Name: Triagem de Drogas Baseadas em Células para Inibidores da Autofagia 4B Cisteína Peptidase Relacionada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprenda a triagem de drogas baseada em células para inibidores da ATG4B usando ensaios com luciferase. Este método permite identificar compostos moduladores da autofagia para pesquisa em câncer e doenças neurodegenerativas.

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Este trabalho foi apoiado pelo financiamento principal do Conselho de Pesquisa Médica do Reino Unido para o MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (referência de concessão 2018RIF_15), e o esquema de Apoio à Aceleração Terapêutica da UCL, apoiado pelo financiamento do MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. O plasmídeo que codifica o ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) foi obtido do Dr. Robin Ketteler (Departamento de Medicina Humana, Faculdade de Medicina de Berlim).

Análise de triagem de alto rendimento para inibidor de autofagia de cisteína peptidase 4B

<ol><li>Kocaturk, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+molecular+target+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a molecular target for cancer treatment.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+ATG4+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Targeting ATG4 in cancer therapy.</a> Cancers. 11 (5), 649(2019).</li>
<li>Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of autophagy.</a> EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).</li>
<li>Agrotis, A., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+ATG4B+as+drug+target+for+treatment+of+solid+tumours-the+knowns+and+the+unknowns%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns.</a> Cells. 9 (1), 53(2019).</li>
<li>Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+autophagy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting autophagy in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).</li>
<li>Kimmelman, A. C., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+tumor+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Autophagy and tumor metabolism.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).</li>
<li>Tran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+role+of+ATG4B+as+target+for+autophagy+inhibition+in+prostate+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).</li>
<li>Pengo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+kinases+and+phosphatases+that+regulate+ATG4B+activity+by+siRNA+and+small+molecule+screening+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148(2018).</li>
<li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delipidation+of+mammalian+Atg8-family+proteins+by+each+of+the+four+ATG4+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases.</a> Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).</li>
<li>Tanida, I., Sou, Y. -S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8L%2FApg8L+is+the+fourth+mammalian+modifier+of+mammalian+Atg8+conjugation+mediated+by+human+Atg4B%2C+Atg7+and+Atg3%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3.</a> The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).</li>
<li>Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+of+human+ATG4+protease+isoforms+in+autophagy+and+LC3%2FGABARAP+processing+revealed+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells.</a> Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).</li>
<li>Nguyen, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8+family+LC3%2FGABARAP+proteins+are+crucial+for+autophagosome-lysosome+fusion+but+not+autophagosome+formation+during+PINK1%2FParkin+mitophagy+and+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).</li>
<li>Ketteler, R., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG4%3A+More+than+a+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ATG4: More than a protease.</a> Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).</li>
<li>Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+roles+of+Atg4+proteases+from+autophagy+modulation+to+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy.</a> Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).</li>
<li>Fernández, ÁF., López-Otín, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+and+pathologic+relevance+of+autophagy+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The functional and pathologic relevance of autophagy proteases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).</li>
<li>Maruyama, T., Noda, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-regulating+protease+Atg4%3A+structure%2C+function%2C+regulation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition.</a> The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).</li>
<li>Ketteler, R., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+autophagy+by+luciferase+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Quantitation of autophagy by luciferase release assay.</a> Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).</li>
<li>Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -W., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+sensor+for+genome-wide+screens+of+intracellular+proteolytic+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage.</a> Genome Biology. 9 (4), 64(2008).</li>
<li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15, 14(2014).</li>
<li>Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+transgene+expression+in+primitive+hematopoietic+progenitor+cells+and+embryonic+stem+cells+efficiently+transduced+by+optimized+retroviral+hybrid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors.</a> Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Este protocolo descreve um ensaio genético-repórter baseado em células para a identificação de inibidores de ATG4B. A identificação de hits primários é baseada na atividade da luciferase no tratamento de células que expressam o quadro de leitura aberto de comprimento total da LC3B entre β-actina e dNGLUC. Algumas vantagens deste ensaio são que ele é sensível, altamente quantitativo e não invasivo, pois pode detectar dNGLUC sem lisar as células. Este trabalho apresenta um protocolo detalhado para geração de uma linhagem c...

A autofagia é um processo metabólico conservado que permite às células manter a homeostase intracelular e responder ao estresse degradando conteúdos celulares envelhecidos, defeituosos ou desnecessários através dos lisossomos 1,2,3. Em algumas condições fisiopatológicas, esse processo atua como uma resposta celular crucial à privação de nutrientes e oxigênio, resultando em nutrientes e lipídios reciclados, permitindo que as células se adaptem às suas necessidades metabólicas 2,3,4. A autofagia também tem sido identificada como uma resposta celular ao estresse relacionada a diversas doenças, como doenças neurodegenerativas, infecção por patógenos e vários tipos de câncer. A função da autofagia no câncer é complexa e dependente do tipo, estágio e status do tumor. Pode suprimir a tumorigênese por degradação autofágica das células lesadas, mas também pode promover a sobrevivência de tumores avançados por melhorar a sobrevivência celular durante condições estressantes, como hipóxia, privação de nutrientes e dano citotóxico2,4,5,6.
Vários estudos têm demonstrado que a inibição da autofagia proporciona um benefício como estratégia antineoplásica. Assim, a inibição de etapas críticas, como a formação do autofagossomo ou sua fusão com o lisossomo, poderia ser um método eficaz para o controle do câncer2,4,5,6. Evidências crescentes têm mostrado que a ATG4B está envolvida em certas condições patológicas, e tem ganhado atenção como um potencial alvo anticâncer2,3,4. Por exemplo, observou-se que células de câncer colorretal e células de câncer de mama positivas para receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2) apresentaram níveis de expressão de ATG4B significativamente mais elevados do que células normais adjacentes 2,4. Em células de câncer de próstata, a inibição da ATG4B resultou em suscetibilidade específica de linhagem celular à quimioterapia e radioterapia7. Recentemente, surgiram fortes evidências de que o adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é particularmente vulnerável à inibição da ATG4B. Por exemplo, em um modelo de camundongo geneticamente modificado, demonstrou-se que a perda intermitente da função ATG4B reduz o crescimento tumoral de ADP e aumenta a sobrevida 3,4. Em geral, a ATG4B é altamente superexpressa em alguns tipos de câncer, está relacionada à progressão do tumor e está ligada à resistência à terapia do câncer 2,4,8.
As ATG4 cisteína proteases em mamíferos possuem quatro membros da família, ATG4A-ATG4D. Essas proteínas exibem alguma seletividade alvo para a família de proteínas LC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 e podem ter funções adicionais não ligadas à sua atividade proteásica12,13. Além disso, a ATG4 atua na regulação de um novo tipo de modificação pós-traducional, a ATG8-ilação de proteínas11,12. Embora a ATG4B e seu principal substrato LC3B sejam os mais estudados, um quadro está emergindo que sugere um papel complexo para cada membro da subfamília na regulação de processos autofágicos e não autofágicos. Isso é corroborado por uma complexa rede de modificações pós-traducionais que regulam a atividade da ATG4B via fosforilação, acetilação, glicosilação e nitrosilação 9,10,11,12,13.
Vários inibidores conhecidos de ATG4B foram publicados2,4,14,15. Embora sejam adequados como ferramentas de pesquisa, seu perfil farmacodinâmico, seletividade ou potência ainda os impedem de se desenvolver como candidatos pré-clínicos 4,16. Em geral, há uma necessidade urgente de identificar compostos mais potentes e seletivos. Muitas vezes, os compostos são bons inibidores bioquímicos da função proteica, mas sua eficácia em ensaios baseados em células é pobre. Existem vários ensaios para monitorar a atividade de ATG4B, incluindo métodos bioquímicos e ensaios baseados em células4. Desenvolvemos previamente um ensaio simples, baseado em luminescência e de alto rendimento para monitorar a atividade de ATG4B em células 8,17. Este ensaio utiliza uma proteína luciferase de Gaussia princeps (GLUC) que é estável e ativa no meio extracelular e pode ser liberada inducivelmente das células em resposta à atividade proteolítica ATG4B18,19.
Nesta construção do repórter, a dNGLUC está ligada ao citoesqueleto de actina das células. Um ligante protease-específico pode ser introduzido entre a âncora de β-actina e a dNGLUC, tornando a secreção dependente da clivagem do ligante. Utilizou-se o quadro de leitura aberta de comprimento total da CL3B entre β-actina e dNGLUC, para poder monitorar a clivagem da CL3B17,18,19. Embora o mecanismo de secreção da dNGLUC seja pouco compreendido, ele é específico para monitorar a atividade de ATG4B, não depende da autofagia global como ocorre em células knockout de ATG5 e é mediado por mecanismos não convencionais que não requerem um peptídeo sinal clássico 4,18,19. Usamos com sucesso este repórter para selecionar pequenas moléculas e bibliotecas de siRNA, e identificamos novos reguladores da atividade de ATG4B, como as quinases da proteína Akt8. Este artigo descreve um protocolo detalhado para o uso deste repórter de luciferase em um formato de triagem semi-automatizado e de alto rendimento.

<table><tbody><tr><td>50 &micro; L Pontas Descartáveis - Não filtradas, Puras, Aninhadas 8 Stack (Passive Stack)</td><td>Tecan</td><td>30038609</td><td>Descartável Rack de 96 pontas</td></tr><tr><td>BioTek MultiFlo</td><td>BioTek</td><td></td><td>dispensador a granel</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-205904</td><td>substrato</td></tr><tr><td>Columbus Software de análise de imagem</td><td>Perkin Elmer</td><td>Versão 2.9.1</td><td>software de análise</td></tr><tr><td>de imagem DPBS (1x)</td><td>Microplaca</td> de Polipropileno de 384 Poços Qualificados Echo Gibco <td>14190-144</td><td></td></tr>, <tr><td>Transparente, Não Estéril</td><td>Placa 384PP</td><td>Beckman Coulter</td><td>001-14555</td></tr><tr><td>EnVision II</td><td>Leitor de placas de luminescência</td><td>Perkin Elmer</td><td></td></tr><tr><td>Biblioteca Express pick (96 poços)-L3600-Z369949-100&micro; L</td><td>Selleckchem</td><td>L3600</td><td>Selleckchem</td></tr><tr><td>FMK9A</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-100522</td><td></td></tr><tr><td>Greiner FLUOTRAC 200 placas de 384 poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781076</td><td>placas pretas sólidas de 384 poços</td></tr><tr><td>Software de imagem Harmony Imaging</td><td>Perkin Elmer</td><td>Software de imagem versão 5.1</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Tricloridrato, Trihidrato - 10 mg/mL Solução em Água</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td>Hoechst 33342</td></tr><tr><td>Labcyte Echo série 550 com software Echo Cherry Pick</td><td>Dispensador de líquido acústico em nanoescala</td><td>Labcyte/Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr>Água deionizada<td>Milli-Q</td><td></td><td></td> Água <td>deionizada</td></tr><tr><td>Opera Phenix Sistema de triagem de alto conteúdo Microscópio</td><td>automatizado</td><td>Perkin Elmer</td><td></td></tr><tr><td>Solução de paraformaldeído 4% em PBS</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate 384 poços, preto, fundo plano opticamente transparente, tratado para cultura de tecidos, tampas</td><td>Perkin Elmer</td><td>6057300</td><td>CellCarrier-384 Ultra PN</td></tr><tr><td>pMOWS-ActinLC3dNGLUC</td><td></td><td></td><td>Obtido do Dr. Robin Ketteler (Departamento de Medicina Humana, Faculdade de Medicina de Berlim)</td></tr> <tr><td>Reagente de Infecção / Transfecção de Polibreno</td><td>Merck</td><td>TR-1003-G</td><td>polybrene</td></tr><tr><td>Cloridrato de puromicina, 98%, Thermo Scientific Chemicals</td><td>ThermoFisher</td><td>J61278.ME</td><td>Puromicina</td></tr><tr><td>Tecan Freedom EVO 200 robô</td><td>Tecan</td><td></td><td>plataforma robótica de manuseio de líquidos</td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA Reagente de transfecção de DNA Roche</td><td>Merck</td><td>6366244001</td><td>reagente de transfecção de DNA</td></tr></tbody></table>

triagem de drogas baseadas em células para inibidores da autofagia 4b cisteína peptidase relacionada

Cell-Based Drug Screening for Inhibitors of Autophagy Related 4B Cysteine Peptidase

Evidências crescentes têm mostrado que o alto fluxo autofágico está relacionado à progressão tumoral e à resistência à terapia do câncer. A dosagem de proteínas individuais de autofagia é um pré-requisito para estratégias terapêuticas direcionadas a essa via. Demonstrou-se que a inibição da protease autofágica ATG4B aumenta a sobrevida global, sugerindo que a ATG4B pode ser um potencial alvo de drogas para a terapia do câncer. Nosso laboratório desenvolveu um ensaio seletivo baseado em luciferase para monitorar a atividade de ATG4B em células. Para este ensaio, o substrato de ATG4B, LC3B, é marcado no término C com uma luciferase secretável do copépode marinho Gaussia princeps (GLUC). Este repórter está ligado ao citoesqueleto da actina, mantendo-o assim no citoplasma das células quando tido. A clivagem mediada por ATG4B resulta na liberação de GLUC por secreção não convencional, que pode ser monitorada pela coleta de sobrenadantes de cultura celular como um correlato da atividade celular de ATG4B. Este artigo apresenta a adaptação deste ensaio baseado em luciferase para triagem automatizada de alto rendimento. Descrevemos o fluxo de trabalho e a otimização para uma análise exemplar de alto rendimento da atividade ATG4B celular.

Em uma publicação anterior8, usamos com sucesso este ensaio para selecionar pequenas bibliotecas de moléculas e siRNA e identificamos novos reguladores de ATG4B. Aqui, descrevemos o protocolo e os resultados representativos deste repórter de luciferase em um formato de triagem semi-automatizado e de alto rendimento. A Figura 8 mostra um exemplo da análise dos dados brutos tanto para os núcleos celulares quanto para a luminescência. Um resultado típico de uma medição d...

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para o uso de um ensaio de repórter baseado em luciferase em um formato de triagem semi-automatizado e de alto rendimento.

Triagem de Drogas Baseadas em Células para Inibidores da Autofagia 4B Cisteína Peptidase Relacionada

Growing evidence has shown that high autophagic flux is related to tumor progression and cancer therapy resistance. Assaying individual autophagy proteins ...

O principal objetivo da pesquisa em meu laboratório é entender a regulação da autofagia e, em particular, da proteína cisteína ATG4 e usar esse conhecimento para desenvolver inibidores de pequenas moléculas que visam essa via em particular para doenças como o câncer de pâncreas. Usamos tecnologias de triagem de alto conteúdo e alto rendimento para identificar alvos de drogas, bem como candidatos a medicamentos, e nos concentramos na família de proteases de cisteína ATG4 porque achamos que é um alvo de drogas muito bom para várias formas de câncer. Temos estudado os membros da família ATG4 há algum tempo.Fizemos descobertas significativas sobre a disfunção dessa família de proteínas e células. Também identificamos novos mecanismos pós-traducionais de regulação dos membros da família ATG4 e atualmente estamos desenvolvendo inibidores de pequenas moléculas e também ativadores das famílias ATG4 para doenças como câncer e neurodegeneração. Não há muitos ensaios para monitorar a atividade da protease ATG4 em células.Então, fomos um dos primeiros a desenvolver um ensaio baseado em luciferase para monitorar essa atividade. E nosso ensaio é bastante incomum porque usa segredo, digamos frase, portanto, não precisamos licenciar as células e podemos adaptar esse protocolo facilmente a métodos de triagem de alto rendimento e automação de laboratório. Temos nos concentrado na protease da proteína ATG4 B há algum tempo.Geramos linhagens celulares nocaute dos membros da família ATG4. Identificamos novos mecanismos de regulação pós-traducional do ATG4 e, finalmente, também identificamos vários novos compostos de pequenas moléculas que poderiam inibir e até ativar a protease ATG4 B. No futuro, gostaríamos de continuar nosso trabalho nos membros da família ATG4.Achamos que é muita coisa que é atualmente desconhecida e ainda precisa ser descoberta. Por exemplo, como essas proteínas regulam a autofagia em neurônios atualmente não é completamente compreendido. Também gostaríamos de focar nosso trabalho na validação desses compostos de pequenas moléculas que identificamos e potencialmente usar ativadores em doenças neurodegenerativas.

cell-based-drug-screening-for-inhibitors-autophagy-related-4b

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Autophagy é um processo ubíquo que permite que as células para se degradarem e reciclar proteínas e organelas. Aplicamos microscopia de fluorescência para visualizar avançada e quantificar o pequeno, mas, alterações físicas essenciais associados com a indução de autofagia, incluindo a formação e distribuição de autofagossomas e lisossomas, e sua fusão em autolysosomes.

Análise Quantitativa de Autophagy usando microscopia de fluorescência avançada 3D

Para combater a disseminação da bactéria, as células hospedeiras reorganizar seu citoesqueleto de compartimentar as bactérias e induzir a autofagia. Usando Shigella infecção de células de cultura de tecidos, hospedeiro e determinantes de agentes patogénicos subjacentes a este processo são identificados e caracterizados. Utilizando modelos de peixe-zebra de infecção Shigella, o papel de moléculas e de mecanismos descobertos são investigados in vivo.

Utilização de<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Para estudar interações Autophagy-Cytoskeleton

Aqui, a citometria de fluxo de imagem multiespectral com uma característica analítica que compara imagens de detalhes brilhantes de 3 marcadores de autofagia e quantifica sua co-localização, juntamente com a contagem de pontos LC3, foi usada para medir autofagia de forma objetiva, quantitativa e estatisticamente robusta.

Avaliando o Fluxo Autofágico Medindo LC3, p62 e LAMP1 Co-localization Usando a Citometria de Fluxo de Imagem Multiespectral

Apresentados aqui são duas técnicas de pesquisa de interação da proteína-proteína baseada em anticorpos: imunofluorescência e imunoprecipitação. Estas técnicas são apropriadas para estudar interações físicas entre proteínas para a descoberta de novos componentes das vias de sinalização celulares e dinâmica de compreensão da proteína.<br...

Estudo das interações proteína-proteína em pesquisa de autofagia

Mitophagy, o processo de compensação danificada mitocôndrias, é necessário para a manutenção de saúde e homeostase mitocondrial. Este artigo apresenta alguns dos mitophagy mais recente métodos de deteção em células humanas, Caenorhabditis eleganse os ratos.

In Vitro e In Vivo de deteção de Mitophagy em células humanas, C. Eleganse os ratos

Aqui, é descrito um protocolo simples e bem validado para medir a atividade de autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos. O método baseia-se em quantificar a proporção de lactato desidrogenase (LDH) em frações de célula sedimentáveis em comparação com os níveis LDH totais do celulares.

O ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — Um método simples e confiável para determinar a atividade de Autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos

Este papel utiliza um ensaio de fluxo cytometry-baseado para bibliotecas de tela de inibidores químicos para a identificação de inibidores e os alvos que influenciam a sinalização do receptor de células T. Os métodos descritos aqui também podem ser expandidos para as sessões de alta produtividade.

Identificação de mediadores do Receptor de células T através da triagem de bibliotecas de inibidor químico de sinalização

Um protocolo detalhado para a geração de Microarrays humanos Self-assembled da proteína para a seleção de inibidores da quinase é apresentado.

Triagem de inibidores da quinase em Microarrays de proteínas humanas Automontados

Neste estudo, apresentamos estratégias baseadas em inibidor e siRNA para interferir com o fluxo autofárgico no vírus Herpes simplex tipo 1 (HSV-1) células dendríticas derivadas de monocyte infectadas.

eletroporação siRNA para modular a autofagia em herpes simplex vírus tipo 1 infectado monocyte derivados células dendríticas

O objetivo deste protocolo é determinar os níveis autofágicos em câncer de pâncreas e células acinares pancreáticas através da imunofluorescência da LC3 e quantificação do ponto da CL3.

Avaliação dos Níveis de Autofagia em Dois Diferentes Modelos de Células Pancreáticas Utilizando Imunofluorescência LC3

Aprenda a triagem de drogas baseada em células para inibidores da ATG4B usando ensaios com luciferase. Este método permite identificar compostos moduladores da autofagia para pesquisa em câncer e doenças neurodegenerativas.

Triagem de Drogas Baseadas em Células para Inibidores da Autofagia 4B Cisteína Peptidase Relacionada

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