Name: Métodos para Confirmação de Eletroporação e Transformação em Limosilactobacillus reuteri DSM20016 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Aprenda métodos de eletroporação e transformação em Limosilactobacillus reuteri DSM20016. Este protocolo moderno facilita aplicações de biologia sintética e entrega terapêutica no trato gastrointestinal.

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Agradecemos imensamente os valiosos conselhos fornecidos pelo Prof. J.P. van Pijkeren (University of Wisconsin-Madison), cuja orientação sobre o trabalho com L. reuteri ATCC PTA 6475 forneceu uma base para os métodos descritos aqui.

1. Preparação de células eletrocompetentes DSM20016 L. reuteri
NOTA: Baseia-se em um protocolo de Berthier et al.17, com velocidades de centrifugação informadas por Rattanachaikunsopon et al.18º.
<ol><li>Em um tubo de centrífuga de 50 mL, inocular L. reuteri do estoque de glicerol em 6 mL de caldo deMan Rogosa Sharpe (MRS). Incubar aeróbia durante a noite a 37 °C numa incubadora estática.</li>
	<li>Na manhã seguinte, inocular 4 mL da cultura noturna em 200 mL de caldo MRS (diluição 1:50).</li>
	<li>Deixar crescer aerobicamente numa incubadora estática a 37 °C até que o valor de densidade óptica de 600 nm (OD600) atinja 0,5-0,85; Isso deve levar aproximadamente 2-3 h.</li>
	<li>Assim que um valor OD600 adequado for atingido, decantar o meio em tubos de centrífuga de 50 mL e colocar no gelo enquanto equilibra os tubos.</li>
	<li>Centrifugar por 5 min a 5.000 x g em uma centrífuga pré-resfriada a 4 °C.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante, ressuspenda cada pastilha em 50 mL de ddH2O pré-resfriado (0 °C a 4 °C) e centrifugue novamente com as mesmas configurações da etapa anterior. Mantenha as células no gelo tanto quanto possível.</li>
	<li>Repita a etapa 1.6.</li>
	<li>Ressuspender cada pellet em 25 mL de ddH2O: sacarose 0,5 M, glicerol a 10%. Centrifugar a 5.000 x g a 4 °C por 10 min. Descarte o sobrenadante e coloque as células novamente no gelo.</li>
	<li>Ressuspender todos os pellets nos mesmos 2 mL de ddH2O: sacarose 0,5 M, glicerol a 10%.</li>
	<li>Alíquota em porções de 50 μL a 100 μL em tubos de microcentrífuga pré-resfriados; conservar a -80 °C para utilização posterior.</li>
</ol>2. Eletroporação de L. reuteri 
NOTA: Evite pipetar tanto quanto possível nas etapas a seguir. A inclusão de uma eletroporação controle, sem adição de plasmídeo, é aconselhada para garantir que a seleção de antibióticos seja adequada.
<ol><li>Pegue uma alíquota de L. reuteri eletrocompetente inteira e descongele-a no gelo.</li>
	<li>Misturar suavemente 5 μL a 10 μL de plasmídeo (concentração final de plasmídio >6 nM) na alíquota descongelada, evitando ao máximo a pipetagem.</li>
	<li>Transfira para uma cubeta de eletroporação gelada de 1 mm de folga.</li>
	<li>Eletroporato a 1,25 kV, 400 Ω e 25 μF.</li>
	<li>Adicione 1 mL de caldo MRS à temperatura ambiente (TR) e misture invertendo a cubeta uma ou duas vezes.</li>
	<li>Coloque as cubetas em uma incubadora estática a 37 °C por 2,5-3 h para permitir a recuperação.</li>
	<li>Plaquear toda a quantidade em várias placas de ágar MRS com seleção apropriada.</li>
	<li>Coloque os pratos dentro de um recipiente completamente hermético com uma pequena vela acesa ("tealight") e um sachê gerador de atmosfera anaeróbica.</li>
	<li>Crescer a 37 °C por 2-3 dias ou até que colônias visíveis estejam presentes.</li>
</ol>3. Medição da proteína repórter fluorescente resistente a ácidos mCherry2
<ol><li>Escolha as colônias necessárias para a medição e inocular em uma microplaca de armazenamento de 96 poços com 1,5 mL de caldo MRS esterilizado por filtro (não autoclavado) por poço e um antibiótico de seleção apropriado.</li>
	<li>Incubar aeróbia durante 24 h durante a noite a 37 °C sem agitar. NOTA: Esta microplaca de armazenamento deve ser mantida para utilização na secção 4 (PCR de colónias).</li>
	<li>L. reuteri precipitar-se-á para fora da mídia quando na fase estacionária; ressuspender a cultura durante a noite por meio de pipetagem.</li>
	<li>Transfira 200 μL para uma placa plana, de fundo claro, de 96 poços, transfira a placa para um leitor de placas e meça o DO e a fluorescência de mCherry2 (excitação [Ex]: 589 nm; emissão [Em]: 610 nm) ou outros repórteres relevantes.</li>
</ol>4. Confirmação da captação de plasmídeos via PCR de colônias
<ol><li>A partir da microplaca de armazenamento de 96 poços da seção 3, transferir 5 μL para um tubo de PCR. NOTA: Se >5 min tiverem passado, pode ser necessário ressuspender o L. reuteri uma segunda vez.</li>
	<li>Em uma microcentrífuga portátil de bancada, gire para baixo até que o pellet possa ser visto (aproximadamente 2 min a 2.000 x g), descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 20 μL de NaOH 20 mM.</li>
	<li>Ferva a 95 °C por 5 min, vórtice, e repita a fervura uma segunda vez.</li>
	<li>Resfriar imediatamente as amostras; tente manter as amostras no gelo tanto quanto possível nas etapas a seguir para diminuir a probabilidade de degradação do molde e inibição da PCR.</li>
	<li>Gire para baixo em uma microcentrífuga portátil de bancada a 2.000 x g por 2 min até que os restos celulares sejam peletizados, em seguida, pegue 1 μL do sobrenadante e dilua em 99 μL de ddH2O sem DNase e RNase gelada (diluição de 100x).</li>
	<li>Use a diluição de 100x como o DNA molde em uma reação de PCR padrão usando primers plasmidiais específicos. Incluir um controle positivo com um plasmídeo derivado da mini-preparação de E. coli.</li>
	<li>Devolver as amostras no gelo e adicionar um corante de carga adequado a uma concentração de 1x.</li>
	<li>Executar em gel de agarose a 1% em tampão TAE (ácido tris-acetato-etilenodiaminotetracético [EDTA]) a 110 V durante 30 minutos. Imagem se necessário.</li>
</ol>5. Mini-prep para L. reuteri , seguido de PCR para confirmar a presença plasmidial
NOTA: Protocolo destinado ao uso com o kit mini-prep listado na Tabela de Materiais.
<ol><li>Inocular L. reuteri em 10 mL de caldo MRS contendo um antibiótico apropriado e incubar durante a noite aeróbia a 37 °C em uma incubadora estática.</li>
	<li>Centrifugar a 5.000 x g por 10 min em centrífuga pré-resfriada a 4 °C.</li>
	<li>Lavar o pellet em 2 mL de tampão P1 padrão (incluído no kit) para anular a acidez que possa interferir nas etapas posteriores, centrifugar com a mesma configuração descrita anteriormente e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender o pellet em 250 μL de tampão P1 modificado contendo 10 mg/mL de lisozima e 100 U/mL de mutanolisina para lisar as células bacterianas. Incubar durante 1-2 h a 37 °C.</li>
	<li>Adicionar 250 μL de tampão P2, misturar invertendo quatro a seis vezes e incubar em TR por um período não superior a 5 min.</li>
	<li>Adicione 350 μL de tampão N3 (incluído com o kit) e inverta imediatamente quatro a seis vezes suavemente para misturar.</li>
	<li>Centrifugar a 10.000 x g por 10 min.</li>
	<li>Transfira o máximo de sobrenadante possível para uma coluna de spin e centrífuga a 10.000 x g por 60 s. Descarte o fluxo.</li>
	<li>Lavar a coluna de spin com 500 μL de tampão PB (incluído no kit) e centrifugar a 10.000 x g por 60 s. Descarte o fluxo.</li>
	<li>Lave a coluna de spin com 750 μL de PE tampão (incluído no kit) e centrifuja a 10.000 x g por 60 s. Descarte o fluxo e centrifugue por 60 s para remover qualquer buffer residual.</li>
	<li>Coloque a coluna de spin num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Aplicar 20-30 μL de ddH2O livre de DNAse e RNAse no filtro da coluna de spin e deixar por 1-2 min, antes de centrifugar a 10.000 x g por 60 s.</li>
	<li>Realizar uma reação de PCR padrão usando primers plasmidiais específicos (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA), com eluato fornecendo o DNA molde. Incluir um controle positivo com um plasmídeo derivado da mini-preparação de E. coli. NOTA: As configurações de PCR usadas neste estudo são: 98 °C por 5 min, (98 °C por 30 s, 55 °C por 30 s, 72 °C por 45 s) 30 ciclos, 72 °C por 2 min, 4 °C segurar. Os parâmetros são altamente dependentes da polimerase utilizada, do comprimento do fragmento e dos primers exatos utilizados por qualquer pessoa que utilize este protocolo.</li>
</ol>

Medição de proteínas repórter em Limosilactobacillus reuteri DSM20016

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<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taxonomic+note+on+the+genus+Lactobacillus%3A+Description+of+23+novel+genera%2C+emended+description+of+the+genus+Lactobacillus+beijerinck+1901%2C+and+union+of+Lactobacillaceae+and+Leuconostocaceae%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Systematic+and+Evolutionary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (4), 2782-2858 (2020).</li>
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<li>Urbańska, M., Gieruszczak-Białek, D., Szajewska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+with+meta-analysis%3A+Lactobacillus+reuteri+DSM+17938+for+diarrhoeal+diseases+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Alimentary+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Systematic review with meta-analysis: Lactobacillus reuteri DSM 17938 for diarrhoeal diseases in children.</a> Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (10), 1025-1034 (2016).</li>
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<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+non-viable+Lactobacillus+reuteri+combining+with+14-day+standard+triple+therapy+on+Helicobacterpylori+eradication%3A+A+randomized+double-blind+placebo-controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Helicobacter%22%5BJournal%5D)">Effects of non-viable Lactobacillus reuteri combining with 14-day standard triple therapy on Helicobacterpylori eradication: A randomized double-blind placebo-controlled trial.</a> Helicobacter. 26 (6), 12856(2021).</li>
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<li>Aukrust, T. W., Brurberg, M. B., Nes, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Lactobacillus+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transformation of Lactobacillus by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 47, 201-208 (1995).</li>
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</ol>

Não existem conflitos de interesse.

A etapa mais crítica para a transformação da DSM20016 de L. reuteri é a geração de condições de crescimento anaeróbio após as transformações serem plaqueadas; colônias adquiridas em condições aeróbicas são muito ocasionais e geralmente não crescem quando inoculadas em caldo MRS. O chapeamento de todo o volume de recuperação também deve ser praticado para maximizar a probabilidade de crescimento da colônia. Mesmo com essas duas etapas críticas, a eficiência da transformação ainda é uma limitação na experimentação...

O gênero Lactobacillus foi historicamente classificado como gram-positivo, em forma de bastonete, não formador de esporos, anaeróbios facultativos ou microaerófilos que quebram açúcares para produzir principalmente ácido lático1. Esses critérios frouxos levaram a que Lactobacillus fosse, fenotípica e genotipicamente, um gênero extremamente diverso. Essa ampla categorização resultou na reclassificação do gênero, introduzindo 23 novos gêneros em 20202.
O gênero antigo e mais amplo incluía as principais espécies comensais e probióticas geralmente consideradas seguras (GRAS) para consumo3. A família Lactobacillaceae mantém uma percepção pública de serem "bactérias boas" devido aos muitos benefícios relatados à saúde conferidos pelo consumo de várias cepas 4,5,6,7. A facilidade com que eles podem navegar no trato gastrointestinal8 e sua aceitação pública combinam-se para posicionar cepas de Lactobacillaceae como fortes candidatas como organismos de chassi para aplicações medicinais, terapêuticas ou diagnósticas ingeríveis.
A ampla gama de características presentes na família Lactobacillaceae levou a uma situação em que não há de fato uma cepa de organismo-modelo; Os grupos de pesquisa tendem a selecionar espécies com as propriedades mais relevantes para seus objetivos particulares. (Por exemplo, laboratórios de fermentação láctea poderiam escolher L. lactis; estudos de fermentação vegetal poderiam selecionar L. plantarum; pesquisas sobre probióticos poderiam se concentrar em L. acidophilus; e assim por diante.)
Essa mesma ampla gama de características entre as espécies levou a um acúmulo de protocolos e procedimentos que podem funcionar bem para um subconjunto da família Lactobacillaceae , mas requerem otimização para funcionar eficientemente (ou talvez para funcionar) em outros9. Essa necessidade de otimização entre membros da família e mesmo dentro de membros da mesma espécie pode frustrar os esforços de pesquisadores desconhecidos. Os protocolos publicados nas seções de métodos dos artigos também podem incluir suas própriasmodificações10, levando a coleções de protocolos fragmentadas e descentralizadas.
L. reuteri é considerado um comensal amplamente vertebrado, encontrado consistentemente nos tratos gastrointestinal (GI) de mamíferos, aves11 e peixes12. As subcepas de L. reuteri são frequentemente geneticamente especializadas, via adaptação de proteínas de adesão do muco, para colonizar mais permanentemente hospedeiros nativos específicos 8,11,13. As espécies de Limosilactobacillus do trato gastrointestinal podem ser isoladas em hospedeiros fora de seu hospedeiro nativo, mas tendem mais para uma natureza transitória8.
Devido à especialização humano-hospedeiro, o L. reuteri DSM20016 posiciona-se muito bem como um chassi para aplicações diagnósticas ou terapêuticas em qualquer ponto do trato gastrointestinal humano, e a tensão DSM20016 poderia fornecer uma janela de efeito mais duradoura para intervenções quando comparada a cepas mais transitórias.
Neste artigo, descrevemos uma série de protocolos com eficácia demonstrada em Limosilactobacillus reuteri (designação da cepa: F275; outros números de coleta: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), juntamente com informações centralizadas sobre a cepa de outras fontes para auxiliar em aplicações de biologia molecular e de sistemas. Os procedimentos aqui descritos devem permitir que um pesquisador sem experiência prévia em cultura de L. reuteri, crie estoques eletrocompetentes, selecione colônias transformadas, confirme a transformação via reação em cadeia da polimerase (PCR) de colônias e meça a resposta do sistema projetado via proteínas fluorescentes repórteres.
Observamos que protocolos relacionados cobriram a recombinação do genoma assistida por CRISPR-Cas9 em L. reuteri (cepa: ATCC-PTA-6475)14 e a edição do genoma assistida por nickase CRSIPR-Cas9 em múltiplas colorações não-L. reuteri, da família Lactobacillaceae 15,16; estes, no entanto, não abordam a cepa L. reuteri DSM20016 que é nosso foco aqui.

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N3200L</td><td></td></tr><tr><td>1mL Espectrofotômetro Cuvetes</td><td>Thomas Scientific</td><td>1145J12</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>AGR001</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-15R (centrífuga refrigerada)</td><td>Beckman Allegra&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Já não está em produção</td></tr><tr><td>AnaeroGen 2.5 L Sachet</td><td>Thermo Scientific</td><td>OXAN0025A</td><td></td></tr><tr><td>BTX, ECM 399 sistema de electroporação</td><td>VWR</td><td>58017-984</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga (50 mL)</td><td>FroggaBio</td><td>TB50-500</td><td></td></tr><tr><td>DNA gel x6 corante de carga</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de electroporação</td><td>Fisherbrand</td><td>FB101</td><td></td></tr><tr><td>Eritromicina</td><td>Millipore Sigma</td><td>E5389-5G</td><td></td></tr><tr><td>Gel eletroporação banho/doca</td><td>VWR</td><td>76314-748</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>GLY001</td><td></td></tr><tr><td>Limosilactobacillus reuteri</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>DSM20016</td><td>Designação da cepa F275</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>BioShop</td><td>LYS702.5</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (1,7 mL)</td><td>FroggaBio</td><td>LMCT1.7B</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep kit (Qiagen)</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>slpGFP substituído por constitutivo, otimizado para códon, repórter mCherry2 proteína&nbsp;</td></tr><tr><td>MRS Caldo (Desidratado)</td><td>Thermo Scientific</td><td>CM0359B</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolisina</td><td>Millipore Sigma</td><td>M9901-5KU</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>1064691000</td><td></td></tr><tr><td>P100 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>P2.5 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>P20</td><td>Pipeta Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR</td> Microcentrífuga de bancada pessoal <td>FroggaBio</td><td>STF-A120S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Genlantis</td><td>E200100</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>PTC-150 Termociclador</td><td>MJ Research</td><td>N/A</td><td>Não está mais em produção</td></tr><tr><td>pTRKH3_slpGFP (modificado)</td><td>Addgene</td><td>27168</td><td></td></tr><tr><td>SPECTRONIC 200 Espectrofotômetro</td><td>Thermo Microplaca de armazenamento Scientific</td><td>840-281700</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-225</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>BioShop</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>TAE Buffer 50x</td><td>Thermo Scientific</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td>Não está mais em produção</td></tr><tr><td>VWR 1500E incubadora</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td>Não está mais em produção</td></tr></tbody></table>

métodos para confirmação de eletroporação e transformação em limosilactobacillus reuteri dsm20016

Methods for Electroporation and Transformation Confirmation in Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Lactobacillus eram um gênero incrivelmente grande e diversificado de bactérias compreendendo 261 espécies, várias das quais eram cepas comensais com potencial para uso como chassi para empreendimentos biológicos sintéticos dentro do trato gastrointestinal. A ampla variação fenotípica e genotípica observada dentro do gênero levou a uma recente reclassificação e à introdução de 23 novos gêneros.
Devido à amplitude das variações dentro dos gêneros antigos, os protocolos demonstrados em um membro podem não funcionar como anunciado com outros membros. A falta de informações centralizadas sobre como manipular exatamente cepas específicas levou a uma série de abordagens ad hoc , muitas vezes adaptadas de outras famílias bacterianas. Isso pode complicar as coisas para os pesquisadores que estão começando na área, que podem não saber quais informações se aplicam ou não à cepa escolhida.
Neste artigo, pretendemos centralizar um conjunto de protocolos com sucesso demonstrado, especificamente na designação F275 da cepa de Limosilactobacillus reuteri (outros números de coleta: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), juntamente com conselhos de solução de problemas e problemas comuns que se podem encontrar. Esses protocolos devem permitir que um pesquisador com pouca ou nenhuma experiência trabalhando com DSM20016 de L. reuteri transforme um plasmídeo, confirme a transformação e meça o feedback do sistema em um leitor de placas por meio de uma proteína repórter.

Eficiências de transformação L. reuteri não necessita de plasmídeo dcm-/dam- não metilado, como observado para outras Lactobacillaceae19,20 (ver Figura 1). A eletroporação de DSM20016 de L. reuteri com 10 μL do pTRKH3_mCherry2 plasmidial de 8,5 kb (pAMβ1 origem da replicação) deve proporcionar eficiências de transformação de aproximadamente 80 unidades formadoras de...

Aqui, apresentamos protocolos para trabalhar com Limosilactobacillus reuteri DSM20016, detalhando crescimento, transformação plasmidial, PCR de colônias, medição de proteína repórter fluorescente e mini-preparação limitada de plasmídeos, bem como problemas comuns e solução de problemas. Esses protocolos permitem a medição de proteínas repórteres em DSM20016, ou a confirmação via PCR de colônia se nenhum repórter estiver envolvido.

Métodos para Confirmação de Eletroporação e Transformação em Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Lactobacillus were an incredibly large, diverse genus of bacteria comprising 261 species, several of which were commensal strains with the potential for ...

L.Reuteri, e especificamente a cepa, DSM20016 é um comensal intestinal humano robusto e natural, com grande promessa para entrega terapêutica e detecção de doenças em todo o trato gastrointestinal. Este trabalho ajudará a posicioná DSM20016 como um chassi de biologia sintética para esses tipos de aplicações. Lactobacilas não têm nenhum organismo modelo específico.Espécies preferidas existem, mas geralmente são escolhidas com um viés para objetivos específicos de pesquisa. A variação dentro da família bacteriana levou a protocolos fragmentados, alguns com iterações de modificações que remontam a publicações. É muito difícil para as pessoas que estão começando filtrar exatamente o que é e o que não é útil.Um papel para a transformação da DSM20016 existe, mas não é moderno. Protocolos modernos para outros membros da família Lactobacillales existem, Mas eles não são DSM20016. Aqui nos esforçamos para fornecer um conjunto de protocolos para eletroporação DSM20016 fácil de usar, centralizado, modernizado, completo.Este conjunto de protocolos oferece uma modernização substancial em relação ao protocolo de exploração de DSM20016 anterior, e elucida alguns fios suspensos, além de enfatizar partes que antes eram menos claras. O conjunto de protocolos também é completo, e especificamente para DSM20016, uma cepa para a qual outros protocolos não DSM20016 não são totalmente compatíveis. Um dos nossos principais objetivos é usar micróbios como sensores e sistemas de entrega baratos.Estamos trabalhando com especialistas em doenças intestinais para usar DSM20016 para detectar as condições no trato gastrointestinal e fornecer terapêutica conforme necessário.

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Estratégias de micobactérias patogênicas continuam a ser mal compreendido. A taxa de crescimento lento da maioria das espécies, a natureza impenetrável do da parede celular, e os perigos de trabalhar com agentes patogénicos fazer micobactérias difíceis de estudar e são em grande parte responsáveis ​​por nossa má compreensão destes organismos. Neste vídeo iremos demonstrar a técnica da eletroporação, que envolve as células sujeitando a um impulso de alta breve elétrico para permitir a entrada de...

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A electroporação é um método vulgarmente utilizado para a introdução de ADN em bactérias, num processo conhecido como transformação. Protocolos tradicionais para a preparação de células electrocompetentes são demorados e trabalhosos. Este artigo descreve uma alternativa, rápida e eficiente método para a preparação de células electrocompetentes atualmente empregadas por alguns laboratórios.

Protocolo Rápido para Preparação de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; E<em&gt; Vibrio cholerae</em

Enterobacter sp. YSU cresce em meio de sais mínimos de glucose. Auxotrofos são geradas através da transformação com um transposome qual se insere aleatoriamente no genoma do hospedeiro. Os mutantes são encontrados pela réplica de placas a partir de meio complexo para meio mínimo. Genes interrompidos são identificados por socorro e seqüenciamento genético.

Geração de Enterobacter Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese

Aqui, descrevemos a construção de mutantes nulos de Aeromonas em glicosyltransferases específicas ou regiões contendo glicosyltransferases, os ensaios de motilidade e a purificação de flagela realizadas para estabelecer o envolvimento e função de suas enzimas codificadas na biossíntese de um glicano, bem como o papel deste glicano em patógenos bacterianos.

Geração de Mutantes Nulos para Elucidar o Papel das Glicosyltransferases Bacterianas na Motilidade Bacteriana

Descrevemos um procedimento fácil para a complementação cromossômica de cópia única de um gene de bomba de efluxo usando um sistema de expressão baseado em mini-Tn7 em uma cepa deficiente em efluxo projetada de Acinetobacter baumannii. Esta ferramenta genética precisa permite a expressão gênica controlada, o que é fundamental para a caracterização de bombas de efluxo em patógenos multirresistentes.

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Nanopartículas de indinavir, ritonavir, efavirenz e atazanavir foram fabricados usando moagem, homogeneização e ultra-som. Estes nanoformulations, coletivamente denominados nanoformulated terapia anti-retroviral (nanoART), avaliados com base em macrófagos entrega da droga. Derivados de monócitos macrófagos nanoART captação, retenção e liberação sustentada foram determinados. Estes estudos preliminares sugerem o potencial de nanoART para uso clínico.

Métodos de Desenvolvimento de Sangue Transporte Macrófago Borne de Nanoformulated medicamentos anti-retrovirais

Monocamadas auto-organizadas (SAMs) formado a partir de tióis de cadeia longa alcano em ouro proporcionar bem-definida substratos para a formação de padrões de proteínas e confinamento celular. Microcontact impressão de hexadecanethiol usando um carimbo de polidimetilsiloxano (PDMS), seguido pelo preenchimento com um glicol terminada alcano tiol monômero produz um padrão onde proteínas e células absorvem apenas para a região carimbada hexadecanethiol.

Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Aprenda métodos de eletroporação e transformação em Limosilactobacillus reuteri DSM20016. Este protocolo moderno facilita aplicações de biologia sintética e entrega terapêutica no trato gastrointestinal.

Métodos para Confirmação de Eletroporação e Transformação em Limosilactobacillus reuteri DSM20016

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