Name: Transplante transpupilar-guiado trans-escleral de enxertos sub-retinianos em modelo de camundongo com degeneração retiniana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T12:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprenda o transplante sub-retiniano guiado por transplupilar em camundongos com degeneração retiniana. Este método minimiza complicações cirúrgicas e facilita a entrega precisa de enxertos celulares para pesquisa em oftalmologia.

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Este trabalho foi financiado pelos seguintes financiamentos: NEI R01EY033103 (MSS), Foundation Fighting Blindness (MSS), Shulsky Foundation (MSS), Joseph Albert Hekimian Fund (MSS), Juliette RP Vision Foundation (YVL), Research to Prevent Blindness (concessão irrestrita ao Wilmer Eye Institute da Johns Hopkins University e ao Cullen Eye Institute da Baylor College of Medicine). Agradecemos à Dra. Malia Edwards (Johns Hopkins University School of Medicine) por gentilmente fornecer treinamento sobre o microscópio.

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 8023, revisado em 1978) e a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e da Visão. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Johns Hopkins (aprovação M021M459).
1. Animais
<ol><li>Use camundongos Rho::EGFP (P3-P6 envelhecido) como doadores de suspensões de células da retina. NOTA: Esta cepa foi um presente gentil do Dr. T. Wensel, Baylor College of Medicine.</li>
	<li>Utilizar camundongos OPN1LW-EGFP/NRL-/- 14 (idade P3) como doadores de lençóis de retina.</li>
	<li>Use camundongos adultos com degeneração retiniana Rd1/NS com imunodeficiência (ambos os sexos) como receptores.</li>
	<li>Aloja todos os ratos em gaiolas sob um ciclo claro-escuro de 12:12 h com acesso a água e comida, conforme necessário.</li>
</ol>2. Coletar retina neural (Figura 1)
OBS: Todas as etapas a seguir foram realizadas em condições estéreis. As informações dos fornecedores das ferramentas e produtos de pesquisa são fornecidas na Tabela de Materiais.
<ol><li>Preparação de camundongos doadores: Eutanasie camundongos doadores com overdose de dióxido de carbono e confirme a eutanásia com luxação cervical.</li>
	<li>Isolar globos oculares de camundongos. Para fazer isso, siga as etapas abaixo.<ol><li>Abra cuidadosamente as pálpebras dos filhotes usando micro tesouras para expor o globo ocular.</li>
		<li>Use pinças lisas para agarrar o nervo óptico e puxar o globo ocular com um par de pinças.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolar a retina neural NOTA: Esta etapa é realizada sob um microscópio de dissecção.<ol><li>Incise um orifício no centro da córnea usando uma agulha estéril de 25 G.</li>
		<li>Corte a córnea, através do orifício, ao meio e aumente a incisão para a esclera e PSE, em seguida, remova a esclera e PSE.</li>
		<li>Use pinças microdentadas para remover suavemente o cristalino e o vítreo para isolar a retina neural.</li>
		<li>Prossiga com a secção 3 para preparar a suspensão retiniana do dador ou com a secção 4 para preparar a folha retiniana do dador, conforme necessário.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparar a suspensão retiniana do doador (Figura 1)
<ol><li>Incubar a retina neural em solução de papaína a 37 °C durante 20-30 min até que não sejam detectados aglomerados celulares. NOTA: Pipetar suavemente a mistura celular 15x a cada 10 min.</li>
	<li>Siga as instruções do fabricante do Kit de Dissociação de Papaína para coletar células individuais.</li>
</ol>4. Preparar lençóis de retina do doador (Figura 1)
NOTA: Este passo segue a secção 2 e é realizado sob um microscópio de dissecção.
<ol><li>Coloque o copo de retina neural isolado em uma placa de Petri de 35 mm com PBS estéril pré-resfriado.</li>
	<li>Use micro tesoura para cortar o copo da retina neural em várias folhas da retina (cerca de 1 mm x 2 mm).</li>
</ol>5. Prepare ratos receptores
<ol><li>Anestesiar camundongos receptores com injeção intraperitoneal de cetamina (100 mg/kg de peso corporal) e cloridrato de xilazina (20 mg/kg de peso corporal).</li>
	<li>Confirme o plano cirúrgico da anestesia, garantindo a perda de reflexos de piscar e dor, respiração regular e respiração.</li>
	<li>Avaliar a profundidade anestésica pela ausência de resposta à pinça caudal ou retirada dos reflexos pediosos.</li>
	<li>Sempre verifique novamente a profundidade anestésica durante o procedimento operatório e ajuste a profundidade anestésica se o animal for responsivo à dor. Mantenha os ratos na mesa de cirurgia pré-aquecida para evitar hipotermia.</li>
	<li>Dilatar as pupilas receptoras com colírio de tropicamida a 1% (m/vol) 5 minutos antes da cirurgia. Uma pupila bem dilatada pode facilitar a visualização transpupilar ao microscópio cirúrgico.</li>
	<li>Desinfetar o olho do rato em operação e os tecidos oculares circundantes com iodopovidona, lavar com PBS esterilizado.</li>
	<li>Aplicar cloridrato de proparacaína a 0,5% no olho do rato para analgesia.</li>
</ol>6. Transplante sub-retiniano de enxertos de retina (Figura 2)
NOTA: Todas as etapas a seguir foram realizadas em condições assépticas. Os instrumentos cirúrgicos foram autoclavados (utilizar bandejas de instrumentos para proteger as pontas das ferramentas e retirar o êmbolo das microseringas para evitar que ficassem presas no lúmen). As informações dos fornecedores das ferramentas e produtos de pesquisa são fornecidas na Tabela de Materiais.
<ol><li>Paracentese da câmara anterior: Penetrar a córnea periférica na câmara anterior com uma agulha de insulina para permitir que o humor aquoso egresse passivamente, para evitar os picos de pressão intraocular (PIO) durante o transplante. NOTA: Uma paracentese bem sucedida é indicada pelo efluxo de humor aquoso através do orifício da córnea.</li>
	<li>Colocar uma gota de hialuronato de sódio e uma lamínula de vidro (5 mm de diâmetro) sobre a córnea para permitir a visualização transpupilar do fundo de olho sob o escopo cirúrgico.</li>
	<li>Use pinças dentadas para expor o locus de injeção (1 mm pós-limbo corneano) pressionando a parede superior ou inferior do olho, conforme exigido pelo experimento, em direção ao centro da visão transpupilar.</li>
	<li>Use uma agulha de microinjeção para penetrar perpendicularmente na esclera.</li>
	<li>Gire cuidadosamente a direção da agulha tangencialmente para permitir a penetração completa do complexo esclera-coróide-EPR no espaço sub-retiniano.</li>
	<li>Insira a agulha tangencialmente para acessar o local de injeção terminal. OBS: Verificar o posicionamento completo do bisel da agulha por orientação de visão transpupilar. Use os vasos superficiais da retina como referência anatômica para o posicionamento preciso da agulha dentro do espaço sub-retiniano.</li>
	<li>Injetar enxertos de retina NOTA: A presença de pequenas bolhas pré-carregadas na seringa pode facilitar a validação do posicionamento sub-retiniano preciso das células doadoras. A PIO elevada resultante da injeção sub-retiniana aumenta o risco de refluxo de células do doador.<ol><li>Se a córnea ficar turva24,25, um indicador de PIO elevada, mantenha a agulha no espaço sub-retiniano por pelo menos 3 min até que a córnea desapareça, um indicador de que a PIO reduziu o suficiente. NOTA: Em casos raros, a PIO pode levar mais tempo para normalizar, e recomenda-se manter a agulha no lugar até que a clareza da córnea seja restaurada, mesmo que isso leve 8-10 min. Observe sob um microscópio cirúrgico para evitar danos às estruturas da retina.</li>
	</ol></li>
	<li>Segure a borda do orifício de injeção com pinças microdentadas e retire rapidamente a agulha. NOTA: Os critérios para a entrega sub-retiniana bem-sucedida de uma suspensão e folha de células da retina são uma mancha constante e uma folha branca visível no espaço sub-retiniano, respectivamente.</li>
	<li>Limpe a área cirúrgica do olho com lágrimas artificiais e aplique pomada, se necessário.</li>
	<li>Administração pós-cirúrgica<ol><li>Coloque os ratos transplantados numa gaiola de recuperação limpa pré-aquecida (37 °C) e monitorize cuidadosamente a existência de angústia.</li>
		<li>Aplique uma gota de Cloridrato de Proparacaína tópico a 0,5% no olho cirúrgico 2-3 vezes se ocorrer angústia.</li>
		<li>Volte os ratos para a gaiola de casa depois que os ratos estiverem completamente alertas e móveis. Coloque um pequeno número de pellets de comida e um copo de gel na gaiola se os ratos tiverem problemas para alcançar o funil de alimentos. NOTA: Mantenha a superfície ocular úmida até que a anestesia acabe para evitar a formação de catarata.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Oftalmoscopia confocal multimodal de varredura a laser (cSLO)
<ol><li>Dois meses após o transplante, anestesiar camundongos receptores Rd1/NS (n=5) por injeção intraperitoneal de cetamina (100 mg/kg de peso corporal) e cloridrato de xilazina (20 mg/kg de peso corporal) para exames de imagem.</li>
	<li>Dilatar as pupilas com colírio de tropicamida a 1% (m/vol).</li>
	<li>Realizar imagens multimodais padrão de 55° usando o sistema cSLO do oftalmoscópio a laser de varredura confocal22.</li>
	<li>Obtenha imagens MR e SD-OCT usando 30 quadros de média ART.</li>
</ol>8. Coloração histológica
<ol><li>Preparar lâminas congeladas de olhos de camundongos Rd1/NS transplantados conforme relatado anteriormente 14.</li>
	<li>Bloquear e penetrar nas lâminas congeladas de retinas transplantadas usando uma mistura de 5% de soro de cabra e 1% de Triton X100 em PBS.</li>
	<li>Incubar amostras com anticorpos primários durante a noite a 4 °C e enxaguar em PBS (5 min, 3x). Os anticorpos primários incluem anti-GFP-FITC de cabra (1:200), anti-recuperação de coelho (1:1000) e anti-S-opsina de coelho (1:500).</li>
	<li>Incubar as amostras com anticorpo secundário (cabra anticoelho Cy3, 1:500) e contracorar com DAPI. NOTA: Os fornecedores de anticorpos primários e secundários estão listados na Tabela de Materiais.</li>
</ol>

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</ol>

A MSS é/foi consultora remunerada da Revision Therapeutics, Johnson & Johnson, Third Rock Ventures, Bayer Healthcare, Novartis Pharmaceuticals, W. L. Gore & Associates, Deerfield, Trinity Partners, Kala Pharmaceuticals e Acucela. A MSS recebe apoio de pesquisa patrocinado da Bayer. Esses acordos foram revisados e aprovados pela Universidade Johns Hopkins de acordo com suas políticas de conflito de interesses. A KVL é nomeada como inventora em pedidos de patente na Universidade do Colorado. MSS e YVL são nomeados como inventores em pedidos de patente na Universidade Johns Hopkins.

O transplante sub-retiniano em camundongos é tecnicamente desafiador devido ao pequeno tamanho dos olhos de camundongos. Neste estudo, desenvolvemos uma plataforma simples e reprodutível para transplante sub-retiniano em receptores de camundongos. A plataforma permite consistência na proteção da viabilidade do doador, entrega sub-retiniana bem-sucedida e garante uma baixa taxa de complicações.
A técnica de transplante sub-retiniano aqui descrita foi desenvolvida com base na via transescleral, onde a agulha de injeção penetra nas camadas externas (esclera-coróide-complexo EPR) da parede ocular. Comparada à abordagem transcórnea19,20 e transvítrea21,26,27, a abordagem transescleral entra diretamente no espaço sub-retiniano, sem penetrar nas estruturas do segmento anterior e na retina neural, possibilitando um transplante inócuo e reduzindo o risco de refluxo de células doadoras pelo orifício penetrante. Um desafio da abordagem transescleral é garantir que a ponta da agulha se propague ao longo do espaço sub-retiniano antes de chegar ao local terminal de entrega, evitando possíveis distúrbios das camadas adjacentes de EPR e coroide. É desafiador atingir esses objetivos por meio de uma abordagem transescleral tradicional28,29 sem orientação visual direta. Neste estudo, desenvolvemos uma plataforma guiada por visão transpupilar usando um microscópio cirúrgico e iluminação externa da retina para facilitar o transplante sub-retiniano em modelos de camundongos. A plataforma permite que o operador acompanhe o processo cirúrgico e a condição retiniana dos receptores, fornecendo visualização em tempo real do fundo do receptor sob o microscópio cirúrgico. Por exemplo, a penetração bem-sucedida do complexo esclera-coróide-EPR pode ser simplesmente validada por uma reflectância relativamente brilhante da ponta da agulha via visualização transpupilar. É importante ressaltar que, quando guiado pela visualização transpupilar, o operador pode modular com precisão o ângulo e a profundidade da injeção de acordo com a posição relativa entre a agulha e as estruturas anatômicas na retina receptora (por exemplo, vasos da retina e cabeça do nervo óptico). Além disso, a administração precisa de materiais usando essa técnica pode minimizar a PSE, trauma de coroide e outras complicações cirúrgicas. De fato, descobrimos que as hemorragias podem ser minimizadas evitando-se manobras próximas aos vasos sanguíneos da retina com a ajuda da visualização transpupilar.
O refluxo de células doadoras é uma das principais causas de falha cirúrgica pós-injeção29,30. Múltiplos são os fatores envolvidos na promoção do refluxo celular do doador. A alta pressão intraocular (PIO) dos olhos receptores causada pelas misturas de células doadoras injetadas é um fator importante que promove o refluxo de células para fora do olho. Nosso protocolo reduz a PIO dos receptores pela penetração da câmara anterior no início da cirurgia e permite que a PIO abaixe espontaneamente por meio de saída aquosa de líquido antes de retirar a agulha vítrea da cavidade vítrea. Um segundo fator é o túnel de injeção não selado nos olhos dos receptores. Para evitar o refluxo do enxerto de volta através do túnel de injeção, usamos uma agulha de microinjeção de tamanho pequeno (34G) para criar um túnel auto-selante ao penetrar na parede do olho e micropinças dentadas para segurar as bordas da abertura externa do túnel ao puxar a agulha. No transplante convencional, os enxertos refluídos são dificilmente detectados, pois podem ocorrer rapidamente ou dissipar-se rapidamente. O hialuronato de sódio, após a aplicação da lamínula, quase invariavelmente desliza para fora da córnea para cobrir a maior parte do limbo e esclera, incluindo o local da esclerotomia. Após a injeção celular, o hialuronato de sódio no local da esclerotomia pode ajudar a retardar o fluxo volumoso de conteúdo refluído, se houver, e ajudar a torná-los visualmente detectáveis sob o microscópio cirúrgico. Além disso, a ausência de refluxo também pode ser verificada traçando a constância do bleb sub-retiniano para suspensões celulares e a localização intraocular da lâmina retiniana usando nosso protocolo, o que poderia ser útil para laboratórios onde a tomografia de coerência óptica (OCT) não está disponível.
Embora um número substancial de células fotorreceptoras tenha sobrevivido nas folhas retinianas transplantadas, nenhuma orientação celular discernível, ou orientação da folha, pôde ser detectada. Embora a liberação de lâminas retinianas 3D para animais de grande porte tenha sido estabelecida 26,31,32, o espaço sub-retiniano em camundongos, juntamente com a falta de capacidade de imagem retiniana intraoperatória, torna muito desafiador garantir a manutenção da orientação do lençol no intraoperatório, bem como no período pós-operatório imediato, durante o qual as células ou lâminas transplantadas podem se tornar instáveis à medida que o camundongo recupera a deambulação.
Descrevemos uma plataforma cirúrgica transescleral com orientação direta da visão transpupilar para o transplante sub-retiniano em receptores de camundongos. Esta plataforma permite alta precisão de injeção e baixo índice de complicações cirúrgicas. Esta plataforma permite a entrega precisa de doses conhecidas de células, é relativamente fácil de aprender e facilita a entrega sub-retiniana, além de injeções intra-retinianas ou intravítreas para diferentes tipos de agentes terapêuticos, incluindo terapia gênica.

O transplante de células fotorreceptoras e epiteliais pigmentadas da retina (EPR) fornece terapia potencial para doenças degenerativas da retina, como degeneração macular relacionada à idade (DMRI), doença de Stargardt e retinose pigmentar (RP)1,2,3,4,5,6,7 . Para repor ou substituir os fotorreceptores doentes e as células do EPR nas retinas degeneradas, o espaço sub-retiniano é particularmente adequado como alvo de transplante, dada a anatomia laminar dos fotorreceptores do hospedeiro e das células do EPR. Embora os procedimentos cirúrgicos de transplante sub-retiniano de células do EPR estejam bem estabelecidos em animais de grandeporte8,9,10 e em ensaios clínicos11,12,13, os desafios enfrentados pela pesquisa em transplante de fotorreceptores incluem a escassez de modelos transgênicos de grandes animais e a compreensão limitada dos mecanismos de sinaptogênese em profundidade envolvidos no transplante neuronal, entre outras preocupações. Modelos murinos geneticamente modificados, com vários tipos de mutantes de degeneração retiniana, fornecem ferramentas úteis para estudar mecanismos moleculares no contexto do transplante e orientar o desenvolvimento de terapias eficazes de substituição celular na fase pré-clínica 14,15,16,17,18.
Ao contrário do olho relativamente grande e do cristalino pequeno em animais grandes (por exemplo, porco, macaco), o pequeno tamanho e o grande cristalino dos olhos de camundongo os tornam alvos cirúrgicos difíceis, especialmente para transplante sub-retiniano, no qual restrições de espaço físico e visualização direta limitada são os principais desafios.
As abordagens atuais podem ser classificadas em três tipos principais com base na via de injeção. Primeiro, no caso da abordagem transcórnea, a agulha é passada através da córnea para a cavidade vítrea e, em seguida, para o espaço sub-retiniano19,20. A entrega sub-retiniana bem-sucedida pode ser alcançada usando este método, mas o dano às estruturas do segmento anterior (ou seja, córnea, íris, lente) é um grande risco que pode impedir severamente a análise in vivo a jusante. Em segundo lugar, no caso da abordagem transvítrea, a agulha entra na cavidade vítrea através da pars plana e, em seguida, no espaço sub-retiniano21. Esta abordagem é amplamente utilizada em humanos e animais de grande porte. No entanto, há um risco potencial de danos ao cristalino em roedores, pois o cristalino ocupa um volume relativo maior da cavidade vítrea. Notavelmente, tanto os protocolos transcórneo quanto transvítreo requerem a penetração da retina neural para chegar ao espaço sub-retiniano, o que causa danos à retina do hospedeiro e aumenta o risco de refluxo de células doadoras através do orifício de penetração. Terceiro, no caso da abordagem transescleral22,23, a agulha penetra através do complexo escleral-coróide-EPR e entra diretamente no espaço sub-retiniano. Essa abordagem reduz o potencial de trauma das estruturas do segmento anterior e da cavidade vítrea. No entanto, sem a visualização direta do fundo de olho, falhas cirúrgicas causadas por punções trans-retinianas, descolamento de EPR e hemorragia coroide são comumente detectadas.
Aqui, desenvolvemos uma plataforma cirúrgica transescleral com orientação direta da visão transpupilar para transplante sub-retiniano em receptores de camundongos. Validação da viabilidade de lâminas de retina de doadores e suspensões de células antes do transplante foi realizada. A liberação bem-sucedida das células doadoras no espaço sub-retiniano de um modelo de camundongo com degeneração da retina foi confirmada. Apenas complicações cirúrgicas raras foram detectadas. Além disso, fotorreceptores transplantados nos enxertos de retina sobreviveram e mostraram evidências de maturação avançada em bastonetes e cones "adultos" dois meses após o transplante.

<table><tbody><tr><td>Lágrimas artificiais</td><td>CareAll</td><td>P31447-04</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas (5mm de diâmetro)</td><td>Deckglaser</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-GFP (FITC)</td><td>Abcam</td><td>Ab6662</td><td></td></tr><tr><td>Goat-anti-rabbit Cy3&nbsp;</td>Seringa de insulina <td>Invitrogen</td><td>A10520</td><td></td></tr><tr><td>(30G)</td><td>Easy Touch</td><td>08496-3015-11</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>VETone Zetamine</td><td>AH2017J</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Viabilidade de Mortos Vivos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Micro scissor</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8503</td><td></td></tr><tr><td>Micro pinça lisa</td><td>ASICO</td><td>AE-4360</td><td></td></tr><tr><td>Pinça micro dentada</td><td>World Precision Instruments</td><td>555041FT</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de microinjeção (26G)</td><td>Hamilton</td><td>7804-03</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de microinjeção (34G)</td><td>Hamilton</td><td>207434</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de microinjeção</td><td>Hamilton</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dissociação de papaína</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (35 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB012920</td><td></td></tr><tr><td>Povidona-iodo (10%)</td><td>Solução Betadine</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Proparacaína (0,5%)</td><td>Keeler</td><td>AX0500</td><td></td></tr><tr><td>Coelho anti-recuperaina</td><td>Millipore</td><td>Ab5585</td><td></td></tr><tr><td>Coelho anti-S-opsina</td><td>Millipore</td><td>Ab5407</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronato de sódio</td><td>Johnson & Visão Johnson&nbsp;</td><td>10-2400-11</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes estéreis</td><td>Puritan</td><td>25-806 2PC</td><td></td></tr><tr><td>Agulha estéril (25G)</td><td>BD Agulha PrecisionGlide</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Cortinas de toalha estéreis</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td></td></tr><tr><td>Materiais/reagentes</td><td></td><td></td><td></td>cirúrgicos</tr><tr><td>Solução oftálmica tropicamida</td><td>Henry Schein</td><td>112-7192</td><td></td></tr><tr><td>Injeção de xilazina</td><td>anaSed</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

transplante transpupilar-guiado trans-escleral de enxertos sub-retinianos em modelo de camundongo com degeneração retiniana

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

O transplante de células fotorreceptoras e células epiteliais pigmentares da retina (EPR) fornece uma terapia potencial para doenças degenerativas da retina. O transplante sub-retiniano de células de doadores terapêuticos em receptores de camundongos é um desafio devido ao espaço cirúrgico limitado permitido pelo pequeno volume do olho de camundongo. Desenvolvemos uma plataforma de transplante cirúrgico transescleral com orientação direta da visão transpupilar para facilitar a liberação sub-retiniana de células exógenas em receptores de camundongos. A plataforma foi testada usando suspensões de células retinianas e folhas tridimensionais da retina coletadas de camundongos Rho:: EGFP ricos em bastonetes e OPN1LW-EGFP ricos em cones; Camundongos NRL-/- , respectivamente. O ensaio de vivos/mortos mostrou baixa mortalidade celular para ambas as formas de células doadoras. Enxertos de retina foram entregues com sucesso no espaço sub-retiniano de um modelo de camundongo de degeneração retiniana, Rd1/NS, com complicações cirúrgicas mínimas detectadas por imagens multimodais de varredura confocal a laser (cSLO). Dois meses após o transplante, a coloração histológica demonstrou evidência de maturação avançada dos enxertos de retina em bastonetes e cones "adultos" (pela expressão robusta de Rho::EGFP, S-opsina e OPN1LW:EGFP, respectivamente) no espaço sub-retiniano. Aqui, fornecemos uma plataforma cirúrgica que pode permitir uma entrega sub-retiniana altamente precisa com uma baixa taxa de complicações em receptores de camundongos. Esta técnica oferece precisão e relativa facilidade de aquisição de habilidades. Além disso, a técnica poderia ser usada não apenas para estudos de transplante de células sub-retinianas, mas também para outros estudos terapêuticos intraoculares, incluindo terapias gênicas.

Os enxertos de retina são administrados com sucesso no espaço sub-retiniano e sobrevivem in vivo. O desempenho de nossa plataforma de transplante sub-retiniano foi avaliado em camundongos receptores de Rd1/NS com idade entre 6-8 semanas, quando suas retinas residuais foram severamente afinadas devido à degeneração quase completa da camada nuclear externa (ONL). Dada a fragilidade da retina, a escassez de fotorreceptores cônicos e a viabilidade relativamente pobre das células em suspensão em comparação com os doadores de folhas, camundongos ricos em cone (OPN1LW-EGFP; NRL-/-)14 foram utilizados como fontes de folhas de retina de doadores e camundongos ricos em bastonetes (Rho::EGFP) como doadores para suspensões celulares. Folhas retinianas ricas em cones e suspensões de células ricas em bastonetes foram administradas com sucesso no espaço sub-retiniano de todos os camundongos receptores usando nossa plataforma cirúrgica, como confirmado pelo bleb sub-retiniano e pelo lençol branco vistos usando visualização transpupilar imediatamente após a injeção. Dois meses após o transplante, imagens multimodais de cSLO foram realizadas para rastrear os estados dos enxertos de retina in vivo. A OCT transversal mostrou que os enxertos de retina sobreviveram no espaço sub-retiniano e reconstituíram a ONL em todos os camundongos receptores (Figura 3A). A imagem infravermelha não detectou catarata óbvia em todos os olhos transplantados (Figura 3B). Outras complicações cirúrgicas, incluindo hemorragia, foram raramente detectadas em retinas transplantadas (n = 1/10 olhos) por reflectância multicolorida dois meses após o transplante (Figura 3C). Realizamos coloração histológica para avaliar a sobrevida e a extensão da maturação dos fotorreceptores nos enxertos de retina. Fotorreceptores cônicos abundantes expressando OPN1LW:EGFP e S-opsin em folhas de retina transplantadas foram observados. Da mesma forma, as suspensões de células retinianas transplantadas mostraram uma grande proporção de fotorreceptores Rec+ in vivo, incluindo numerosos bastonetes Rho::EGFP+ (Figura 3D). Os camundongos controle não transplantados apresentaram degeneração severa da ONL com fotorreceptores residuais esparsos do cone (Rec+). Nenhum sinal de EGFP foi detectado na retina Rd1/NS não transplantada (Figura 3D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig01.jpg"> Figura 1: Esquema da coleta de folhas retinianas do doador e suspensões celulares. Esquemas mostrando as principais etapas da coleta de suspensões e folhas de células da retina de camundongos doadores Rho::EGFP . Imagens fluorescentes e de campo claro mostraram imagens representativas de células dissociadas e uma folha dissecada isolada de camundongos Rho::EGFP . Linha pontilhada amarela: margem incisional. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig02v3.jpg"> Figura 2: Procedimentos de transplante sub-retiniano de lâminas de retina e suspensão celular em camundongos Rd1/NS . (A) Imagens esquemáticas da preparação de camundongos receptores. (B) Principais procedimentos cirúrgicos e diagramas correspondentes mostrando o transplante sub-retiniano de suspensões e lençóis de células da retina. Os passos cirúrgicos incluem: 1. penetrar na câmara anterior; 2. soltar o hialuronato de sódio na córnea e, em seguida, montar a lamínula sobre o hialuronato de sódio para facilitar a visualização transpupilar; 3. penetrar nas camadas externas da parede do olho (complexo esclera-coróide-EPR). Os ângulos de penetração da agulha estão no painel superior direito da ilustração; 4. inserir agulha de injeção; 5. injetar enxertos. Imagens representativas mostram a entrega bem-sucedida de suspensões de células da retina e folha em dois receptores individuais, respectivamente. Asterisco: cabeça do nervo óptico; Cabeças de setas vermelhas: vaso sanguíneo da retina; Ponta de seta branca: ponta da agulha penetrada; Setas brancas: suspensões ou lençol retiniano enxertado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig03.jpg"> Figura 3: Liberação bem-sucedida de enxertos de retina no espaço sub-retiniano e sobrevida in vivo. (A) Imagens representativas de SD-OCT mostraram a distribuição sub-retiniana de folhas retinianas transplantadas e suspensões celulares em dois camundongos Rd1/NS individuais, respectivamente. Camundongos Rd1/NS não transplantados foram coletados como controle. A Região de Interesse (ROI) é indicada por caixas pontilhadas amarelas em imagens de fundo de olho infravermelho (IR). A retina interna é designada como lâminas da camada de células ganglionares da retina (CGR), camada plexiforme interna (LIP) e camada nuclear interna (LII). (B) Imagem infravermelha (IR) representativa de um camundongo Rd1/NS transplantado não mostrou catarata através da pupila dilatada. (C) Imagens representativas de reflectância multicolor (RM) de olhos Rd1/NS transplantados e não transplantados. Os olhos transplantados não apresentaram complicações cirúrgicas óbvias, incluindo hemorragia. (D) Coloração imunoistoquímica (IHQ) de camundongos Rd1/NS transplantados (folha e suspensão) e não transplantados (controle). Os dados mostraram numerosos fotorreceptores enxertados expressando marcadores específicos de fotorreceptores (Rec), bastonetes (Rho::EGFP), cones L/M (OPN1LW:EGFP) e cones-S (S-opsina) dois meses após o transplante. As lâminas retinianas receptoras foram identificadas pela coloração DAPI (azul). Os enxertos de retina foram identificados pelo repórter do EGFP (verde). A retina de camundongos não transplantados apresentou degeneração severa de ONL com fotorreceptores cônicos residuais esparsos (Rec+). Nenhum sinal de EGFP foi detectado em retinas Rd1/SN não transplantadas. Imagens ampliadas foram apresentadas nos dois painéis à direita. Abreviações: RGC: camada de células ganglionares da retina; INL: camada nuclear interna. ONL: camada nuclear externa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo apresenta uma abordagem trans-escleral guiada por visão transpupilar para entregar com segurança e precisão enxertos celulares sub-retinianos, com baixa taxa de complicações cirúrgicas, em receptores de camundongos com ou sem degeneração retiniana.

Transplante transpupilar-guiado trans-escleral de enxertos sub-retinianos em modelo de camundongo com degeneração retiniana

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...

O objetivo geral deste estudo é desenvolver uma plataforma de transplante transescleral com orientação transpupilar direta para facilitar a entrega sub-retiniana de células em receptores de camundongos. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o National Institute of Health Guide. Nossa declaração do uso de animais e aprovada pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Johns Hopkins.Adotando a idade de camundongos EGFP no dia pós-natal 3-6 foram usados como doadores de suspensões de células da retina. Camundongos OPN1LW-EGFP/NRL, com idade no 3º dia pós-natal, foram adotados como doadores de lençol de retina. Camundongos adultos com degeneração retiniana Rd1/NS com imunodeficiência foram usados como receptores.Eutanásia de camundongos doadores com overdose de dióxido de carbono. Para isolar os globos oculares dos camundongos, abra cuidadosamente as pálpebras dos filhotes usando uma microtesoura e exponha o globo ocular. Envolva o nervo óptico e puxe o globo ocular com pinça lisa.Uma vez que os globos oculares são isolados, incise um orifício no centro da córnea usando uma agulha de calibre 25. Corte a córnea ao meio através do buraco. E ampliar a incisão para a esclera e PSE.Em seguida, remova a esclera e a PSE. Em seguida, use pinças microdentadas para remover suavemente o cristalino e o vítreo para isolar a retina neural. Para coletar a suspensão da retina do doador, incubar a retina neural em solução de papaína a 37 centígrados por 20 a 30 minutos até que nenhum aglomerado celular seja detectável.Coletar as células individuais seguindo as instruções do fabricante do kit de papaína. Para preparar a folha de retina, coloque a retina isolada em uma placa de Petri com PBS. Em seguida, corte suavemente a retina neural em várias folhas de retina com uma micro tesoura.Anestesiar camundongos receptores com uma injeção intraperitoneal de quetamina e xilazina. Certifique-se de que o plano de anestesia alcançado seja o plano cirúrgico onde o animal perde reflexos de piscar e dor, mas a respiração e a respiração permanecem regulares. Avaliar a profundidade anestésica por meio da pinça da cauda ou dos reflexos de retirada do pedal.Verificar novamente a profundidade anestésica durante o procedimento operatório. Mantenha os ratos na mesa de cirurgia pré-aquecida para evitar hipotermia. Dilatar as pupilas receptoras com colírio de tropicamida cinco minutos antes da cirurgia.Uma pupila bem dilatada pode facilitar a visualização transpupilar ao microscópio cirúrgico. Coloque uma gota de cloridrato de proparacaína no olho de ratos para analgesia. Desinfetar o olho do rato em operação e os tecidos oculares circundantes com iodo.Em seguida, limpe o olho com PBS estéril. Penetrar o túnel periférico na câmara interna para reduzir a pressão intraocular. Em seguida, coloque uma gota de hialuronato de sódio e uma tampa de vidro em cima da córnea.A visualização transpupilar do fundo de olho de camundongo está agora disponível sob o escopo cirúrgico. Expor o locus de injeção empurrando a parede do olho em direção ao centro do visual transpupilar com pinça dentada. Em seguida, penetre parcialmente na esclera com uma agulha de microinjeção, voltada 90 graus para a parede do olho.Os vasos superficiais da retina podem servir como referência anatômica para localizar a agulha dentro do espaço sub-retiniano. Em seguida, injete os enxertos de retina. As pequenas bolhas pré-carregadas na seringa podem facilitar a validação da localização sub-retiniana das células doadoras.Se a córnea ficar turva, mantenha a agulha no espaço sub-retiniano, até que a córnea se torne transparente para normalizar a pressão intraocular. Segure a borda do orifício de injeção e puxe rapidamente a agulha. O critério para o sucesso da liberação da suspensão celular é uma constante bleb no espaço sub-retiniano.Uma entrega bem-sucedida de lençol de retina, é convencida por uma folha branca visível. Mantenha os ratos transplantados em uma gaiola de recuperação limpa pré-aquecida e monitore-os cuidadosamente em busca de quaisquer sinais de angústia. Se isso ocorrer, coloque uma gota de cloridrato de proparacaína tópica no olho cirúrgico por duas, três vezes.Remova os ratos de volta para a gaiola de casa depois que os ratos estiverem completamente alertas e móveis. Coloque um pequeno número de pellets de comida no copo de gel no chão da gaiola. Se os ratos tiverem problemas para alcançar o funil de comida.Dois meses após o transplante, foi realizada oftalmoscopia a laser de varredura confocal multimodal para verificar o estado dos enxertos de retina vistos vivo. A tomografia de coerência óptica de domínio espectral mostrou que os enxertos de retina sobreviveram no espaço sub-retiniano e reconstituem a camada nuclear externa de todos os camundongos receptores. A imagem infravermelha não detectou catarata óbvia em todos os camundongos transplantados.Outras complicações cirúrgicas, incluindo hemorragia, foram gravemente detectadas em camundongos transplantados por imagem de reflectância multicolorida. A coloração histológica mostrou fotorreceptores cônicos abundantes expressando OPN1LW:EGFP e S-opsin em lâminas de retina transplantadas. Da mesma forma, as suspensões de células retinianas transplantadas mostraram uma grande proporção de fotorreceptores positivos em recuperação in vivo, incluindo numerosos bastonetes maduros positivos para EGFP.Os camundongos não transplantados apresentaram degeneração severa da camada nuclear externa com fotorreceptores residuais esparsos expressando recuperação. No entanto, nenhum sinal de EGP foi detectado em camundongos não transplantados. Este estudo fornece uma plataforma cirúrgica transescleral com orientação direta da visão transpupilar para transplante sub-retiniano em receptores de camundongos.Esta plataforma permite a entrega precisa de doses conhecidas de células. É relativamente fácil aprender e facilitar a entrega sub-retiniana, além de injeções intra-retinianas ou intravítreas para diferentes tipos de agentes terapêuticos, incluindo terapia gênica.

transpupillary-guided-trans-scleral-transplantation-subretinal-grafts

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC pós-criopreservadas e a liberação sub-retiniana dessas células em camundongos rd10 .

Liberação Sub-Retiniana de Progenitores de Fotorreceptores Derivados de Células-Tronco Embrionárias Humanas em Camundongos rd10

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