Mapeando a distribuição celular de uma proteína optogenética usando uma grade de estimulação luminosa
January 26th, 2024
Este protocolo envolve a transfecção de sensores cAMP e bPAC-nLuc, uma proteína optogenética, para rastrear com precisão sua distribuição celular e resposta à estimulação luminosa. A abordagem inovadora de criar um mapa de resposta cAMP usando um sistema de varredura de pontos tem o potencial de avançar na pesquisa com proteínas optogenéticas em diferentes campos.
Nosso laboratório investiga a regulação espacial e temporal do AMP cíclico para entender quais condições desencadeiam eventos específicos a jusante. Para imitar efetivamente a ativação subcelular e a inibição da sinalização de AMP cíclico, caracterizamos a distribuição de uma ferramenta optogenética chamada bPAC-nanoluciferase. Para testar a validade dos modelos atuais de sinalização de AMP cíclico, desenvolvemos ferramentas para avaliar, imitar e bloquear a sinalização de AMP cíclico de compartimentos subcelulares em células vivas.
Este protocolo pode ser usado para estimular e avaliar a distribuição e função de ferramentas optogenéticas de maneira sistemática. Bem, nosso objetivo era testar se o processo de luz de foco pode ativar com precisão proteínas optogenéticas em zonas celulares específicas, evitando assim o impacto nas proteínas circundantes. Este método será vital para estudar proteínas com distribuições difusas ou se o efeito pretendido for gerar aumentos localizados no AMP cíclico ou outras moléculas de sinalização.
Em experimentos optogenéticos, a abordagem típica envolve estimular um campo inteiro de células ou, às vezes, áreas designadas menores. No entanto, a seleção dessa área e intensidade é muitas vezes arbitrária. Nossa abordagem sistemática permite que os investigadores conduzam experimentos mais precisos, ajudando a imitar padrões de vias de sinalização.
Para este estudo, use células co-transfectadas com um sensor AMP cíclico direcionado ao nuclear e uma proteína optogenética direcionada ao nuclear, NLS-bPAC-nanoluciferase. Cultive e manipule as células que expressam o bPAC nuclear em um ambiente escuro. Use uma lâmpada vermelha de luz de segurança para evitar a exposição a comprimentos de onda inferiores a 500 nanômetros.
Realize os experimentos de imagem em um microscópio motorizado de dois decks equipado com um mecanismo de luz multi-LED, uma roda de filtro de emissão, platina XY motorizada, uma câmera CMOS digital ORCA-Fusion e uma objetiva de óleo com ampliação de 100x com abertura numérica de 1,4. Para capturar imagens, use um software de microscopia digital. Esta configuração é capaz de estimular células e realizar medições de FRET simultaneamente usando um caminho de luz independente equipado com um filtro dicróico ZT458rdc.
Depois de ligar o geossistema UGA-42 e os lasers LDI-7, ligue o microscópio para configurá-lo adequadamente para adquirir dados com o sensor H208 FRET. Em seguida, abra sequencialmente o software de imagem e o software SysCon que controla o microscópio. Para calibrar o sistema antes de cada uso, navegue até a janela Câmera e selecione a guia Calibração.
Defina o comprimento de onda do laser compatível com a proteína optogenética. Escolha 445 nanômetros para estimular a bPAC-nanoluciferase. Selecione a guia Câmera e clique em Iniciar aquisição para iniciar a aquisição a partir do software de imagem.
Selecione a guia Calibração novamente. Clique no botão Iniciar calibração. Na lista suspensa exibida, selecione o modo de calibração adequado.
Siga as etapas de calibração indicadas pelo fabricante. Se necessário, altere as configurações do software de imagem para realizar a calibração adequada. Certifique-se de realizar a calibração em uma área livre de células da amostra.
Em seguida, usando o software de imagem, adquira uma imagem de fluorescência. As células fluorescentes aparecerão na janela do Visualizador de imagens. Posicione a célula que será estimulada usando os controles do microscópio XY dentro da área de influência, de preferência em seu centro.
Antes de iniciar o experimento real, use o modo Clique e dispare para avaliar rapidamente a capacidade de resposta de uma célula individual. Na janela Linha do tempo, ajuste os parâmetros de estimulação celular, incluindo a fonte de luz, a duração e a intensidade do estímulo. Na janela Visualizador de imagens, clique aproximadamente no centro da célula e avalie a resposta.
Na janela Visualizador de imagens, selecione o ícone redondo na barra de ferramentas à esquerda e, no menu suspenso, clique em Preenchido para desenhar objetos de estimulação circular preenchidos. Repita esta etapa para criar vários círculos idênticos e distribuí-los uniformemente, garantindo uma cobertura homogênea de todo o citoplasma da célula a ser estimulada. Na janela Visualizador de imagens, clique no ícone do ponteiro do mouse à esquerda e, em seguida, clique com o botão direito do mouse em um dos objetos de estimulação para verificar e editar suas propriedades.
Como alternativa, selecione todos os objetos de estimulação desenhados e, em seguida, clique com o botão direito do mouse para editar as propriedades de todos os objetos de estimulação selecionados juntos. Na subjanela Exibir, clique no botão Ajustar à Grade. Essa grade pode ajudar a manter o espaçamento e o alinhamento uniformes dos círculos para formar uma matriz ou matriz adequada.
Além disso, personalize as propriedades da grade com o botão Definir grade. Distribua os objetos de estimulação uniformemente com a ajuda da grade. Adicione mais objetos de estimulação, se necessário, para cobrir toda a célula.
Certifique-se de que todos tenham as mesmas propriedades. Cada objeto de estimulação criado anteriormente na janela Visualizador de imagens estará presente na janela Linha do tempo, onde é possível editar um conjunto diferente de propriedades, incluindo hora de início, duração, atraso, intensidade e muito mais. Para visualizar corretamente os objetos de estimulação, primeiro expanda a janela Linha do tempo.
Agora, pode-se ver as propriedades temporais dos objetos de estimulação na janela Linha do tempo. Selecione todos os objetos de estimulação e edite seu atraso e duração na subjanela Tempo do objeto. Na subjanela Fonte de luz, configure os comprimentos de onda e intensidades do objeto.
Garanta comprimento de onda e intensidade idênticos para todos. Para evitar a sobreposição do efeito de dois ou mais estímulos, defina horários de início diferentes para cada objeto ou varie o atraso entre eles, dependendo do resultado esperado. Em seguida, na janela Linha do tempo, altere a sequência na qual cada objeto de estimulação será ativado, se necessário.
Configure a sequência de estímulos em um padrão regular ou aleatório, dependendo do experimento. Depois de carregar a sequência no sistema, configure o número de ciclos ou execuções de sequência que o sistema executará na subjanela Sequência. Para medir as mudanças de fluorescência da célula estimulada, coloque as regiões de interesse no software de imagem nas posições desejadas.
Comece a adquirir imagens de fluorescência. Por fim, pressione Play na janela UGA-42 para começar a estimular as células. Observe os feixes de estimulação reais que também podem ser capturados pela câmera e sua correlação com os objetos de estimulação.
Observe apenas a mudança na intensidade do traço verde, que mostra o aumento na concentração de AMP cíclico medida pelo sensor. Isso ocorre especificamente quando o feixe atinge uma parte da célula com a quantidade mínima de bPAC-nanoluciferase. A fluorescência YFP de H208 foi usada para determinar a posição do núcleo.
Uma região de interesse cobrindo todo o núcleo foi usada para medir as mudanças na razão FRET do sensor H208 devido à estimulação nos pontos azuis indicados. Isso revelou que aumentos transitórios no AMP cíclico ocorreram apenas quando a luz azul foi direcionada para áreas contendo a bPAC-nanoluciferase. Isso confirmou que a bPAC-nanoluciferase direcionada ao núcleo foi expressa exclusivamente no compartimento nuclear das células HC-1.
Visão Geral
Este estudo concentra-se na regulação espacial e temporal da sinalização do AMP cíclico (cAMP) em células vivas usando uma ferramenta optogenética, bPAC-nanoluciferase. O protocolo desenvolvido permite aos pesquisadores criar mapas precisos de resposta do cAMP ao estimular sistematicamente zonas celulares específicas, minimizando assim a interferência com as proteínas celulares circundantes.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Sinalização de AMP cíclico
- Ferramentas optogenéticas
- Estudos de distribuição celular
Fundo
- Investigando os gatilhos dos eventos a jusante na sinalização do cAMP
- Caracterização e aplicação de ferramentas ópticas para estudos celulares dinâmicos
- Desafios da estimulação arbitrária de células em métodos tradicionais
Métodos Usados
- Transfecção de células com sensores de cAMP e bPAC-nanoluciferase
- Imagem e estimulação de células vivas usando configurações especializadas de microscopia
- Calibração e controle preciso da intensidade e duração da luz para estimulação
Principais Resultados
- Desenvolvimento de uma abordagem sistemática para estimular com precisão zonas celulares localizadas
- Capacidade de imitar padrões de sinalização de cAMP com impacto mínimo nas áreas vizinhas
- Validação do método através de medições FRET e imageamento
Conclusões
- Este estudo demonstra a eficácia do uso de sistemas de varredura pontual para controlar proteínas optogenéticas.
- As descobertas são significativas para futuras pesquisas em optogenética e vias de sinalização celular.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Precise mapping of optogenetic protein distribution and localized functional activation enables high-resolution interrogation of intracellular signaling pathways in discovery-stage research. This approach enhances predictive confidence in target validation by isolating subcellular effects and minimizing off-target activation. The method supports robust mechanistic de-risking and informs early portfolio triage decisions for signaling pathway modulation strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially resolved interrogation of signaling pathway activation at the subcellular level.
- Supports functional validation of optogenetic targets by isolating protein activity within defined cellular compartments.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing localized versus diffuse signaling effects.
- Improves predictive confidence for downstream pathway modulation strategies.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible, quantitative mapping of optogenetic protein distribution for assay standardization.
- Enables systematic evaluation of localized versus global stimulation effects in cell-based assays.
- Supports development of high-content screening platforms for spatially controlled protein activation.
- Provides quantitative readouts for reliable compound or tool evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns subcellular signaling interrogation with disease-relevant cellular models when applicable.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling precise mechanistic studies.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for pathway-targeted therapeutic concepts.
- Enhances translational biomarker development by mapping functional protein localization.
Pipeline & Workflow Integration
This optogenetic mapping method integrates into the early discovery-to-lead identification continuum, supporting hypothesis-driven target validation and assay development workflows.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of compartmentalized signaling and pathway specificity.
- Screening: Provides reproducible, quantitative spatial activation data for assay readiness.
- Analytics: Delivers high-resolution measurements of cAMP response and protein localization for comparative analysis.
- Translational Research: Supports mechanistic continuity into preclinical models when subcellular signaling is disease-relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mapping and functionally interrogating optogenetic tools across diverse targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes spatial stimulation protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient resource allocation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of signaling pathway targets and tool compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, live-cell imaging, and quantitative fluorescence analysis.
- Demands advanced microscopy platforms with programmable light stimulation and FRET measurement capabilities.
- Necessitates rigorous calibration and cross-team standardization of stimulation parameters.
- Adaptation may be needed for different cell types or subcellular targeting strategies.
- Practical limitations include potential phototoxicity and the need for dark environment handling to prevent unintended activation.
