Name: Purificação de cromatina de locus gênico de cópia única em Saccharomyces cerevisiae (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-17T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprenda a purificar cromatina de locus gênico de cópia única em Saccharomyces cerevisiae para estudar interações proteína-DNA. Este método permite análises funcionais sem artefatos de reticulação.

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O trabalho no laboratório de S.H. foi apoiado pela DFG através do SFB1064 (projeto ID 213249687), do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) e da Helmholtz Gesellschaft.

Isolamento de cromatina específico de locus de células de levedura

<ol><li>Kornberg, R. D., Lorch, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty-five+years+of+the+nucleosome%2C+fundamental+particle+of+the+eukaryote+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome.</a> Cell. 98 (3), 285-294 (1999).</li>
<li>Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+enrichment+of+specific+chromatin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification and enrichment of specific chromatin loci.</a> Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).</li>
<li>Korthout, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+chromatin+proteome+of+a+single+genomic+locus+by+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing.</a> PLoS Biology. 16 (7), e2005542(2018).</li>
<li>Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+landscape+at+Drosophila+melanogaster+telomere-associated+sequence+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats.</a> Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).</li>
<li>Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins+associated+with+specific+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins associated with specific genomic loci.</a> Cell. 136 (1), 175-186 (2009).</li>
<li>Ide, S., Dejardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-targeting+proteomics+of+isolated+chromatin+segments+of+a+mammalian+ribosomal+RNA+gene+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter.</a> Nature Communications. 6, 6674(2015).</li>
<li>Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+histone+acetylation+regulate+origins+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26amp%3B+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (4), 430(2010).</li>
<li>Buxton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+protein-DNA+interactions+in+human+alphoid+chromatin+via+hybridization+capture+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).</li>
<li>Kennedy-Darling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+chromatin-associated+proteins+via+sequence-specific+capture+and+mass+spectrometric+protein+identification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).</li>
<li>Liu, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi-based+genome-scale+identification+of+functional+long+noncoding+RNA+loci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells.</a> Science. 355, 7111(2017).</li>
<li>Hamperl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+chromatin+domains+from+single-copy+gene+loci+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Analysis+of+DNA+and+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae.</a> Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).</li>
<li>Hamperl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+and+structural+analysis+of+selected+chromosomal+domains+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 2(2014).</li>
<li>Weiβ, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+locus+proteomics+of+early-+and+late-firing+DNA+replication+origins+identifies+a+role+of+Ask1%2FDASH+complex+in+replication+timing+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control.</a> Cell Reports. 42 (2), 112045(2023).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol">https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol</a> (2023).</li>
<li>Vermeulen, M., Déjardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-specific+chromatin+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Locus-specific chromatin isolation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

A identificação dos fatores e da paisagem da cromatina de uma região genômica alvo específica continua a representar um grande desafio na pesquisa da cromatina18. Este protocolo descreve um sistema eficiente para especificamente excisar e purificar domínios distintos da cromatina dos cromossomos de leveduras. Até onde sabemos, a pureza e o rendimento desta purificação em etapa única superam muitas das limitações dos métodos de purificação de cromatina locus-específicos, permitindo assim a obtenção...

A organização dinâmica de genomas eucarióticos em cromatina compacta o DNA para caber dentro dos limites do núcleo, garantindo dinâmica suficiente para a expressão gênica e acessibilidade para fatores regulatórios. Em parte, essa versatilidade é mediada pelo nucleossomo, a unidade básica da cromatina, que compreende uma partícula central com 147 pb de DNA envolto ~1,7 vezes em torno do oitâmero de histona1. O nucleossomo é uma estrutura altamente dinâmica em relação à sua composição, com numerosas variantes de histonas e modificações pós-traducionais (MPTs) nas caudas das histonas N- e C-terminais. Além disso, a cromatina eucariótica interage com uma infinidade de outros componentes essenciais, tais como fatores de transcrição, maquinário de processamento de DNA e RNA, proteínas arquitetônicas, enzimas envolvidas no remodelamento e modificação da cromatina e moléculas de RNA associadas à cromatina. Essas máquinas cruciais envolvidas na transcrição, replicação e reparo requerem acesso à cromatina, que serve como substrato natural para esses processos. Consequentemente, compreender os mecanismos moleculares subjacentes a essas transações de DNA requer uma definição precisa das alterações coletivas na estrutura da cromatina nas regiões genômicas específicas onde essas máquinas convergem e facilitam as reações biológicas.
Apesar da identificação de numerosos fatores da cromatina através de estudos genéticos e de interação proteína-proteína, a realização de análises diretas, imparciais e abrangentes das interações da cromatina em sítios genômicos específicos tem permanecido um obstáculo significativo 2,3. Inicialmente, apenas regiões altamente abundantes do genoma (isto é, loci repetitivos) ou plasmídeos multicópias poderiam ser isolados em quantidade e pureza suficientes para a identificação espectrométrica de massa das proteínas associadas 4,5,6,7. Uma série de novas abordagens baseadas na hibridização direta de sondas de captura para DNA cromatinizado, biotinilação de proximidade usando o sistema CRISPR-dCas9 ou a ligação de proteínas adaptadoras sequenciais específicas ao locus de interesse começaram a desvendar o proteoma de loci de cópia única de genomas de leveduras e mamíferos8,9,10 . No entanto, todos esses métodos requerem reticulação de formaldeído para estabilizar as interações proteína-DNA e sonicação para solubilizar a cromatina para posterior purificação. Juntas, ambas as manipulações excluem a possibilidade de estudos estruturais e funcionais subsequentes da cromatina purificada.
Para superar essas limitações, desenvolvemos previamente uma metodologia que emprega recombinação sítio-específica para extrair domínios cromossômicos direcionados de leveduras11,12. Em essência, a região genômica de interesse é cercada por sítios de reconhecimento (RS) para a R-recombinase sítio-específica de Zygosaccharomyces rouxi, incorporando simultaneamente um grupo de três sítios de ligação ao DNA para a proteína LexA repressora transcricional procariótica (LexA) dentro da mesma região. As células de levedura contêm um de expressão para a expressão simultânea de R-recombinase e uma proteína LexA fundida a uma etiqueta de purificação de afinidade em tandem (TAP). Após a indução da R-recombinase, a enzima excisa eficientemente a região alvo do cromossomo na forma de um domínio circular da cromatina. Este domínio pode ser purificado através da proteína adaptadora LexA-TAP, que se liga aos sítios de ligação do ADN LexA, bem como a um suporte de afinidade. Este método tem sido recentemente utilizado para isolar domínios distintos da cromatina contendo origens de replicação selecionadas do cromossomo III da levedura13.
Uma grande vantagem desta abordagem ex vivo é que ela permite análises funcionais do material isolado. Por exemplo, domínios de origem de replicação purificados com este método podem ser submetidos a ensaios de replicação in vitro para avaliar a eficiência de disparo de origem em um tubo de ensaio a partir de modelos de cromatina montados in vivo nativos. Em última análise, a caracterização bioquímica e funcional do material isolado pode permitir a reconstituição de processos nucleares utilizando proteínas purificadas em conjunto com o molde de cromatina nativa. Em resumo, esta metodologia abre um caminho empolgante na pesquisa da cromatina, pois será possível acompanhar as mudanças composicionais e estruturais coletivas da cromatina de uma região genômica específica submetida a uma determinada transação cromossômica.

<table><tbody><tr><td><forte>Cepas de levedura</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Cepa de controle:</forte> MATa; ura3&Delta; 0; leu2&Delta; 0; his3&Delta; 1; met15&Delta; 0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR</td><td></td><td></td><td>Seção 1, ver referências 13 e 14</td></tr><tr><td>Recombination Strain: MATa; ura3&Delta; 0; leu2&Delta; 0; his3&Delta; 1; met15&Delta; 0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR</td><td></td><td></td><td>Seção 1, consulte a referência 13 e o</td></tr> <tr>plasmídeo<td></td> 14Plasmid<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K238</td> Seção 1, consulte a referência 13 Armazenamento: Armazene a -20 &deg;<td></td><td></td><td> C</td></tr><tr><td>K071 DNA</td><td></td><td></td> de plasmídeo spike-in <td>Seção 7.1, consulte a referência 13 Armazenamento: Armazenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Carl Roth</td><td>5025.1</td><td>Seção 2 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Acetato de amônio (NH4Ac)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7262</td><td>Seção 6 e 7.1 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr> Solução de <tr><td>amônio (NH4OH) 25%</td><td>Merck Millipore</td><td>533003</td><td>Seção 6 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Sulfato de amônio</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-29085</td><td>Seção 2 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Ágar Bacto</td><td>BD (VWR)</td><td>90000-760</td><td>Seção 3 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Bacto peptona</td><td>BD (VWR)</td><td>211820</td><td>Seção 3 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>07604</td><td>Seção 7.2 Armazenamento: Armazenar a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Kit de substrato quimioluminescente</td><td>ThermoFisher</td><td>34580</td><td>Seção 7.2 Armazenamento: Armazenar a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato dissódico dodecahidratado</td><td>Merck</td><td>1.06579.1000</td><td>Seção 2 e 7.1 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher</td><td>15508013</td><td>Seção 4 Armazenamento: Armazenar a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ED</td><td>Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Galactose (20% (p/v) estoque)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0625-1KG&nbsp; /&nbsp; 5KG</td><td>Seção 3 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Gel carregando corante (6x)</td><td>BioLabs</td><td>B7024A</td><td>Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>Glusose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Seção Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Carl</td> <td>Roth.0079.4</td><td>Seção 2 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Glicogênio (5 mg/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9510</td><td>Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (HCl)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>182109.1211</td><td>Seção 2, 4 e 7.1 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Acetato de magnésio (MgAc)</td><td>Bernd Kraft</td><td>15274.2600/C035</td><td>Seção 4 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>Seção 6 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Nu PAGE Tampão de amostra LDS (4x)</td><td>Invitrogen</td><td>2399549</td><td>Seção 7.2 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1 v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Seção 4 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Marcado radioativamente &alpha;-32P dATP (3.000 Ci/mmol, 10 mCi/mL)</td><td>Hartmann Analytic</td><td>SRP-203</td><td>Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar a 4 > C</td></tr><tr><td>Sistema de rotulagem RadPrime</td><td>ThermoFisher</td><td>18428-011</td><td>Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Rafinose (estoque de 20% (p/v))</td> <td>SERVA</td><td>34140.03</td><td>Seção 3 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Merck</td><td>K53710504142</td><td>Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Citrato de sódio (Na3C6H5O7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71402</td><td>Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar à temperatura ambiente</td></tr><tr><td>N-dodecil sulfato de sódio (SDS) (5% estoque (p/v))</td> <td>Alfa Aesar</td><td>A11183</td><td>Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar à temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71496</td><td>Seção 2 e 7.1 Armazenamento: Armazenar à temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Sódio&nbsp; azida</td><td>Santa Cruz&nbsp; Biotecnologia</td><td>sc-208393</td><td>Seção 2 Armazenamento: Armazenar a -20 & C</td></tr><tr><td>&nbsp; Trietilamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90340</td><td>Seção 2 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Chem Cruz</td><td>SC-3715B</td><td>Seção 2 e 4 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Seção 2 e 4 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bernd Kraft</td><td>18014332</td><td>Seção 4 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>BD (VWR)</td><td>212720</td><td>Seção 3 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Fator de acasalamento de levedura alfa (1 &micro; g/mL de estoque )</td><td>&nbsp; Biomol</td><td>Y2016.5</td><td>Seção 3 Armazenamento: Armazenar a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>Levedura Sintética Drop-out Medium Suplementos sem LEUCINA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1376</td><td>Seção 1, consulte a referência 14</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>R0105S</td><td>Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar a -20 &deg; </td></tr><tr><td>Coquetel de Inibidores de Protease e Fosfatase C (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78446</td><td>Seção 4 Armazenamento: Armazenar em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Proteinase K (10 mg/mL)</td><td>SERVA</td><td>33756</td><td>Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>RNase A (10 mg/mL)</td><td>&nbsp; ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td>Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar a -20 > C</td></tr><tr><td>TEV protease (10000 U/&micro; L)</td> <td>NEB</td><td>P8112S</td><td>Seção 5 Armazenamento: Armazenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Materiais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BcMag Contas magnéticas ativadas por epóxi</td><td>Bioclone Inc.</td><td>FC-102</td><td>Seção 2 Armazenamento: Armazenar a 4 & graus; C</td></tr><tr><td>Gelo</td><td></td><td></td> seco <td>Seção 4</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de baixa ligação 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td>Seção 4</td></tr><tr><td>Microspin&nbsp; G-25 Colunas</td><td>Cytiva</td><td>27-5325-01</td><td>Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Merck</td><td>P7793</td><td>Seção 4</td></tr><tr><td>Membrana de nylon positiva</td><td>Biozol</td><td>11MEMP0001</td><td>Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Membrana de transferência de PVDF</td><td>Immobilon-Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Seção 7.2 Armazenamento: Armazenar em sala temperatura</td></tr><tr><td>SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 poços, 1,5 mm)</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; NP0336BOX</td><td>Seção 7.2 Armazenamento: Armazenar a 4 > C</td></tr><tr><td>Seringa (25 mL) com encaixe luer Henke</td><td>Sass Wolf</td><td>4200-000V0</td><td>Seção 3</td></tr><tr><td>Papel Whatman (Folha de papel Western Blotting de celulose CHR grau 3MM)</td> <td>Cytiva</td><td>3030-917</td><td>Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td><forte>Anticorpos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-LexA, IgG policlonal de coelho, anticorpo da região de ligação ao DNA</td><td>Merck Millipore</td><td>06-719</td><td>Seção 7.2 Armazenamento: Armazenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>IgG Anti-Coelho de Cabra (H+L), Conjugado de peroxidase de rábano</td><td>Invitrogen</td><td>G21234</td><td>Seção 7.2 Armazenamento: Armazenar a -20 &deg; Anticorpo C</td></tr><tr><td>Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) produzido em coelho para a detecção de proteínas marcadas com TAP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1291-500UL</td><td>Seção 7.2 Armazenamento: Armazenar a -20 &deg; Anticorpos IgG de coelho C</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>I5006-100MG</td><td>Seção 2 Armazenamento: Armazenar a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Primers (10 &micro; M) </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td> ARS316: fwd 5 '- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5 '- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT</td><td></td><td></td><td>Seção 7.1</td></tr> <tr><td>< forte > K071 DNA de plasmídeo spike-in: fwd: 5 '- TTTTCGCTGCTTGTCCTTTTTT, rev 5 '- CATTTTCGTCCTCCCAACAT</td><td></td><td></td><td>Seção 7.1</td></tr><tr><td>< fragmento > PCR forte do DNA genômico de levedura como modelo &nbsp; para amplificação ARS316 (para southern blot): fwd 5'- AAATTCTGCCCTTGATTCGT&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; rev 5'- TTTGTTTATCTCATCACTAAT</td><td></td><td></td><td>Seção 7.1</td></tr><tr><td>PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT</td><td></td><td></td><td>Seção 7.1</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coffee grinder</td><td>Gastroback</td><td>42601</td><td>Seção 4</td></tr><tr><td>Frasco Dewar</td><td>NAL GENE</td><td>4150-2000</td><td>Seção 3</td></tr><tr><td>Rack magnético DynaMag TM-2</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Seção 4, 5 e 6</td></tr><tr><td>Forno de hibridização</td><td>Hybaid Mini10</td><td>Ri418</td><td>Seção 2</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>Seção 4 e 7.1</td></tr><tr><td>Reticulador UV</td><td>Analytikjena</td><td>95-0174-02</td><td>Seção 7.1</td></tr></tbody></table>

purificação de cromatina de locus gênico de cópia única em saccharomyces cerevisiae

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

A unidade organizacional básica da cromatina eucariótica é a partícula núcleo do nucleossomo (NCP), que compreende DNA envolto ~1,7 vezes em torno de um octâmero de histona. A cromatina é definida como a entidade de NCPs e numerosos outros complexos proteicos, incluindo fatores de transcrição, remodelamento da cromatina e enzimas modificadoras. Ainda não está claro como essas interações proteína-DNA são orquestradas no nível de loci genômicos específicos durante diferentes estágios do ciclo celular. Isso se deve principalmente às limitações técnicas atuais, que tornam difícil obter medidas precisas dessas interações dinâmicas. Aqui, descrevemos um método aprimorado combinando recombinação sítio-específica com um eficiente protocolo de purificação de afinidade em etapa única para isolar um locus gênico de cópia única de interesse em seu estado nativo de cromatina. O método permite o enriquecimento robusto do locus alvo sobre a cromatina genômica, tornando esta técnica uma estratégia eficaz para identificar e quantificar interações proteicas de forma imparcial e sistemática, por exemplo, por espectrometria de massas. Além dessas análises composicionais, a cromatina nativa purificada por este método provavelmente reflete a situação in vivo em relação ao posicionamento do nucleossomo e modificações de histonas e, portanto, é passível de análises estruturais e bioquímicas adicionais da cromatina derivada de praticamente qualquer locus genômico em levedura.

A purificação do domínio da cromatina ARS316 de ~1,4 kb foi mediada pela proteína adaptadora LexA-TAP constitutivamente expressa. Para servir como controle negativo, realizamos purificações usando uma cepa isogênica que expressa LexA-TAP, mas não contém sítios integrados de ligação de RS e LexA. A Figura 3 ilustra o resultado da análise de DNA de um experimento de purificação padrão realizado tanto no controle quanto em uma cepa competente em recombinação visando o locus ARS316. Após o isola...

Este protocolo apresenta um método de isolamento de cromatina locus-específico baseado em recombinação sítio-específica para purificar um locus gênico de cópia única de interesse em seu contexto de cromatina nativa a partir de levedura brotante, Saccharomyces cerevisiae.

Purificação de cromatina de locus gênico de cópia única em Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...

Um núcleo eucariótico é muito povoado com muitos processos biológicos ocorrendo simultaneamente. O escopo de nossa pesquisa é entender como todos esses processos são coordenados em nossos genomas sem grandes acidentes que, de outra forma, levariam à instabilidade genômica e doenças humanas. Este protocolo permite purificar um locus específico do genoma em seu estado nativo, permitindo tanto a caracterização composicional quanto funcional do material isolado, como as medidas de interações de DNA proteico.Este protocolo permite um enorme nível de enriquecimento de um locus alvo, que supera muitas limitações atuais do isolamento de cromatina locus-específico. O material não foi cruzado. Isso também permite muitas análises funcionais a jusante, como transcrição in vitro ou replicação in vitro.Este protocolo nos permitiu excisar e purificar distintas origens de replicação de cromossomos de leveduras, permitindo-nos realizar uma análise proteômica e identificar novos fatores de cromatina interagindo de origem e, portanto, avançar no campo de pesquisa da replicação do DNA. Este protocolo permite estudos de replicação in vitro utilizando o material de origem purificada para examinar estados de cromatina, modificações de histonas e realizar análises estruturais em moldes nucleossômicos nativos de cromossomos endógenos, avançando na pesquisa da cromatina.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este artigo apresenta um método sensível chamado Circle-Seq para purificar o DNA circular extracromossômico (eccDNA). O método abrange purificação de coluna, remoção de DNA cromossômico linear restante, amplificação de círculo rolante e sequenciamento de alto rendimento. O Circle-Seq é aplicável à triagem em escala genômica de eccDNA eucariótico e ao estudo da instabilidade do genoma e da variação do número de cópias.

A purificação de todo o genoma de DNA circular Extracromossômica de células eucarióticas

Nós descrevemos a clivagem endógena da cromatina, juntamente com a sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq), um método ortogonal de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) para mapear os locais de ligação de proteínas genômicas com proteínas de fusão de nucleases microcócicas (MNase).

Mapeamento genômico de interações proteína-DNA com ChEC-seq em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Aqui, descrevemos um protocolo para a imunoprecipitação da cromatina de histonas modificadas de brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA é usado posteriormente para PCR quantitativo para interrogar a abundância e a localização de modificações borne-translational do histone durante todo o genoma.

Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) de Modificações de Histonas de Saccharomyces cerevisiae

O sistema CRISPR/Cas12a em combinação com uma única matriz crRNA permite a edição multiplex eficiente do genoma S. cerevisiae em vários locos simultaneamente. Isto é demonstrado pela construção de carotenóides produzindo cepas de levedura que são subsequentemente utilizados para criar a arte do pixel de levedura.

Edição do genoma de CRISPR/Cas12a multiplex de Saccharomyces cerevisiae e a criação da arte do pixel do fermento

Aqui está um protocolo para identificar interações genéticas através de uma tela supressora de número de cópia aumentada em Saccharomyces cerevisiae. Este método permite que os pesquisadores identifiquem, clonem e testem supressores em mutantes de levedura de curta duração. Testamos o efeito do aumento do número de cópias de SIR2 na vida útil em um mutante nulo autofagia.

Uma tela supressora para a caracterização de links genéticos regulando a vida cronológica em Saccharomyces cerevisiae

Este trabalho descreve um protocolo para uma triagem genética supressora de múltiplas cópias em Schizosaccharomyces pombe. Esta tela usa uma biblioteca de plasmídeos em todo o genoma para identificar clones supressores de um fenótipo de perda de função associado a uma cepa mutante de consulta. Novos supressores genéticos do mutante nulo ell1 foram identificados usando esta tela.

Triagem Genética para Identificação de Supressores Multicópia em Schizosaccharomyces pombe

Este manuscrito descreve como para o rastreio de mutações thermostabilizing, purificar o transportador humano de serotonina, gerar anticorpos de elevada afinidade, e cristalizar o complexo transportador-anticorpo serotonina ligada ao -citalopram S droga antidepressiva. Este protocolo pode ser adaptado para o estudo de outros transportadores difíceis de membrana, receptores e canais.

Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

Aqui, apresentamos um método para expressar e purificar S100A12 (calgranulina C). Descrevemos um protocolo para medir sua atividade antimicrobiana contra o patógeno humano H. pylori .

Expressão, Purificação e Actividade Antimicrobiana de S100A12

É apresentado um novo protocolo para a preparação da cromatina do músculo esquelético de rato adulto adaptado para o estudo da regulação gênica em fibras musculares por imunoprecipitação da cromatina.

Protocolo melhorado por imunoprecipitação da cromatina do músculo esquelético de rato

Aqui nós apresentamos um romance método para a determinação de afinidades de ligação em equilíbrio e em solução com alta sensibilidade em larga escala. Isto melhora a análise quantitativa de ligação de DNA-fator de transcrição. O método baseia-se em medições de anisotropia de fluorescência automatizada em um sistema de liberação controlada.

Medição de alta sensibilidade de afinidades de ligação do fator-DNA transcrição por titulação do competidor usando microscopia de fluorescência

Aprenda a purificar cromatina de locus gênico de cópia única em Saccharomyces cerevisiae para estudar interações proteína-DNA. Este método permite análises funcionais sem artefatos de reticulação.

Purificação de cromatina de locus gênico de cópia única em Saccharomyces cerevisiae

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