Imunofluorescência Dupla de γH2AX e 53BP1 em Linfócitos Periféricos Humanos
14 de julho de 2023
Este protocolo apresenta um método para avaliar a formação e o reparo de quebras de dupla fita de DNA através da detecção simultânea de focos de γH2AX e 53BP1 em núcleos interfásicos de linfócitos periféricos humanos tratados com bleomicina.
O objetivo deste artigo foi avaliar a adequação da quantificação simultânea dos focos Gamma H2AX e 53BP1 para avaliar o dano genômico induzido em linfócitos periféricos humanos pela bleomicina. Vários fatores podem causar quebras de dupla corda. As células são, portanto, providas de vários mecanismos de reparo, envolvendo tanto a Gamma H2AX quanto a 53 Binding Protein 1, que podem co-localizar perto da quebra da fita dupla.
Após a coleta de amostras de sangue total, adicionar 300 microlitros de amostra a um tubo contendo 4,7 mililitros de meio completo. Em seguida, adicione cinco microgramas por mililitro de concentração final de sulfato de bleomicina. Para cada amostra, estabelecer um controle negativo.
Coloque o tubo em um termostato a 37 graus Celsius por duas horas. Centrifugar amostras a 540 G durante cinco minutos. Em seguida, adicione cinco mililitros de solução hipotônica ao pellet.
Em seguida, adicione 400 microlitros de solução pré-fixativa para causar hemólise. Centrifugar amostras a 540 G por cinco minutos e, em seguida, ressuspender o pellet em cinco mililitros de metanol à temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos para fixar as células. Centrifugar amostras a 540 G por cinco minutos e, em seguida, ressuspender o pellet em cinco mililitros de solução fixadora.
Repita esta etapa mais uma vez. Centrifugar novamente a 540 G por cinco minutos, em seguida, aspirar o sobrenadante deixando solução suficiente para ressuspender a pastilha. Solte a pastilha de célula ressuspensa nas lâminas.
Preparar as duas soluções contendo os anticorpos primários anti-Gamma H2AX e anti-53BP1 dissolvidos em solução de bloqueio. Em seguida, lave as lâminas duas vezes em PBS 1X. Em seguida, mantenha as lâminas por 30 minutos em solução de bloqueio.
Adicionar a cada lâmina 10 microlitros de cada uma das duas soluções contendo os anticorpos primários dissolvidos em solução de bloqueio. Cubra as lâminas com parafilme. Incubar a quatro graus Celsius durante a noite.
Após a incubação, realizar três lavagens em PBS 1X por cinco minutos. Preparar as duas soluções contendo os anticorpos secundários DyLight 488 e Alexa Fluor 568 dissolvidos em solução de bloqueio. Em seguida, adicione a cada lâmina 10 microlitros de cada uma das duas soluções contendo os anticorpos secundários dissolvidos em solução de bloqueio.
Cubra as lâminas com parafilme e incube à temperatura ambiente por duas horas. Após esta segunda incubação, realizar três lavagens em PBS 1X por cinco minutos. Adicionar 2,5 microlitros de solução Antifade com DAPI nas lamínulas da tampa antes da montagem para combater a mancha dos núcleos.
Para avaliar a cinética dos focos, o procedimento é o mesmo descrito anteriormente. A última fase é a observação e quantificação dos focos. Linfócitos humanos sem focos de Gamma H2AX e 53BP1 são mostrados em A, em B, e em C, linfócitos humanos com diferentes quantidades de focos de Gamma H2AX e 53BP1 são mostrados.
Observa-se baixo nível de co-localização dos focos. Como esperado, uma frequência muito maior de ambos os focos de Gamma H2AX e 53BP1 são observados entre as células não tratadas não tratadas. Observa-se, ainda, grande diferença no número de focos dos dois marcadores.
O curso temporal dos focos de Gamma H2AX e 53BP1 ao longo do tempo mostrou um comportamento diferente, embora contribuam para a mesma função. A análise dos focos de gama H2AX e 53BP1 tem a capacidade de avaliar a resposta celular em contextos de exposição ou patológicos. No entanto, a imunofluorescência dupla com Gamma H2AX e 53BP1 pode subestimar a verdadeira frequência do evento.
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Visão Geral
Este protocolo apresenta um método para avaliar a formação e reparo de quebras duplas na fita de DNA por meio da detecção simultânea de focos de γH2AX e 53BP1 em núcleos em interfase de linfócitos periféricos humanos tratados com bleomicina.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Genômica
Contexto
- Quebras de dupla fita podem ser induzidas por diversos fatores.
- As células possuem múltiplos mecanismos de reparo para danos no DNA.
- γH2AX e 53BP1 são proteínas-chave envolvidas no reparo do DNA.
- A co-localização dessas proteínas ocorre próximo a quebras de dupla fita.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a adequação da quantificação simultânea de focos de γH2AX e 53BP1.
- Avaliar os danos genômicos em linfócitos periféricos humanos.
- Compreender os efeitos da bleomicina na integridade do DNA.
Métodos Utilizados
- Amostras de sangue total são coletadas de sujeitos humanos.
- As amostras são tratadas com sulfato de bleomicina.
- Controles negativos são estabelecidos para comparação.
- A detecção de focos de γH2AX e 53BP1 é realizada em núcleos em intérfase.
Resultados Principais
- A detecção simultânea de focos de γH2AX e 53BP1 é viável.
- O tratamento com bleomicina provoca dano ao DNA mensurável.
- A quantificação dos focos correlaciona-se com a extensão do dano genômico.
- Os resultados apoiam o uso deste método para avaliar mecanismos de reparo do DNA.
Conclusões
- O protocolo avalia efetivamente a formação e reparação de quebras duplas na fita de DNA.
- A detecção simultânea de γH2AX e 53BP1 fornece informações valiosas.
- Este método pode ser aplicado a diversos estudos sobre dano e reparo do DNA.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A detecção quantitativa de marcadores de quebras duplas na fita de DNA (DSB), γH2AX e 53BP1, em linfócitos humanos permite uma avaliação precisa do dano genômico e da cinética de reparo. Essa abordagem de imunofluorescência dupla aumenta a confiança preditiva na triagem precoce de genotoxicidade e na redução de riscos mecanicistas para compostos candidatos. A integração dessas leituras na fase de descoberta apoia decisões de portfólio ajustadas ao risco e a continuidade translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta de vias de resposta a danos no DNA em células humanas.
- Apóia a desmistificação mecanicista mediante a quantificação da indução de quebras de fita dupla (DSB) e da cinética de reparo.
- Facilita a validação funcional de alvos envolvidos na estabilidade do genoma.
- Aprimora a confiança preditiva para riscos de genotoxicidade em compostos líderes.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece um sistema validado para quantificar marcadores de dano ao DNA em células humanas primárias.
- Permite leituras reproduzíveis e quantitativas de quebras de fita dupla induzidas por compostos.
- Apoia a padronização de ensaios para triagem de alto conteúdo de moduladores de dano ao DNA.
- Facilita a avaliação confiável dos perfis de segurança de compostos em triagens iniciais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a quantificação de marcadores de dano ao DNA com estratégias de biomarcadores translacionais.
- Apoia a continuidade desde a descoberta in vitro até a avaliação pré-clínica de segurança.
- Permite o avanço ajustado ao risco de candidatos com perfis favoráveis de reparo do DNA.
- Fornece subsídios mecanicistas sobre as respostas celulares relevantes para doenças e terapias.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de imunofluorescência dupla insere-se na fase de descoberta inicial até a fase pré-clínica, permitindo a avaliação orientada por hipóteses de danos e reparo do DNA em linfócitos humanos.
- Biologia de Descoberta: Quantifica focos de marcadores de quebras de dupla fita (DSB) para esclarecer o envolvimento das vias de reparo do DNA e desvio biológico de riscos.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos reprodutíveis para perfis de genotoxicidade de compostos.
- Análises: Oferece medidas ao longo do tempo de focos de γH2AX e 53BP1 para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro a estratégias de biomarcadores pré-clínicos para resposta ao dano no DNA.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliação de dano ao DNA em diversos programas de descoberta.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na avaliação de danos ao DNA.
- Valor Operacional: Padroniza a quantificação de marcadores de quebras de dupla fita para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguimento ou interrupção e reduz riscos biológicos em estágios avançados de genotoxicidade.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base em perfis de reparo do DNA.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia de imunofluorescência e análise quantitativa de imagens.
- Necessita acesso a anticorpos validados e infraestrutura para imagem de fluorescência.
- Exige padronização entre equipes nos protocolos de preparação de amostras e quantificação.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes tipos celulares ou sistemas modelo.
- Risco de subestimação da frequência real de quebras de dupla fita devido a limitações na co-localização de marcadores.
