Name: Imunofluorescência Dupla de γH2AX e 53BP1 em Linfócitos Periféricos Humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Aprenda a detectar simultaneamente γH2AX e 53BP1 em linfócitos periféricos humanos tratados com bleomicina para avaliar danos ao DNA e mecanismos de reparo. Este método permite quantificar focos de quebras de fita dupla.

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Somos gratos aos doadores de sangue total e a todo o pessoal de saúde que colheu as amostras de sangue.

O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Pisa, e consentimento informado e assinado foi obtido de cada doador.
1. Formação dos focos γH2AX e 53BP1
<ol><li>Preparação de amostras e tratamento mutagénico<ol><li>Coletar amostras de sangue total por punção venosa de indivíduos adultos saudáveis em tubos de coleta de sangue (por exemplo, Vacutainer) contendo heparina de lítio como anticoagulante.</li>
		<li>Para garantir a preservação adequada da amostra de sangue, inicie o procedimento em até 24 h após a amostragem.</li>
		<li>Adicionar 300 μL da amostra a um tubo contendo 4,7 mL de meio completo (penicilina-estreptomicina a 0,5%, fitohemaglutinina a 0,75%, SFB a 10% previamente inativado, RPMI 1640 a 88,75%).</li>
		<li>Em seguida, adicione sulfato de bleomicina a uma concentração final de 5 μg/mL. CUIDADO: O sulfato de bleomicina é um agente mutagênico. Evite o contato com a pele e a inalação. Prepare a solução e adicione a amostra sob um capuz.</li>
		<li>Para cada amostra, estabelecer um controlo negativo (ausência de agente mutagénico).</li>
		<li>Colocar o tubo num termóstato a 37 °C durante 2 horas.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixação<ol><li>Centrifugar amostras a 540 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet com vórtice.</li>
		<li>Adicionar 5 mL de solução hipotônica (2,87 g de KCl dissolvido em 500 mL de água deionizada) e 400 μL de solução pré-fixadora (ácido acético 5:3: metanol) para causar hemólise das hemácias.</li>
		<li>Centrifugar amostras a 540 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 5 mL de metanol à temperatura ambiente por pelo menos 30 min para fixar as células.</li>
		<li>Em alternativa, conservar as células a -20 °C até à utilização.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de slides<ol><li>Centrifugar amostras a 540 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 5 mL de uma solução de metanol: ácido acético 3:1. Repita essas etapas mais uma vez.</li>
		<li>No final, centrifugar novamente a solução a 540 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspirar novamente o sobrenadante deixando solução suficiente (0,5 mL) para ressuspender o pellet, pipetar vigorosamente, soltar o pellet de célula ressuspensa nas lâminas e secar ao ar. Conservar as lâminas a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Imunofluorescência NOTA: A imunofluorescência é um método imunológico para identificar alvos celulares específicos usando um anticorpo primário que se liga ao próprio alvo e um anticorpo secundário fluorescente que se liga ao primário que permite localizar o alvo11. Neste caso, um anti-53BP1 monoclonal de camundongo (1:50) e um anti-γH2AX policlonal de coelho (1:50) são usados como anticorpos primários, enquanto AlexaFluor568 anti-camundongo (1:400) e DyLight488 anti-coelho (1:200) são usados como anticorpos secundários, respectivamente.<ol><li>Lavar as lâminas duas vezes em 50 mL de PBS 1x por 5 min em frasco couplin (16 lâminas consecutivas).</li>
		<li>Em seguida, mantê-los por 30 min em solução de bloqueio (10 mL de FBS, 10 mL de PBS 10x, 80 mL de água deionizada, 300 μL de Triton-X).</li>
		<li>Adicionar a cada lâmina 10 μL de cada uma das duas soluções contendo os anticorpos primários dissolvidos na solução de bloqueio. Cubra as lâminas com fita adesiva de parafina e incube a 4 °C durante a noite.</li>
		<li>Após a incubação, realizar três lavagens em PBS 1x por 5 min.</li>
		<li>Adicionar a cada lâmina 10 μL de cada uma das duas soluções contendo os anticorpos secundários dissolvidos na solução de bloqueio. Cobrir as lâminas com fita parafínica e incubar à temperatura ambiente durante 2 h.</li>
		<li>Realize três lavagens em 1x PBS por 5 min.</li>
		<li>Adicionar 2,5 μL de solução antifade com DAPI nas lamínulas antes da montagem para contramanchar os núcleos. NOTA: Para avaliar a cinética dos focos, o procedimento é o mesmo descrito de 1,1 a 1,4, observando que a coleta de células e a imunofluorescência dupla são realizadas em 0 h, após 2 h pós-tratamento com bleomicina e depois, após a remoção do mutagênio, em 4 h, 6 h e 24 h pós-tratamento.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Análise através de microscópio de fluorescência
NOTA: "Microscópio de fluorescência" refere-se a qualquer microscópio que usa fluorescência para gerar uma imagem. O espécime é iluminado com luz de um comprimento de onda específico (ou comprimentos de onda) que é absorvida pelos fluoróforos, fazendo com que eles emitam luz de comprimentos de onda mais longos12. AlexaFluor568 e DyLight 488 absorvem luz de aproximadamente 568 e 488 nm e emitem luz de 603 e 520 nm, respectivamente. Assim, eles são visíveis como fluorescência vermelha ou verde usando um filtro TRITC ou FITC, respectivamente.
<ol><li>Pontuar a presença de focos em cada lâmina sob uma objetiva de imersão de 100x (Figura 1).</li>
	<li>Escore 200 núcleos por lâmina e conte o número de focos γH2AX/53BP1 em cada núcleo.</li>
	<li>Resultados expressos em termos do número médio de focos por núcleo total pontuado. Estes incluem núcleos γH2AX/53BP1 positivos (mostrando pelo menos um sinal de fluorescência) e negativos (não mostrando nenhum sinal de fluorescência).</li>
</ol>

<ol><li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+damage%2C+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).</li>
<li>Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+response+to+double-strand+DNA+breaks+and+their+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair.</a> Cells. 9 (8), 1853(2020).</li>
<li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Dickey, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Her, J., Bunting, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cells+ensure+correct+repair+of+DNA+double-strand+break%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%2C+Thematic+Minireview%22%5BJournal%5D)">How cells ensure correct repair of DNA double-strand break.</a> Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).</li>
<li>Kuo, L. K., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3-H2AX+-+A+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).</li>
<li>Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+of+the+53BP1+protein+in+genome+protection%3A+structural+and+functional+characteristics+of+53BP1-dependent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair.</a> Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).</li>
<li>Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+microscopy+of+%CE%B3H2AX+and+53BP1+for+analyzing+the+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), 56617(2017).</li>
<li>Jezkova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particles+with+similar+LET+values+generate+DNA+breaks+of+different+complexity+and+reparability%3A+a+high-resolution+microscopy+analysis+of+%CE%B3H2AX%2F53BP1+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci.</a> Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).</li>
<li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+nuclear+phosphorylation+%28%CE%B3-H2AX%29+in+human+lymphocytes+treated+in+vitro+with+UVB%2C+bleomycin+and+mitomycin+C%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C.</a> Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).</li>
<li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li>
<li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSanderson%2C+MJ+%22Fluorescence+microscopy%22">Fluorescence microscopy</a>. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of the cell membrane.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li>
<li>Hecht, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleomycin%3A+New+perspectives+on+the+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+Products%22%5BJournal%5D)">Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action.</a> Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).</li>
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<li>Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+ionizing+radiation-induced+DNA+double-strand+breaks+by+non-homologous+end-joining%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining.</a> Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).</li>
<li>Palla, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX%3A+Can+it+be+established+as+a+classical+cancer+prognostic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor.</a> Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931(2017).</li>
<li>Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwaves+from+GSM+mobile+telephones+affect+53BP1+and+gamma-H2AX+foci+in+human+lymphocytes+from+hypersensitive+and+healthy+persons%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons.</a> Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).</li>
<li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+damage+in+peripheral+lymphocytes+of+obese+and+overweight+Italian+children+as+evaluated+by+the+%CE%B3-H2AX+focus+assay+and+micronucleus+test%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test.</a> The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).</li>
<li>Shanbhag, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+neuronal+accumulation+of+DNA+double-strand+breaks+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communication%22%5BJournal%5D)">Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77(2019).</li>
<li>Lassmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+of+gamma-H2AX+and+53BP1+DNA+repair+foci+in+blood+cells+after+radioiodine+therapy+of+differentiated+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).</li>
<li>Derlin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+%CE%B3-H2AX+and+53BP1+foci+in+peripheral+blood+lymphocytes+to+predict+subclinical+hematotoxicity+and+response+in+somatostatin+receptor-targeted+radionuclide+therapy+for+advanced+gastroenteropancreatic+neuroendocrine+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors.</a> Cancers (Basel). 13 (7), 1516(2021).</li>
<li>Djuzenova, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosensitivity+in+breast+cancer+assessed+by+the+histone+%CE%B3-H2AX+and+53BP1+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci.</a> Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).</li>
<li>Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+DNA+double-strand+breaks+-+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A análise por imunofluorescência dos focos γH2AX e 53BP1 é um método adequado para avaliar danos genômicos em núcleos interfásicos de um sistema celular. Esse procedimento possui vários pontos críticos que podem afetar o resultado dos experimentos, principalmente, os agentes utilizados na fixação e permeabilização, o tipo de anticorpos e seus fatores de diluição, e a concentração do mutagênico.
A manutenção da integridade proteica é fundamental, uma vez que o método de imunofluorescência esper...

O dano ao DNA é continuamente induzido por agentes que podem ser endógenos, como as EROs geradas pelo metabolismo oxidativo celular, ou exógenos, tanto químicos quanto físicos1. Dentre as lesões mais lesivas, as quebras de dupla fita (DSBs) têm papel fundamental na contribuição para a instabilidade genômica, uma vez que causam aberrações cromossômicas que, por sua vez, podem iniciar o processo de carcinogênese. Assim, as células são providas de mecanismos complexos e eficientes de reparo deDSBs 2.
Quando ocorre um DSB, a célula desencadeia a resposta de dano ao DNA (DDR) onde, juntamente com o complexo MRE11/RAD50/NBS1, as quinases ATM ou ATR são recrutadas para ativar outras proteínas que retardam ou interrompem o ciclo celular3. Um alvo essencial dessas quinases é a histona H2AX, que é fosforilada em Ser-139 dentro de algumas megabases dos DSBs (ou seja, γH2AX), permitindo assim o recrutamento de vários fatores de reparo, tais como, entre outros, BRCA1 e proteína ligadora de p53 1 (53BP1)3. Posteriormente, uma via entre recombinação homóloga (HR), junção final não homóloga (NHEJ) ou recozimento de fita simples (SSA) é acionada para reparar os DSBs 4,5. Portanto, o 53BP1 está envolvido em ditar a escolha entre FC ou EJNH, promovendo principalmente a ativação do NHEJ ao invés da FC6. Além disso, tanto a forma fosforilada da histona H2AX quanto a 53BP1 podem formar focos nos sítios dos DSBs. Como esses focos persistem até que a integridade da dupla fita seja restaurada, avaliar o aparecimento/desaparecimento dos focos γH2AX ou 53BP1 em um intervalo de tempo é considerado um método útil para avaliar a ocorrência e o reparo de DSBs em um sistema celular 6,7. No entanto, de acordo com os processos moleculares descritos acima, uma vez que se espera que os focos de γH2AX e 53BP1 co-localizem próximos aos DSBs durante aDDR8,9, pode ser útil detectar concomitantemente a presença desses marcadores em uma imunofluorescência dupla.
Assim, o objetivo deste artigo foi avaliar a adequação da quantificação simultânea dos focos γH2AX e 53BP1 para avaliar o dano genômico induzido em linfócitos periféricos humanos pelo agente radiomimético bleomicina. Usando a mesma metodologia, também tentamos delinear a cinética de reparo de DSBs induzidos por bleomicina de acordo com um procedimento experimental previamente estabelecido10.

<table><tbody><tr><td>AlexaFluor 568 cabra anti-rato IgG (&gamma; 1)</td> <td>Invitrogen</td><td>A21124</td><td>53BP1 anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Bleoprim</td><td>Sanofi</td><td></td><td>bleomicina sulfato (mutagênico)</td></tr> <tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina 100X</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td>antibióticos para meio</td></tr><tr><td>de cultura PBS 10X</td><td>Termofisher</td><td>14200075</td><td>solução salina tamponada com fosfato</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Euroclone</td><td>EC20180L</td><td>Soro Fetal Bovino para imunofluorescência</td></tr><tr><td>IgG anti-coelho de cabra (H+L) DyLight 488 Coniugated</td><td>Termofisher</td><td>#35552</td><td>&gamma; Anticorpo secundário H2AX</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal de camundongo anti-53BP1</td><td>Merck</td><td>MAB 3802</td><td>53BP1 anticorpo primário</td></tr><tr><td>Labophot 2</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscópio de fluorescência</td></tr><tr><td>P-histona H2AX (Ser139) anticorpo de coelho</td><td>Sinalização celular</td><td>#2577</td><td>&gama; Anticorpo primário H2AX</td></tr><tr><td>Fitohemoaglutinina</td><td>Termofisher R30852801</td><td></td><td>componente do meio de cultura</td></tr><tr><td>Prolongue o reagente antidesbotamento de ouro com DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>#8961</td><td>Solução antidesbotamento com DAPI para contracoloração</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L</td><td>Meio de cultura</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Detergente não iônico para permeabilização</td></tr></tbody></table>

imunofluorescência dupla de γh2ax e 53bp1 em linfócitos periféricos humanos

Dual Immunofluorescence of &#947;H2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes

As quebras de fita dupla (DSBs) são uma das lesões mais graves que podem ocorrer nos núcleos celulares e, se não reparadas, podem levar a desfechos graves, incluindo câncer. A célula é, portanto, provida de mecanismos complexos para reparar DSBs, e essas vias envolvem histona H2AX em sua forma fosforilada em Ser-139 (ou seja, γH2AX) e proteína ligadora de p53 1 (53BP1). Como ambas as proteínas podem formar focos nos sítios dos DSBs, a identificação desses marcadores é considerada um método adequado para estudar tanto os DSBs quanto sua cinética de reparo. De acordo com os processos moleculares que levam à formação dos focos γH2AX e 53BP1, poderia ser mais útil investigar sua co-localização perto dos DSBs, a fim de estabelecer uma abordagem alternativa que permita quantificar os DSBs pela detecção simultânea de dois marcadores de dano ao DNA. Assim, este protocolo tem como objetivo avaliar o dano genômico induzido em linfócitos humanos pelo agente radiomimético bleomicina através da presença de focos γH2AX e 53BP1 em imunofluorescência dupla. Usando essa metodologia, também delineamos a variação no número de focos γH2AX e 53BP1 ao longo do tempo, como uma tentativa preliminar de estudar a cinética de reparo de DSBs induzidos por bleomicina.

Os dados obtidos pela análise em microscópio de fluorescência de linfócitos periféricos permitem avaliar três aspectos principais: a eficácia do tratamento com bleomicina em aumentar o número de focos γH2AX e 53BP1 (e, portanto, de DSBs) devido ao seu efeito mutagênico, em que medida ambos os focos co-localizados no local dos DSBs e o tempo-curso dos focos γH2AX e 53BP1 para delinear a cinética de reparo de DSBs induzidos por bleomicina. Como esperado, uma frequência muito maior de focos γH2AX e 53BP1 foi observada entre...

Este protocolo apresenta um método para avaliar a formação e o reparo de quebras de dupla fita de DNA através da detecção simultânea de focos de γH2AX e 53BP1 em núcleos interfásicos de linfócitos periféricos humanos tratados com bleomicina.

Imunofluorescência Dupla de γH2AX e 53BP1 em Linfócitos Periféricos Humanos

Double strand breaks (DSBs) are one of the most severe lesions that can occur in cell nuclei, and, if not repaired, they can lead to severe outcomes, ...

O objetivo deste artigo foi avaliar a adequação da quantificação simultânea dos focos Gamma H2AX e 53BP1 para avaliar o dano genômico induzido em linfócitos periféricos humanos pela bleomicina. Vários fatores podem causar quebras de dupla corda. As células são, portanto, providas de vários mecanismos de reparo, envolvendo tanto a Gamma H2AX quanto a 53 Binding Protein 1, que podem co-localizar perto da quebra da fita dupla.Após a coleta de amostras de sangue total, adicionar 300 microlitros de amostra a um tubo contendo 4,7 mililitros de meio completo. Em seguida, adicione cinco microgramas por mililitro de concentração final de sulfato de bleomicina. Para cada amostra, estabelecer um controle negativo.Coloque o tubo em um termostato a 37 graus Celsius por duas horas. Centrifugar amostras a 540 G durante cinco minutos. Em seguida, adicione cinco mililitros de solução hipotônica ao pellet.Em seguida, adicione 400 microlitros de solução pré-fixativa para causar hemólise. Centrifugar amostras a 540 G por cinco minutos e, em seguida, ressuspender o pellet em cinco mililitros de metanol à temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos para fixar as células. Centrifugar amostras a 540 G por cinco minutos e, em seguida, ressuspender o pellet em cinco mililitros de solução fixadora.Repita esta etapa mais uma vez. Centrifugar novamente a 540 G por cinco minutos, em seguida, aspirar o sobrenadante deixando solução suficiente para ressuspender a pastilha. Solte a pastilha de célula ressuspensa nas lâminas.Preparar as duas soluções contendo os anticorpos primários anti-Gamma H2AX e anti-53BP1 dissolvidos em solução de bloqueio. Em seguida, lave as lâminas duas vezes em PBS 1X. Em seguida, mantenha as lâminas por 30 minutos em solução de bloqueio.Adicionar a cada lâmina 10 microlitros de cada uma das duas soluções contendo os anticorpos primários dissolvidos em solução de bloqueio. Cubra as lâminas com parafilme. Incubar a quatro graus Celsius durante a noite.Após a incubação, realizar três lavagens em PBS 1X por cinco minutos. Preparar as duas soluções contendo os anticorpos secundários DyLight 488 e Alexa Fluor 568 dissolvidos em solução de bloqueio. Em seguida, adicione a cada lâmina 10 microlitros de cada uma das duas soluções contendo os anticorpos secundários dissolvidos em solução de bloqueio.Cubra as lâminas com parafilme e incube à temperatura ambiente por duas horas. Após esta segunda incubação, realizar três lavagens em PBS 1X por cinco minutos. Adicionar 2,5 microlitros de solução Antifade com DAPI nas lamínulas da tampa antes da montagem para combater a mancha dos núcleos.Para avaliar a cinética dos focos, o procedimento é o mesmo descrito anteriormente. A última fase é a observação e quantificação dos focos. Linfócitos humanos sem focos de Gamma H2AX e 53BP1 são mostrados em A, em B, e em C, linfócitos humanos com diferentes quantidades de focos de Gamma H2AX e 53BP1 são mostrados.Observa-se baixo nível de co-localização dos focos. Como esperado, uma frequência muito maior de ambos os focos de Gamma H2AX e 53BP1 são observados entre as células não tratadas não tratadas. Observa-se, ainda, grande diferença no número de focos dos dois marcadores.O curso temporal dos focos de Gamma H2AX e 53BP1 ao longo do tempo mostrou um comportamento diferente, embora contribuam para a mesma função. A análise dos focos de gama H2AX e 53BP1 tem a capacidade de avaliar a resposta celular em contextos de exposição ou patológicos. No entanto, a imunofluorescência dupla com Gamma H2AX e 53BP1 pode subestimar a verdadeira frequência do evento.

dual-immunofluorescence-h2ax-53bp1-human-peripheral

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Quantificação de DNA dupla fita-estrias usando formação γH2AX como um marcador molecular tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia da radiação. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para a quantificação dos focos γH2AX após a exposição das células à radiação.

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

Quantificação de DNA dupla fita-breaks, com base em γH2AX focos tem se tornado uma ferramenta valiosa, especialmente na biologia da radiação, para a avaliação da radiossensibilidade de tecidos e os efeitos de compostos de radiação modificando. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para quantificação de γH2AX focos em amostras de tecido.

Quantificação de γH2AX Focos em amostras de tecido

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Este manuscrito fornece um protocolo de análise de quebras de DNA dobro-costa pela microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1.

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Reparação de quebras de DNA dobro-costa é um processo dinâmico, que exige não só a formação de complexos de reparação em intervalos, mas também sua resolução após a lesão é dirigida. Aqui, usamos microscopia de imunofluorescência para quebras de dupla-hélice transitórias e duradouro como uma ferramenta para dissecar esse mecanismo de manutenção do genoma.

Caracterizando os processos de reparação do DNA no transitório e duradouro dobro-Costa quebras de DNA pela microscopia de imunofluorescência

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Um método automatizado de pontuação microscópica para o ensaio de γ-H2AX Foci em Linfócitos de Sangue Periféricos Humanos

Aqui, apresentamos um protocolo simples e rápido para a detecção de interação proteica em locais de dano ao DNA.

Ensaio de ligante de proximidade para localizar proteínas em locais de dano ao DNA

Aprenda a detectar simultaneamente γH2AX e 53BP1 em linfócitos periféricos humanos tratados com bleomicina para avaliar danos ao DNA e mecanismos de reparo. Este método permite quantificar focos de quebras de fita dupla.

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