Name: Métodos para Incorporação de Reações de Síntese Proteica Livre de Células em Hidrogéis em Macroescala (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Aprenda a incorporar reações de síntese proteica livre de células em hidrogéis de agarose usando lisados de E. coli. Este método permite desenvolver dispositivos diagnósticos portáteis com capacidades de detecção inovadoras.

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Os autores agradecem imensamente o apoio dos prêmios BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) e BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.) e EP/N026683/1 (A.L., T.P.H.) do Conselho de Pesquisa em Engenharia e Ciências Físicas - Laboratórios de Ciência e Tecnologia de Defesa (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Os dados que suportam esta publicação estão disponíveis em: 10.25405/data.ncl.22232452. Para fins de acesso aberto, o autor aplicou uma licença Creative Commons Attribution (CC BY) a qualquer versão do Autor Aceito do Manuscrito que surgir.

1. Tampão de lisado celular e preparação do meio
<ol><li>Preparo de 2x ágar YT+P e meio<ol><li>Preparar 2x ágar YT+P medindo 16 g/L de triptona, 10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl, 40 mL/L de 1 M K 2 HPO4, 22 mL/L de 1 M KH2PO4 e 15 g/L de ágar. Para o caldo 2x YT+P, siga a composição anterior, mas omita o ágar.</li>
		<li>Esterilizar autoclavando a 2x YT+P.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do buffer S30A<ol><li>Preparar o tampão S30A com 5,88 g/L de Mg-glutamato, 12,195 g/L de K-glutamato e 25 mL/L de Tris 2 M, ajustado para pH 7,7 com ácido acético.</li>
		<li>Conservar o tampão S30A a 4 °C durante um período máximo de 1 semana.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do tampão S30B<ol><li>Preparar o tampão S30B com 5,88 g/L Mg-glutamato e 12,195 g/L K-glutamato, ajustado para pH 8,2 com Tris 2 M.</li>
		<li>Conservar o tampão S30B a 4 °C durante até 1 semana.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação do lisado celular (protocolo de 4 dias)
<ol><li>Dia 1<ol><li>Despeje o 2x YT+P em placas de ágar suplementadas com 100 μg/mL de ampicilina.</li>
		<li>Streak E. coli a partir de -80 °C estoque de glicerol, e incubar durante a noite a 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 2<ol><li>Inocular uma única colônia da placa 2x YT+P em 400 mL de caldo 2x YT+P (suplementado com ampicilina) em um balão defletor de 1 L.</li>
		<li>Incubar durante 24 h a 37 °C com agitação a 220 rpm.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 3<ol><li>Medir e registrar o OD600 das culturas de 24 h; o crescimento é suficiente em um OD600 de 3-4. NOTA: Tomar uma alíquota de 1 mL de cultura bacteriana e realizar uma diluição seriada com meio (2x caldo YT+P) antes de medir o OD600 nm. Ter em conta o efeito de diluição no cálculo do OD600.</li>
		<li>Transfira a cultura uniformemente entre frascos de centrífuga de 500 mL pré-resfriados.</li>
		<li>Centrifugar a 4.500 x g durante 15 min a 4 °C e, em seguida, eliminar o sobrenadante.</li>
		<li>Durante a centrifugação, complete a preparação do tampão S30A adicionando 2 mL/L de TDT 1 M ao tampão S30A previamente preparado, misturando e mantendo o tampão no gelo.</li>
		<li>Ressuspender os pellets de células em 200 mL de tampão S30A.</li>
		<li>Vórtice os frascos vigorosamente até que todo o pellet esteja completamente solubilizado, mantendo as células no gelo o máximo possível.</li>
		<li>Centrifugar a 4.500 x g durante 15 min a 4 °C e, em seguida, eliminar o sobrenadante.</li>
		<li>Repita as etapas 2.3.5-2.3.7 (inclusive).</li>
		<li>Adicionar 40 mL de tampão S30A a cada frasco de centrífuga, ressuspender os pellets e transferir para tubos de centrífuga de 50 mL pré-pesados.</li>
		<li>Centrifugar a 4.000 x g por 15 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante por decantação e remova o sobrenadante residual por pipeta, mantendo-o no gelo o máximo possível.</li>
		<li>Pese novamente os tubos da centrífuga, registre a nova massa e calcule a massa dos pellets.</li>
		<li>Congele os pellets em nitrogênio líquido e armazene-os a -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 4<ol><li>Descongele os pellets no gelo.</li>
		<li>Por 1 g de pastilha, adicionar o seguinte: 1,2 ml de tampão S30A (TDT adicionado antes da utilização), 275 μL de inibidor de protease (8 mM stock) e 25 μL de lisozima (10 mg/ml stock).</li>
		<li>Vórtice vigorosamente até que os pellets estejam completamente solubilizados sem grumos remanescentes, mantendo-os no gelo tanto quanto possível.</li>
		<li>Em tubos de centrífuga de 50 mL, sonicar as suspensões celulares a 120 W, 20 kHz, 30% de amplitude e pulsos liga/desliga de 20 s/40 s por 5 min de sonicação.</li>
		<li>Centrifugar a 4.000 x g por 1 h a 4 °C para pellet os detritos celulares.</li>
		<li>Transfira o sobrenadante para tubos de centrífuga frescos de 50 mL.</li>
		<li>Incubar tubos a 37 °C a 220 rpm durante 80 min.</li>
		<li>Preparar materiais de diálise adicionando 1 mL/L de TDT 1 M ao tampão S30B. Misture e adicione 900 mL a um copo estéril de 1 L. Adicione um agitador magnético e mantenha-o a 4 °C.</li>
		<li>Após a reação de escoamento, transferir o extrato celular da etapa 2.4.7 para tubos de microcentrífuga de 2 mL e centrifugar a 20.000 x g por 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Consolidar o sobrenadante sem pellets no gelo em um tubo centrífugo de 50 mL.</li>
		<li>Determinar o volume total de extrato celular produzido e hidratar o número necessário de de diálise de 10K MWCO submergindo-os em S30B por 2 min.</li>
		<li>Carregar os através de uma seringa com até 3 mL de extrato. Diálise até três por copo de 1 L, agitando a 4 °C durante 3 h.</li>
		<li>Após a diálise estar completa, o que esclarece o extrato, transfira o extrato para tubos de microcentrífuga de 2 mL. Centrifugar a 20.000 x g por 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Consolidar o extrato clarificado em um tubo de centrífuga fresco sobre gelo e vórtice brevemente para misturar.</li>
		<li>Determinar a concentração de proteína do extrato usando um fluorômetro.</li>
		<li>Diluir o extracto até uma concentração de 44,5 mg/ml utilizando ddH2O pré-refrigerado.</li>
		<li>Alíquota em alíquotas de 200 μL, congelar em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparação de hidrogéis liofilizados (Método A)
<ol><li>Pesar 0,75 g de agarose, adicionar ddH2O a um volume de 100 mL e micro-ondas em rajadas de 30 s em altas temperaturas para criar caldo de agarose derretida.</li>
	<li>Usando uma pipeta, transfira 50 μL de agarose fundida para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e deixe o gel polimerizar por 20-30 min (a polimerização ocorre mais rapidamente se os géis forem transferidos para uma geladeira).</li>
	<li>Congelar os tubos de microcentrífuga, contendo os géis polimerizados, em nitrogênio líquido.</li>
	<li>Remova a tampa dos tubos da centrífuga, cubra as aberturas do tubo da centrífuga com filme de cera e perfure a película várias vezes com uma ponta de agulha ou pipeta.</li>
	<li>Transfira os tubos de microcentrífuga contendo os géis polimerizados para armazenamento de −80 °C por 1-2 h.</li>
	<li>Recupere os tubos de centrífuga do armazenamento de -80 °C e coloque em um liofilizador, garantindo que os tubos estejam completamente secos.</li>
	<li>Acione o liofilizador com as seguintes configurações: temperatura: -20 °C, pressão: 0,1 mbar.</li>
	<li>Deixe o gel liofilizar durante a noite.</li>
	<li>Recupere os géis do liofilizador e coloque-os em armazenamento de -80 °C até que seja necessário. NOTA: Os géis podem ser armazenados liofilizados por até 1 ano.</li>
</ol>4. Preparação do estoque de solução energética 14x
<ol><li>Combinar todos os componentes da reação (Tabela 1) em um tubo de centrífuga de 15 mL sobre gelo para produzir uma solução de energia de 14x.</li>
	<li>Aliquot a solução de energia 14x em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e armazenar a -80 °C (alíquotas de menor volume podem ser usadas). NOTA: A solução de energia 14x pode ser armazenada durante vários meses a -80 °C se for evitado o congelamento-descongelamento repetido dos tubos.</li>
</ol>5. Preparação do estoque de aminoácidos 4x
<ol><li>Descongele, no gelo, todos os 20 componentes de aminoácidos de um kit RTS Amino Acid Sampler. Vórtice os aminoácidos para garantir que eles estão completamente dissolvidos.</li>
	<li>Em um tubo de centrífuga de 50 mL, combinar todos os 20 aminoácidos e adicionar 12 mL de vórtice ddH2O. estéril até que a solução fique clara, com apenas uma leve névoa de coloração branca.</li>
	<li>Aliquot os aminoácidos 4x em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (alíquotas de 500 μL).</li>
	<li>Congele rapidamente as alíquotas da solução de aminoácidos 4x em nitrogênio líquido e mova as alíquotas para armazenamento de -80 °C.</li>
</ol>6. Calibração do tampão livre de células
NOTA: O tampão CFPS usado para as reações de hidrogel foi calibrado para as concentrações ótimas de TDT, Mg-glutamato e K-glutamato seguindo o protocolo de Banks et al.34 modificado de Sun et al.35. As composições das reações de calibração foram selecionadas pelo método de planejamento de experimentos (DOE), sendo selecionados sete níveis fatoriais para K-glutamato (200 mM, 400 mM, 600 mM, 1.000 mM, 1.200 mM, 1.400 mM), Mg-glutamato (0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) e TDT (0 mM, 5, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM) estoques. O JMP Pro 15 foi usado para gerar um desenho DOE personalizado (Tabela 2) e conduzir a análise para determinar as concentrações ótimas dos fatores.
<ol><li>Recupere o extrato livre de células do armazenamento de -80 °C e descongele no gelo.</li>
	<li>Descongelar os aminoácidos 4x, solução energética 14x, PEG-8000 40%, DNA plasmidial, 3 M K-glutamato, 100 mM Mg-glutamato e 100 mM TDT estoques no gelo.</li>
	<li>Crie uma mistura mestre de calibração combinando 12,5 μL dos aminoácidos 4x, 3,57 μL da solução energética 14x, 2,5 μL de PEG-8000 a 40%, 3 μg de DNA plasmidial e 10 μL de extrato livre de células (44,5 mg/mL) e faça até 35 μL por reação com ddH2O.</li>
	<li>Distribua os 35 μL da mistura mestra nos poços de uma placa preta de microtitulação de 384 poços.</li>
	<li>Seguindo o desenho do DOE, adicione o volume apropriado de Mg-glutamato, K-glutamato e TDT a cada reação, juntamente com ddH2O para fazer com que cada reação atinja 50 μL.</li>
	<li>Transfira a placa de microtitulação para um leitor de placas para detecção e análise de fluorescência usando as configurações do leitor de placas descritas (para mCherry): excitação: 587 nm, emissão: 610 nm, largura de banda de comprimento de onda: 12 nm, óptica: topo, temperatura: 37 °C, com leituras de fluorescência sendo coletadas a cada 5 min por 4 h de tempo total de leitura. Incubar as placas com agitação em uma configuração pulsada a 60 rpm.</li>
	<li>Carregue os resultados no projeto JMP DOE e gere um perfil de previsão para determinar os níveis ideais de concentração para K-glutamato, Mg-glutamato e TDT com base nas variáveis de resposta desejadas; Neste caso, a fluorescência máxima e a taxa de reação foram as variáveis resposta.</li>
	<li>Combine os reagentes conforme mostrado na Tabela 3 para criar o buffer CFPS 2X</li>
	<li>Alíquota e armazenamento a -80 °C</li>
</ol>7. CFPS em hidrogéis liofilizados reidratados (Método A)
NOTA: Os plasmídeos utilizados nas reações de CFPS foram criados usando componentes da ferramenta modular EcoFlex para E. coli36 e descritos em Whitfield et al.11 O mCherry e o eGFP estavam sob o controle do promotor JM23100 constitutivo. Esses componentes estão disponíveis no Addgene.
<ol><li>Recupere o extrato livre de células do armazenamento de -80 °C e descongele no gelo por aproximadamente 20 min.</li>
	<li>Coletar o tampão CFPS 2x e o DNA plasmidial e descongelar no gelo.</li>
	<li>Recolha os hidrogéis liofilizados e deixe-os atingir a temperatura ambiente durante 15 minutos, deixando os géis em pé no banco.</li>
	<li>Transfira os géis para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, aparando os géis com bisturi, se necessário, para que caibam nos poços.</li>
	<li>Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, combinar 10 μL de extrato livre de células com 25 μL de tampão 2x CFPS e 4 μg de DNA plasmidial; perfazer um volume total de 50 μL com ddH2O para criar a solução CFPS.</li>
	<li>Pipetar a solução CFPS para os hidrogéis liofilizados.</li>
	<li>Deixe os géis de molho no sistema CFPS por 5-10 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfira os géis para uma placa de microtitulação preta de 384 poços usando uma espátula.</li>
	<li>Transfira a placa de microtitulação para um leitor de placas para detecção e análise de fluorescência usando as configurações do leitor de placas descritas na etapa 6.6. Resultados representativos estão disponíveis em estudos prévios31,33.</li>
</ol>8. Síntese de proteínas livres de células em hidrogéis destacáveis (Método B)
<ol><li>Recupere o extrato livre de células do armazenamento de -80 °C e descongele no gelo por aproximadamente 20 minutos.</li>
	<li>Coletar o DNA plasmidial e descongelar no gelo.</li>
	<li>Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL sobre gelo, combinar 10 μL de extrato livre de células com 3 μg de DNA plasmidial e 25 μL de tampão 2x CFPS, perfazendo um volume total de 37,5 μL.</li>
	<li>Meça 3 g de agarose e adicione a 100 mL de tampão ddH2O para criar 3% de agarose.</li>
	<li>Micro-ondas a 3% agarose em 30 s explosões em alta potência.</li>
	<li>Pipetar 12,5 μL de agarose fundida em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL contendo mistura de CFPS para um volume total de 50 μL.</li>
	<li>Deixe a agarose fundida arrefecer, mas não polimerize, deixando a agarose num bloco térmico regulado para 50 °C.</li>
	<li>Combinar a agarose fundida com a solução CFPS; misturar através de pipetagem e agitação com a ponta, e certifique-se de mover-se rapidamente para evitar a polimerização em gel antes que a solução CFPS possa ser misturada.</li>
	<li>Deixe os géis arrefecerem à temperatura ambiente e polimerizem durante aproximadamente 2 min.</li>
	<li>Transferir a agarose polimerizada para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL com espátula e congelar em nitrogênio líquido.</li>
	<li>Coloque os hidrogéis congelados em -80 °C durante 1 h.</li>
	<li>Recuperar os géis do armazenamento; Remova as tampas dos tubos de microcentrífuga, cubra os tubos com filme de cera e perfure o filme para permitir que a umidade seja seca.</li>
	<li>Acione o liofilizador com as seguintes configurações: temperatura: -20 °C, pressão: 0,1 mbar, liofilização por 18 h (durante a noite).</li>
	<li>Conservar os dispositivos CFPS liofilizados em armazenamento de -80 °C até à utilização.</li>
	<li>Os dispositivos CFPS liofilizados, com um volume úmido aproximado de 50 μL, podem ser reidratados com 50 μL de ddH2O sem excesso de líquido. A reidratação leva aproximadamente 30 min.</li>
	<li>Transfira os géis para uma placa de microtitulação preta de 384 poços usando uma espátula.</li>
	<li>Transfira a placa de microtitulação para um leitor de placas para detecção e análise de fluorescência usando as configurações do leitor de placas descritas na etapa 6.6. Resultados representativos estão disponíveis em publicações anteriores31,33.</li>
</ol>

Incorporando reações de CFPS em uma variedade de matrizes de hidrogel

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</ol>

Aqui são descritos dois protocolos para a incorporação de reações CFPS baseadas em lisado celular de E. coli em hidrogéis de agarose. Esses métodos permitem a expressão gênica simultânea em todo o material. O protocolo pode ser adaptado para outros sistemas CFPS e tem sido conduzido com sucesso com kits CFPS disponíveis comercialmente, além dos lisados celulares preparados em laboratório detalhados aqui. É importante ressaltar que o protocolo permite a expressão gênica na ausência de uma fase líquida externa. Is...

A biologia sintética integra diversas disciplinas de engenharia para projetar e projetar peças, dispositivos e sistemas de base biológica que podem executar funções que não são encontradas na natureza. A maioria das abordagens da biologia sintética ainda está ligada a células vivas. Por outro lado, sistemas de biologia sintética livres de células facilitam níveis sem precedentes de controle e liberdade no projeto, permitindo maior flexibilidade e um tempo reduzido para a engenharia de sistemas biológicos, ao mesmo tempo em que eliminam muitas das restrições dos métodos tradicionais de expressão gênica baseados em células 1,2,3. A CFPS está sendo usada em um número crescente de aplicações em várias disciplinas, incluindo a construção de células artificiais, prototipagem de circuitos genéticos, desenvolvimento de biossensores e produção de metabólitos 4,5,6. A SDFC também tem sido particularmente útil para a produção de proteínas recombinantes que não podem ser prontamente expressas em células vivas, como proteínas propensas à agregação, proteínas transmembrana e proteínas tóxicas 6,7,8.
A CFPS é tipicamente realizada em reações líquidas. Isso, no entanto, pode restringir sua implantação em algumas situações, já que qualquer dispositivo livre de células líquidas deve estar contido dentro de um recipiente de reação. A justificativa para o desenvolvimento dos métodos aqui apresentados foi fornecer protocolos robustos para incorporar dispositivos de biologia sintética livres de células em hidrogéis, não como uma plataforma de produção de proteínas em si, mas, em vez disso, permitir o uso de hidrogéis como um chassi físico para a implantação de dispositivos livres de células além do laboratório. O uso de hidrogéis como chassi CFPS tem várias vantagens. Os hidrogéis são materiais poliméricos que, apesar de apresentarem alto teor de água (às vezes superior a 98%), possuem propriedades sólidas 9,10,11. Têm uso como pastas, lubrificantes e adesivos e estão presentes em produtos tão diversos como lentes de contato, curativos, fitas adesivas marinhas, corretivos de solo e fraldas infantis 9,11,12,13,14. Os hidrogéis também estão sob investigação ativa como veículos de entrega de drogas 9,15,16,17. Os hidrogéis também podem ser biocompatíveis, biodegradáveis e possuir respostas a estímulos próprios9,18,19,20. Portanto, o objetivo aqui é criar uma sinergia entre a funcionalidade derivada da biologia molecular e a ciência dos materiais. Para tanto, esforços têm sido feitos para integrar a biologia sintética livre de células com uma variedade de materiais, incluindo colágeno, laponita, poliacrilamida, fibrina, peptídeo PEG e agarose 11,21,22, bem como para revestir superfícies de vidro, papel e pano11,23,24 com dispositivos CFPS. Os protocolos aqui apresentados demonstram dois métodos para incorporar reações CFPS em matrizes de hidrogel em macroescala (i.e., >1 mm), usando agarose como material exemplar. A agarose foi escolhida devido à sua alta capacidade de absorção de água, propriedades autogelificantes controladas e propriedades mecânicas ajustáveis 11,24,25,26. Agarose também suporta CFPS funcional, é mais barato do que muitas outras alternativas de hidrogel, e é biodegradável, tornando-se uma escolha atraente como um sistema modelo experimental. Esses métodos, no entanto, foram previamente demonstrados como apropriados para incorporar CFPS em uma variedade de hidrogéis alternativos11. Considerando a ampla gama de aplicações dos hidrogéis e a funcionalidade da CFPS, os métodos aqui demonstrados podem fornecer uma base a partir da qual os pesquisadores são capazes de desenvolver materiais hidrogéis biologicamente aprimorados adequados aos seus próprios fins.
Em estudos anteriores, sistemas de microgel com faixa de tamanho de 1 μm a 400 μm foram utilizados para realizar CFPS em hidrogéis submersos em tampão de reação 23,27,28,29,30,31. A exigência de submergir hidrogéis dentro de tampões de reação CFPS, no entanto, limita as oportunidades para sua implantação como materiais por direito próprio. Os protocolos aqui apresentados permitem que as reações de CFPS ocorram dentro de hidrogéis sem a necessidade de submergir os géis em tampões de reação. Em segundo lugar, o uso de géis de macroescala (entre 2 mm e 10 mm de tamanho) permite o estudo da interação física entre hidrogéis e expressão gênica livre de células. Por exemplo, com essa técnica, é possível estudar como a matriz de hidrogel afeta as reações de CFPS11 e como as reações de CFPS podem afetar a matriz de hidrogel31. Tamanhos maiores de hidrogéis também permitem o desenvolvimento de novos materiais bioprogramáveis32. Finalmente, ao incorporar reações CFPS em hidrogéis, há também uma redução potencial na necessidade de vasos de reação plástica. Para a implantação de sensores sem células, isso tem vantagens claras sobre dispositivos dependentes de plásticos. Em conjunto, a incorporação de reações CFPS em hidrogéis fornece várias vantagens para a implantação de dispositivos livres de células além do laboratório.
O objetivo geral dos métodos aqui apresentados é permitir a operação de reações CFPS dentro de matrizes de hidrogel. Dois métodos diferentes são demonstrados para incorporar reações de produção de proteínas livres de células em materiais hidrogéis em macroescala (Figura 1). No Método A, componentes CFPS são introduzidos em hidrogéis de agarose liofilizados para formar um sistema ativo. No método B, a agarose fundida é misturada com componentes da reação CFPS para formar um sistema completo de hidrogel CFPS, que é então liofilizado e armazenado até que seja necessário. Estes sistemas podem ser reidratados com um volume de água ou tampão e analito para iniciar a reação.
Este estudo utiliza sistemas baseados em lisado celular de Escherichia coli . Estes são alguns dos sistemas CFPS experimentais mais populares, pois a preparação de lisado celular de E. coli é simples, barata e alcança altos rendimentos proteicos. O lisado celular é complementado com os componentes macromoleculares necessários para realizar a transcrição e tradução, incluindo ribossomos, RNAt, aminoacil-tRNA sintetases e fatores de iniciação, alongamento e terminação. Especificamente, este trabalho demonstra a produção de eGFP e mCherry em hidrogéis de agarose usando lisados celulares de E. coli e monitora a aparência da fluorescência usando um leitor de placas e microscopia confocal. Resultados representativos para o leitor de placas de microtitulação podem ser vistos em Whitfield et al.31, e os dados subjacentes estão disponíveis publicamente33. Além disso, a expressão de proteínas fluorescentes através dos géis é confirmada usando microscopia confocal. Os dois protocolos demonstrados neste trabalho permitem a montagem e armazenamento de dispositivos genéticos baseados em CFPS em matéria com o objetivo final de criar um ambiente físico adequado para a distribuição de circuitos gênicos livres de células de forma a apoiar a implantação em campo.

<table><tbody><tr><td><forte>Material</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-214793B</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético</td><td>Ágar Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10752.22</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Severn Biotech</td><td>30-15-50</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Amostrador de Aminoácidos</td><td>VWR</td><td></td><td></td>BTRABR1401801</tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937-1G</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501-1G</td><td></td></tr><tr><td>Coenzima A (CoA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282-100MG</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Alfa Aesar</td><td>J14121.MC</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Folínico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878-100MG</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Carbosynth</td><td>NG01208</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-25G</td><td></td></tr><tr><td>K-glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149-100G</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-1G</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605-250G</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522-250MG</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega</td><td>V3011</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Potássio (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>757551-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio Dibásico (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio Monobásico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD037-500G</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Protease coquetel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714-1BTL</td><td></td></tr><tr><td>Kit de concentração de proteína Qubit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A50668</td><td></td></tr><tr><td>Rossetta 2 DE 3 E.coli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71397-3</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558-1G</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1321-01</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Alfa Aesar</td><td>J23160.MC</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625-1KG</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tubos de microcentrífuga</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>de diálise HS4323-500EA</td><td></td></tr><tr><td>10K MWCO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>66381</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de centrífuga de 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de centrífuga de 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120-9500</td><td></td></tr><tr><td>Alpha 1-2 LD Plus liofilizador</td><td>Cristo</td><td>part no. 101521, 101522, 101527</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H-X3R</td><td></td></tr><tr><td>Placas de microtitulação de 384 poços pretas</td><td>Fischer Scientific</td><td>66</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>222S</td><td></td></tr><tr><td>Elga Purelab Chorus</td><td>Microcentrífuga Elga</td><td>#####</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5425R</td><td>Eppendorf</td><td>EP00532</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de alta velocidade</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34183</td><td></td></tr><tr><td>Licença JMP</td><td>SAS Institute</td><td>15</td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético</td><td>Fischer Scientific</td><td>15353518</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Amcor</td><td>PM-966</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro (Biofotômetro)</td><td>Eppendorf</td><td>16713</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas e ponteiras</td><td>Gilson</td><td>#####</td><td></td></tr><tr><td>Precision Balance</td><td>Sartorius</td><td>16384738</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorômetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitação</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE8000</td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator (Sonicator)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12893543</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Estática</td><td>Sanyo</td><td>MIR-162</td><td></td></tr><tr><td>Seringa e agulhas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>66490</td><td></td></tr><tr><td>Thermo max Q8000 (Incubadora Agitada)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE8000</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan Lux</td><td>platereader Thermo Fisher Scientific</td><td>VLBL00GD1</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Cole-parmer</td><td>OU-04724-05</td><td></td></tr><tr><td>VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/&deg; medidor c</td><td>VWR</td><td>662-1657</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos para incorporação de reações de síntese proteica livre de células em hidrogéis em macroescala

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

As redes genéticas sintéticas fornecem uma plataforma para cientistas e engenheiros projetarem e construírem novos sistemas com funcionalidade codificada em nível genético. Enquanto o paradigma dominante para a implantação de redes gênicas está dentro de um chassi celular, redes gênicas sintéticas também podem ser implantadas em ambientes livres de células. Aplicações promissoras de redes gênicas livres de células incluem biossensores, já que esses dispositivos foram demonstrados contra alvos bióticos (vírus Ebola, Zika e SARS-CoV-2) e abióticos (metais pesados, sulfetos, pesticidas e outros contaminantes orgânicos). Sistemas livres de células são tipicamente implantados na forma líquida dentro de um vaso de reação. Ser capaz de incorporar tais reações em uma matriz física, no entanto, pode facilitar sua aplicação mais ampla em um conjunto mais amplo de ambientes. Para este fim, métodos para incorporar reações de síntese proteica livre de células (CFPS) em uma variedade de matrizes de hidrogel têm sido desenvolvidos. Uma das principais propriedades dos hidrogéis propícios a este trabalho é a alta capacidade de reconstituição de água dos materiais hidrogéis. Além disso, os hidrogéis possuem características físicas e químicas funcionalmente benéficas. Os hidrogéis podem ser liofilizados para armazenamento e reidratados para uso posterior. Dois protocolos passo-a-passo para a inclusão e ensaio de reações de CFPS em hidrogéis são apresentados. Primeiro, um sistema CFPS pode ser incorporado a um hidrogel via reidratação com um lisado celular. O sistema dentro do hidrogel pode então ser induzido ou expresso constitutivamente para a expressão completa de proteínas através do hidrogel. Em segundo lugar, o lisado celular pode ser introduzido em um hidrogel no ponto de polimerização, e todo o sistema pode ser liofilizado e reidratado em um ponto posterior com uma solução aquosa contendo o indutor para o sistema de expressão codificado dentro do hidrogel. Esses métodos têm o potencial de permitir redes gênicas livres de células que conferem capacidades sensoriais a materiais hidrogéis, com potencial para implantação além do laboratório.

Este protocolo detalha dois métodos para incorporar reações de CFPS em matrizes de hidrogel, com a Figura 1 apresentando uma visão geral esquemática das duas abordagens. Ambos os métodos são passíveis de liofilização e armazenamento a longo prazo. O método A é a metodologia mais utilizada por dois motivos. Primeiro, mostrou-se o método mais aplicável para trabalhar com uma variedade de materiais hidrogéis11. Em segundo lugar, o método A permite o teste paralelo de con...

Aqui, apresentamos dois protocolos para incorporar reações de síntese proteica livre de células em matrizes de hidrogel em macroescala sem a necessidade de uma fase líquida externa.

Métodos para Incorporação de Reações de Síntese Proteica Livre de Células em Hidrogéis em Macroescala

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...

Sabemos que os sistemas vivos integram continuamente informações de muitas fontes diferentes e que esses sinais desencadeiam respostas complexas e sutis. Grande parte desse processamento de informações ocorre em nível molecular. Estamos interessados em operar esses processos dentro de materiais, mas sem células.O objetivo é dar aos materiais uma nova funcionalidade. Os desafios neste trabalho estão primariamente associados à reação de síntese proteica livre de células, ao invés de trabalhar com hidrogel. A reação celular requer lisado celular de alta qualidade, bem como DNA de alta qualidade e pureza para funcionar bem.Esse protocolo permite que os pesquisadores incorporem reações de biologia molecular em um material físico biodegradável que pode ser levado para fora do laboratório. Além disso, como a saída de reação interage diretamente com o chassi do material, há potencial para o desenvolvimento de materiais com novas capacidades de detecção e resposta. Em curto prazo, vemos esses métodos como fornecendo uma nova rota para a implantação de dispositivos de diagnóstico livres de células.Este protocolo permite que uma série de dispositivos sejam criados e organizados espacialmente de uma maneira que não é possível para reações líquidas. Os nossos interesses futuros são duplos. Primeiro, estamos interessados em expandir a natureza dos hidrogéis que usamos para trazer mais funcionalidade material para o trabalho.Em segundo lugar, estamos interessados em aumentar a complexidade e o desempenho das redes gênicas que operamos em géis, expandindo a funcionalidade biológica desses sistemas.

methods-for-embedding-cell-free-protein-synthesis-reactions-macro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós apresentamos os protocolos para o 3-dimensional encapsulamento (3D) de células dentro de hidrogéis sintéticos. O procedimento de encapsulamento é descrito por dois métodos comumente utilizados de reticulação (michael tipo adição e light-iniciado livre mecanismos radical), bem como uma série de técnicas para avaliar o comportamento das células encapsuladas.

O encapsulamento celular em Hidrogéis 3D para Engenharia de Tecidos

Neste protocolo, demonstramos a fabricação de uma matriz microactuator de posts verticalmente deslocadas em que a tecnologia é baseada, e como essa tecnologia base pode ser modificado para conduzir alto rendimento de cultura de células mecanicamente dinâmica em ambos cultura bidimensional e tridimensional paradigmas.

Plataformas microfabricated para cultura de células mecanicamente dinâmico

Este vídeo é ilustrar um método rápido, eficiente para metacrilato de poli (etileno-glicol), permitindo que as polimerizações de cadeia e síntese de hidrogel. Ele vai demonstrar como a introdução de funcionalidades semelhante metacrilamida em peptídeos, detalhe métodos analíticos comuns para avaliar a eficiência de funcionalização, fornecer sugestões para a solução de problemas e modificações avançadas, e demonstrar técnicas típicas de caracterização hidrogel.

A funcionalização assistida por microondas, de poli (etileno glicol) e Peptídeos On-resina para uso em Polimerizações cadeia e formação de hidrogel

Apresentamos a síntese de um hidrogel mediada-intein desdobramento da proteína. Os blocos de construção da presente hidrogel são dois copolímeros de proteínas, cada uma contendo uma subunidade de uma proteína trimérica, que serve como um agente de ligação cruzada e uma metade de um intein dividida. A mistura dos dois copolímeros de proteínas desencadeia uma reacção de splicing trans intein, obtendo-se uma unidade de poliptido que se auto-monta para um hidrogel. Este hidrogel é altamente pH e...

Síntese de uma proteína artificial intein mediada Hidrogel

Descrevemos um processo sequencial para formação mediada por luz e subsequente padronização bioquímica de matrizes de hidrogel sintético para aplicações de cultura de células tridimensionais. A construção e modificação de hidrogéis com química de fotoclique citocompatível é demonstrada. Além disso, são apresentadas técnicas fáceis para quantificar e observar padrões e determinar a viabilidade celular dentro desses hidrogéis.

Formação Light-mediada e padronização de hidrogéis para aplicações de cultura celular

Diferentes métodos para manipular a arquitetura tridimensional em hidrogel à base de proteínas são avaliados aqui com respeito a propriedades do material. As redes se são acrescidas com um peptídeo de célula-adesivo, e sua viabilidade na cultura de pilha é avaliada usando duas linhas de células de modelo diferente.

Fácil manipulação das arquiteturas em hidrogel à base de proteínas para aplicações de cultura de células

Neste método, utilizamos a fotopolimerização e técnicas de química clique para criar padrões de proteína ou peptídeo na superfície de hidrogel de polietileno glicol (PEG), fornecendo imobilizada sinais bioativos para o estudo da resposta celular em vitro .

Padronização bioativas proteínas ou peptídeos em hidrogel usando fotoquímica para aplicações biológicas

Hidrogel engenharia de proteínas recombinantes é vantajosos para cultura celular 3D, já que permitem completo pré-definido a espinha dorsal do polímero e, portanto, o microambiente celular. Aqui, descrevemos o processo de purificação de proteínas recombinantes de elastina, como e sua aplicação no encapsulamento de célula de hidrogel 3D.

Produção de elastina, como proteína hidrogel para encapsulamento e imunocoloração de células em 3D

Aqui, um protocolo é apresentado para encapsular e cultivo de células em hidrogel de poly(ethylene glycol) (PEG) acrescida com um fluorogenic matriz metaloproteinase (MMP)-peptídeo degradável. Celular MMP e atividade metabólica são medidos diretamente a partir das culturas de hidrogel usando um leitor de microplacas padrão.

Medição de metaloproteinase matriz celular Global e atividade metabólica em hidrogel 3D

Este artigo descreve protocolos para a fabricação de microgel de metacriloíla de gelatina de alto rendimento usando dispositivos microfluídicos, conversão de microgéis em pó ressuspendível (micro-aerogéis), montagem química de microgéis para formar arcabouços de hidrogel granular e desenvolvimento de biotintas de hidrogel granulares com microporosidade preservada para bioimpressão 3D.

Suportes de hidrogel granular de metacriloíla de gelatina: fabricação de microgel de alto rendimento, liofilização, montagem química e bioimpressão 3D

Aprenda a incorporar reações de síntese proteica livre de células em hidrogéis de agarose usando lisados de E. coli. Este método permite desenvolver dispositivos diagnósticos portáteis com capacidades de detecção inovadoras.

Métodos para Incorporação de Reações de Síntese Proteica Livre de Células em Hidrogéis em Macroescala

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