><td>432-0200</td><td></td></tr><tr><td>Trituradores de tecidos, tipo Potter-Elvehjem, êmbolo de 2 mL com ponta serrilhada</td><td>VWR, EUA</td><td>432-0212</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tricloroacético ( TCA)</td><td>Sigma Aldrich, Alemanha</td><td>33731</td><td>descontinuado, qualquer TCA será suficiente (CAS: 73-03-9)</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, Alemanha</td><td>4855</td><td></td></tr></tbody></table>

um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

As mitocôndrias estão presentes em praticamente todas as células eucarióticas e desempenham funções essenciais que vão muito além da produção de energia, por exemplo, a síntese de clusters ferro-enxofre, lipídios ou proteínas, tamponamento de Ca2+ e a indução de apoptose. Da mesma forma, a disfunção mitocondrial resulta em doenças humanas graves, como câncer, diabetes e neurodegeneração. Para desempenhar essas funções, as mitocôndrias têm que se comunicar com o resto da célula através de seu envelope, que consiste em duas membranas. Portanto, essas duas membranas têm que interagir constantemente. Os sítios de contato proteico entre as membranas interna e externa mitocondrial são essenciais nesse sentido. Até o momento, vários locais de contato foram identificados. No método aqui descrito, mitocôndrias de Saccharomyces cerevisiae são usadas para isolar sítios de contato e, assim, identificar candidatos que se qualificam para proteínas de sítio de contato. Usamos este método para identificar o sítio de contato mitocondrial e o complexo do sistema organizador de cristas (MICOS), um dos principais complexos formadores de sítios de contato na membrana interna mitocondrial, que é conservado de leveduras para humanos. Recentemente, aprimoramos ainda mais este método para identificar um novo sítio de contato consistindo de Cqd1 e o complexo Por1-Om14.

É relativamente fácil separar as membranas internas e externas mitocondriais. No entanto, a geração e separação de vesículas contendo o local de contato são muito mais difíceis. Em nossa opinião, duas etapas são críticas e essenciais: as condições de sonicação e o gradiente utilizado.
Normalmente, acredita-se que os gradientes lineares tenham uma resolução melhor em comparação com os gradientes de passos. No entanto, sua produção reprodutível é tediosa e requer equipamentos especiais. Portanto...

Os sítios de contato mitocondrial são complexos proteicos que interagem com proteínas da membrana interna e externa mitocondriais. Esses sítios são essenciais para a comunicação entre as membranas mitocondriais e, portanto, entre o citosol e a matriz mitocondrial. Aqui, descrevemos um método para identificar candidatos que se qualificam para esta classe específica de proteínas.

Um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Nosso objetivo é entender a função molecular dos sítios de contato mitocondriais, permitindo a comunicação entre as duas membranas mitocondriais. Isso realmente é um pré-requisito para compreender a função para a biogênese mitocondrial e, portanto, a viabilidade celular. Descobrimos um novo sítio de contato entre a membrana interna e externa mitocondrial criado por Cqd1 e Om14-Por1.Nossos dados sugerem que este local pode auxiliar na importação de lipídios como o ácido fosfatídico. Com base na identificação do complexo MICOS, contribuímos para uma compreensão mais profunda de como a arquitetura da membrana mitocondrial é gerada. Isso nos permitiu desenvolver um modelo de trabalho que explica como as duas formas de cristas mitocondriais, cristas lamelares e tubulares são formadas.Nossa pesquisa foi feita em levedura no passado. No entanto, estamos convencidos de que a formação da arquitetura mitocondrial correta é importante também para eucariotos superiores. Portanto, o próximo passo em nossa pesquisa é analisar o papel dos elementos da arquitetura mitocondrial em modelos mais complexos, como os neurônios primários.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um método para o isolamento rápido de mitocôndrias a partir de biópsias de tecidos de mamíferos é descrito. Preparações de fígado de rato ou de músculo esquelético foram homogeneizados com um Dissociator tecido comercial e mitocôndrias foram isoladas por meio de filtração através de filtros de diferencial de malha de nylon. Tempo de isolamento mitocondrial é &lt;30 min, em comparação com 60 - 100 min utilizando métodos alternativos.

Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial

Aqui descrito é um método para detectar e quantificar as proteínas da membrana exterior mitocondrial por imunomarcação das mitocôndrias isoladas a partir de tecidos de roedores e de análise por citometria de fluxo. Este método pode ser estendido para avaliar os aspectos funcionais de subpopulações mitocondriais.

Imunodetecção de membrana externa proteínas por citometria de fluxo de mitocôndrias isoladas

A comparação do potencial da membrana mitocondrial entre as amostras produz informações valiosas sobre o status celular. São descritas etapas detalhadas para isolar mitocôndrias e avaliar a resposta a inibidores e desacopladores usando fluorescência. O método e a utilidade deste protocolo são ilustrados pelo uso de uma cultura de células e modelo animal de estresse celular.

Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Métodos para biópsia de vasto lateral, a preparação de mitocôndrias purificada e profiling respirométrico são descritos. O uso de volume muscular pequeno torna esta técnica adequada para aplicações de pesquisa clínica.

Preparação e Avaliação respirométrico de mitocôndrias isoladas de tecido muscular esquelético Obtido por meio de agulha de biópsia percutânea

Aqui, apresentamos uma modificação de um método relatado anteriormente que permite o isolamento de mitocôndrias purificadas e de alta qualidade de quantidades menores de músculo esquelético de camundongo. Este procedimento resulta em mitocôndrias altamente acopladas que respiram com alta função durante ensaios respiratórios baseados em microplacas.

Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias

Como as mitocôndrias são apenas uma pequena percentagem da célula vegetal, eles precisam ser purificado para uma gama de estudos. Mitocôndrias podem ser isoladas em uma variedade de órgãos da planta por homogeneização, seguida de centrifugação gradiente diferencial e densidade para obter uma fração mitocondrial altamente purificada.

Isolamento e medições respiratória de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana

Aqui apresentamos um protocolo para extrair, resolver e identificar supercomplexos mitocondrial que minimiza a exposição a detergentes e Coomassie Blue. Este protocolo oferece um equilíbrio ideal entre a resolução e a preservação das atividades enzimáticas, minimizando o risco de perda de interações proteína-proteína lábil.

Eletroforese nativa clara/azul híbrida para a separação e análise de supercomplexos de cadeia respiratória mitocondrial

Apresentamos um protocolo em duas etapas para isolamento de mitocôndrias de alta qualidade que é compatível com a descoberta e quantificação de proteínas em escala de proteoma. Nosso protocolo não requer engenharia genética e, portanto, é adequado para estudar mitocôndrias de quaisquer células e tecidos primários.

Isolamento sem etiquetas em duas etapas de mitocôndrias para melhor descoberta e quantificação de proteínas

Este protocolo descreve uma técnica para a análise de supercomplexos respiratórios quando apenas pequenas quantidades de amostras estão disponíveis.

Isolamento de mitocôndrias para análise de supercomplexos mitocondriais a partir de pequenas amostras de cultura de tecidos e células 

Estudos bioenergéticos e metabolômicos sobre mitocôndrias revelaram seu papel multifacetado em muitas doenças, mas os métodos de isolamento para essas organelas variam. O método detalhado aqui é capaz de purificar mitocôndrias de alta qualidade de várias fontes de tecido. A qualidade é determinada pelas taxas de controle respiratório e outras métricas avaliadas com respirometria de alta resolução.

Isolamento mitocondrial robusto de tecido cardíaco de roedores 

Aprenda um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial em levedura, explorando o papel do CQD1 na importação de lipídios e na formação de cristas mitocondriais. Esta técnica avança o conhecimento em biologia celular.

Um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial

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