Name: Quantificação, Avaliação de Viabilidade e Estratégias de Visualização para Biofilmes de Acinetobacter (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-04T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Aprenda a quantificar e visualizar biofilmes de Acinetobacter usando violeta de cristal e microscopia confocal. Este protocolo revela variações na formação de biofilmes entre diferentes cepas, auxiliando no controle de infecções.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa Principal de Pesquisa (E0210702-03) do Korea Food Research Institute (KFRI), financiado pelo Ministério da Ciência e TIC.

1. Preparação do inóculo bacteriano
<ol><li>Retire o frasco para injetáveis de glicerol armazenado a -80 °C.</li>
	<li>Retire a estirpe bacteriana (2-10 μL) do frasco para injetáveis utilizando uma ponta de pipeta estéril. NOTA: Cepas de Acinetobacter , A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) e A. ursingii (24-1) são utilizadas neste protocolo.</li>
	<li>Inocular uma placa de ágar sangue comercialmente disponível (ágar de soja tríptico suplementado com 5% de sangue de carneiro, ver Tabela de Materiais) com as bactérias. NOTA: Outros meios, como ágar nutriente ou ágar MacConkey, também podem ser usados.</li>
	<li>Estrie a superfície do ágar usando uma alça estéril com chamas intermitentes para afiná-la.</li>
	<li>Coloque a placa de ágar de cabeça para baixo em uma incubadora e incube a 30 °C durante a noite por 20-24 h.</li>
	<li>Escolha uma única colônia da cultura bacteriana com uma agulha estéril e inocular 5 mL de caldo de infusão cerebral cerebral estéril (BHI, ver Tabela de Materiais) com a cultura.</li>
	<li>Incubar o caldo inoculado numa incubadora de agitação a 30 °C durante a noite durante 20-24 h a cerca de 150 rpm.</li>
	<li>Transferir 1 mL da cultura noturna para um tubo de microcentrífuga estéril e centrifugar a cultura noturna a 6.000 × g por 10 min à temperatura ambiente (TR).</li>
	<li>Retire o sobrenadante com uma pipeta.</li>
	<li>Usando um vórtice, ressuspenda o pellet em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS).</li>
	<li>Centrifugar a 6.000 × g por 10 min em RT e remover o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender o pellet em BHI estéril dez vezes diluído usando vórtice para uma densidade óptica de cerca de 0,1 a 600 nm. NOTA: A densidade óptica de cerca de 0,1 é equivalente a aproximadamente 107 UFC/mL.</li>
</ol>2. Quantificação do biofilme utilizando cristal violeta
<ol><li>Adicionar 200 μL de inóculo a cada poço de uma placa estéril de poliestireno de 96 poços (ver Tabela de Materiais) e adicionar 200 μL de água deionizada a cada um dos poços mais externos para evitar que os poços internos sequem15.</li>
	<li>Adicionar 200 μL de BHI diluído dez vezes a cada poço da mesma placa como controle negativo.</li>
	<li>Incubar a placa a 25 °C durante 24 horas.</li>
	<li>Retire o sobrenadante com uma pipeta. NOTA: A pipeta multicanal é geralmente mais conveniente para várias amostras.</li>
	<li>Adicione cuidadosamente 300 μL de PBS a cada poço e remova o sobrenadante com uma pipeta. NOTA: A pipeta multicanal é geralmente mais conveniente para várias amostras.</li>
	<li>Repita a etapa 2.5 mais duas vezes.</li>
	<li>Adicionar 200 μL de solução de cristal violeta (1%) (ver Tabela de Materiais) a cada poço e incubar em RT durante 30 minutos.</li>
	<li>Repita as etapas 2.4-2.6.</li>
	<li>Adicione 200 μL de etanol absoluto a cada poço e incube por 15 min em RT. Misture bem pipetando para cima e para baixo várias vezes.</li>
	<li>Transfira a eluição de 100 μL de cada poço para uma nova placa de 96 poços.</li>
	<li>Medir a absorbância a 595 nm utilizando um leitor de microplacas (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Quando a absorbância exceder 2,0, fazer uma diluição adequada da amostra para a absorvância inferior a 2,0 em etanol absoluto e medi-la como na etapa 2.11. Em seguida, calcule a absorbância da amostra (valor final) multiplicando o valor observado pelo fator de diluição.</li>
	<li>Calcular a verdadeira absorbância das amostras subtraindo o valor médio do controlo negativo do valor de cada poço das amostras de ensaio na mesma placa de poço.</li>
</ol>3. Contagem de viabilidade do biofilme
<ol><li>Adicionar 1 mL de inóculo (passo 1) a cada poço de uma placa estéril de poliestireno de 12 poços15. Incubar a placa a 25 °C durante 24 horas. Retire o sobrenadante com uma pipeta.</li>
	<li>Adicione cuidadosamente 1,5 mL de PBS estéril a cada poço e remova o sobrenadante com uma pipeta. Adicionar 1 mL de PBS estéril a cada poço.</li>
	<li>Raspe as superfícies do fundo e da parede do poço usando raspadores de células adaptados.</li>
	<li>Transferir a suspensão celular colhida para um tubo plástico estéril (10-1) contendo 9 mL de solução salina (NaCl a 0,85%) e 10-20 esferas de vidro (ver Tabela de Materiais). NOTA: Para coletar qualquer resíduo residual de biofilme deixado na superfície inferior do poço, ele pode ser ressuspendido e transferido por pipeta usando soro fisiológico do tubo 10-1 .</li>
	<li>Vórtice o tubo 10-1 por 60 s em uma velocidade máxima.</li>
	<li>Fazer uma diluição seriada de 10 vezes transferindo 1 mL para o próximo tubo estéril (10-2) contendo 9 mL de solução salina (NaCl a 0,85%) até 10-7.</li>
	<li>Espalhe 100 μL de cada diluição em ágar Acinetobacter (ver Tabela de Materiais) e incube as placas de ágar a 30 °C durante 24-42 horas.</li>
	<li>Conte manualmente o número das colônias vermelhas típicas em cada placa no intervalo entre 10 e 250.</li>
	<li>Calcule o número de células viáveis no biofilme de cada poço utilizando a equação abaixo: Células viáveis = Número de colônias × Fatores de diluição × 10</li>
</ol>4. Visualização do biofilme por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM)
<ol><li>Adicionar 200 μL de inóculo a cada poço de uma placa estéril de 96 poços destinada à análise microscópica.</li>
	<li>Incubar a placa a 25 °C durante 24 horas.</li>
	<li>Retire o sobrenadante com uma pipeta.</li>
	<li>Adicione cuidadosamente 300 μL de água deionizada esterilizada por filtro a cada poço e remova o sobrenadante com uma pipeta.</li>
	<li>Repita a etapa 4.4.</li>
	<li>Preparar a mistura de SYTO 9 e iodeto de propídio (ver Tabela de Materiais) diluída em água deionizada esterilizada por filtro até uma concentração final de 10 μM e 60 μM, respectivamente.</li>
	<li>Adicione a mistura a cada poço a 200 μL e incube a placa por 20-30 min em TR no escuro.</li>
	<li>Repita as etapas 4.3-4.4</li>
	<li>Visualize os biofilmes acoplados à superfície inferior usando CLSM com comprimento de onda de excitação de 488 nm e 561 nm e a faixa de comprimento de onda de emissão de 499-535 nm e 568-712 nm, respectivamente.</li>
</ol>

Avaliação da formação de biofilme de Acinetobacter e caracterização de biofilmes

<ol><li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+pathophysiological+overview+of+Acinetobacter+infections%3A+a+century+of+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges.</a> Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).</li>
<li>Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+spp.+in+food+and+drinking+water+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter spp. in food and drinking water - A review.</a> Food Microbiology. 95, 103675(2021).</li>
<li>Towner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter%3A+an+old+friend%2C+but+a+new+enemy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hospital+Infection%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter: an old friend, but a new enemy.</a> Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).</li>
<li>Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+hospital+surfaces+in+the+transmission+of+emerging+health+care-associated+pathogens%3A+Norovirus%2C+Clostridium+difficile%2C+and+Acinetobacter+species%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Infection+Control%22%5BJournal%5D)">Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species.</a> American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%3A+multitasking+in+a+shared+space%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix: multitasking in a shared space.</a> Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li>
<li>Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+microbial+%26%2334%3Bprotective+clothing%26%2334%3B+in+extreme+environments%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the microbial &#34;protective clothing&#34; in extreme environments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423(2019).</li>
<li>Gedefie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii+biofilm+formation+and+its+role+in+disease+pathogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+drug+resistance%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review.</a> Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).</li>
<li>Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii.</a> Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).</li>
<li>Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiologica%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii.</a> New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).</li>
<li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+on+biofilm+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li>
<li>Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+characteristics+and+transcriptomic+profiling+of+Acinetobacter+johnsonii+defines+signatures+for+planktonic+and+biofilm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells.</a> Environmental Research. 213, 113714(2022).</li>
<li>Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii%3A+genotype-phenotype+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation.</a> Molecules. 24 (10), 1849(2019).</li>
<li>Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-formation+in+clonally+unrelated+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates.</a> Pathogens. 9 (8), 630(2020).</li>
<li>Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+Acinetobacter+and+Bacillus+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+biofilms+against+sodium+hypochlorite+and+extracellular+matrix-degrading+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes.</a> Food Microbiology. 109, 104125(2023).</li>
<li>Stepanović, S., Ćirković, I., Ranin, L., Svabić-Vlahović, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+Salmonella+spp.+and+Listeria+monocytogenes+on+plastic+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface.</a> Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).</li>
<li>Boone, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+virulence+phenotypes+and+antibiotic+resistance+in+clinical+strains+of+Acinetobacter+baumannii+isolated+in+Nashville%2C+Tennessee%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee.</a> BMC Microbiology. 21 (1), 21(2021).</li>
<li>Otter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-attached+cells%2C+biofilms+and+biocide+susceptibility%3A+implications+for+hospital+cleaning+and+disinfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hospital+Infection%22%5BJournal%5D)">Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection.</a> Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).</li>
<li>Ravishankar, S., Juneja, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+or+resistance+responses+of+microorganisms+to+stresses+in+the+food+processing+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Stress+Adaptation+and+Food+Safety%22%5BJournal%5D)">Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment.</a> Microbial Stress Adaptation and Food Safety. Yousef, A. E., Juneja, V. K. , (2003).</li>
<li>Dewanti, R., Wong, A. C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+culture+conditions+on+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7.</a> International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).</li>
<li>McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii%3A+human+infections%2C+factors+contributing+to+pathogenesis+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).</li>
<li>McQueary, C. N., Actis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii+biofilms%3A+variations+among+strains+and+correlations+with+other+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties.</a> The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Usando o protocolo descrito, a formação de biofilme de isolados de Acinetobacter com graus variados foi medida, visualizada e as células viáveis nos biofilmes foram estimadas (Figura 1, Figura 2 e Figura 3).
Neste protocolo, foram utilizadas duas diferentes temperaturas, 30 °C para o crescimento e 25 °C para a formação do biofilme de Acinetobacter. 30 °C foi utilizado porque muitos estud...

Sabe-se que a Acinetobacter causa infecções nosocomiais é cada vez mais relatada1. Está disseminada em hospitais, serviços de saúde e ambientes associados à alimentação 2,3,4. Pode sobreviver por um longo período em ambientes que incluem superfícies hospitalares, como grades de cama, mesas de cabeceira, superfície de ventiladores e pias4. Essa persistência nas superfícies ambientais pode ser um dos fatores significativos que contribuem para as infecções nosocomiais de Acinetobacter4.
O biofilme é uma forma de vida microbiana e é uma matriz microbiana composta por células microbianas vivas e substâncias poliméricas extracelulares (EPS) provenientes das células5. As células microbianas estão embutidas na matriz e são frequentemente altamente resistentes a estresses ambientais como calor, sais, secura, antibióticos, desinfetantes e forças de cisalhamento 6,7.
Acinetobacter pode formar biofilmes em superfícies, sugerindo que pode contribuir para maior sobrevida em superfícies ambientais, incluindo superfícies hospitalares, e maior resistência ao tratamento com antibióticos 8,9. Além disso, a formação de biofilme de Acinetobacter poderia estar altamente associada a desfechos clínicos humanos8. Portanto, a formabilidade do biofilme de cepas de Acinetobacter pode ser um dos indicadores na predição de sobrevivência ambiental e infecções humanas 8,10.
Os biofilmes aderidos à superfície podem ser quantificados e visualizados para avaliar a formabilidade do biofilme. Para quantificar os biofilmes aderidos à superfície, os biofilmes são normalmente corados por corantes corantes de biofilme, como o violeta de cristal, e os corantes são eluídos em solução e medidos quanto à densidade óptica11. A visualização de biofilmes é outra boa abordagem para avaliar a conformabilidade do biofilme11. O método de visualização por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) empregando especificidade usando corantes fluorescentes poderia ser mais útil para caracterizar a morfologia do biofilme em comparação com outras técnicas, como aMEV12,13.
As células viáveis em biofilmes podem ser contadas para estimar o número de células viáveis em biofilmes11. As células viáveis embutidas em biofilmes são destacadas, diluídas, espalhadas em placas de ágar, incubadas e enumeradas. Como o maior número de células provavelmente atenderá à dose infecciosa, ele pode fornecer informações mais detalhadas sobre os biofilmes, como os potenciais de infecção associados ao número de células13,14.
Este artigo apresenta protocolos passo a passo para (1) quantificar biofilmes aderidos à superfície, (2) contar células viáveis nos biofilmes e (3) visualizar os biofilmes usando CLSM de Acinetobacter. Os protocolos apresentados descrevem os métodos para avaliar a conformabilidade do biofilme de isolados de Acinetobacter e caracterizar seus biofilmes.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura celular de 96 poços</td><td>SPL</td><td>30096</td><td>Poliestireno Placa de 96 poços</td></tr><tr><td>BHI (Infusão de Coração Cerebral) Caldo</td><td>Merck KGaA</td><td>1.10493.0500</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Base de Ágar Sangue</td><td>KisanBio</td><td>MB-B1005-P50</td><td>Meios de crescimento para Acinetobacter</td></tr><tr><td>CHROMagar Acinetobacter</td><td>CHROMagar</td><td>AC092</td><td>Placa seletiva para Acinetobacter</td></tr><tr><td>Cristal violeta solução</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V5265</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer LIVE/DEAD kit de viabilidade de biofilme</td><td>Invitrogen</td><td>L10316</td><td>SYTO9 e iodeto de propídio</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200 PRO NanoQuant</td><td>Medição de biofilme</td></tr><tr><td>RBC Glass Plating Beads</td><td>RBC</td><td>RG001</td><td>Glass beads</td></tr><tr><td>&mu;-Plate 96 Well Black</td><td>ibidi</td><td>89621</td><td>Microplaca destinada ao CLSM</td></tr></tbody></table>

quantificação, avaliação de viabilidade e estratégias de visualização para biofilmes de acinetobacter

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

Acinetobacter causa infecções hospitalares e sua formação de biofilme pode contribuir para a sobrevivência em superfícies secas, como ambientes hospitalares. Assim, a quantificação e visualização do biofilme são métodos importantes para avaliar o potencial de cepas de Acinetobacter em causar infecções nosocomiais. Os biofilmes que se formam na superfície da microplaca podem ser quantificados em termos de volume e número de células. Os volumes de biofilme podem ser quantificados pela coloração usando violeta de cristal, lavagem, coloração usando etanol e, em seguida, medindo o corante solubilizado usando um leitor de microplacas. Para quantificar o número de células embutidas nos biofilmes, os biofilmes são descartados com raspadores celulares, colhidos em solução salina, agitados vigorosamente na presença de esferas de vidro e espalhados em ágar Acinetobacter. Em seguida, as placas são incubadas a 30 °C por 24-42 h. Após a incubação, as colônias vermelhas são enumeradas para estimar o número de células em biofilmes. Este método de contagem viável também pode ser útil para a contagem de células de Acinetobacter em biofilmes de espécies mistas. Biofilmes de Acinetobacter podem ser visualizados usando corantes fluorescentes. Uma microplaca comercialmente disponível projetada para análise microscópica é empregada para formar biofilmes. Em seguida, os biofilmes aderidos à superfície inferior são corados com SYTO9 e iodeto de propídio, lavados e, em seguida, visualizados com microscopia confocal de varredura a laser.

Seguindo o protocolo, os biofilmes dos isolados de Acinetobacter , originalmente isolados de superfícies de cozinha, foram formados em uma placa de poliestireno de 96 poços, corada com violeta de cristal, e os corantes foram solubilizados em etanol e medidos quanto à massa de biofilme (Figura 1). O número de biofilmes variou muito dependendo das cepas, variando de 0,04 a 1,69 DO (Figura 1). Com base nos critérios estabelecidos por Stepanović et <sup cla...

Este protocolo descreve a preparação do inóculo, a quantificação do biofilme em placas de microtitulação usando corante violeta cristal, a contagem viável em biofilmes e a visualização de biofilmes de Acinetobacter.

Quantificação, Avaliação de Viabilidade e Estratégias de Visualização para Biofilmes de Acinetobacter

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

Os biofilmes são compostos por células microbianas vivas e são difíceis de remover das superfícies. Cepas de Acinetobacter comumente encontradas em nosso meio, causando infecções nosocomiais, também são conhecidas por formar biofilmes em superfícies. Assim, pretendemos desenvolver métodos para quantificar e visualizar biofilmes de Acinetobacter.Nosso protocolo fornece um método simples e fácil para quantificar e visualizar os biofilmes de Acinetobacter. O número viável de células no interior dos biofilmes é quantificado pelo método de contagem viável. Nossos resultados de pesquisa revelam que as cepas vetoriais de Acinetobacter naturalmente existentes têm potenciais bastante variados para a formação de biofilme.Além disso, existirão diferenças morfológicas distintas dentro dos vários biofilmes. Isso abriu caminho para pesquisas com foco nas causas de uma variação tão grande entre as cepas de Acinetobacter.

quantification-viability-assessment-visualization-strategies-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Tay, S. B., et al. Perturbação Antivirulenta de Biofilmes Patogênicos usando lactonases modificadas para apagamento do quórum.  J. Vis. Exp. (2016)O vídeo demonstra um método para quantificar a biomassa de biofilme em uma bactéria patogênica, comparando controles não tratados com amostras tratadas com uma enzima que apaga quórum. A enzima interrompe a sinalização bacteriana durante a incubação inicial, reduzindo a adesão celular. Após lavagem e incubação adicional, poços de controle...

Quantificação da Supressão de Biofilme Induzida por Enzimas em Bactérias Patógenas

Um protocolo para a quantificação e comparação simultânea de três componentes celulares e extracelulares dentro de biofilmes é apresentado. A metodologia envolve o uso de microscopia confocal de varredura a laser, software de análise e visualização estrutural de biofilme e software de análise estatística.

Quantificação simultânea de celulares e extracelulares Componentes de biofilmes

O objectivo deste trabalho é métodos para descrever o uso de um sistema de microfluidos para o desenvolvimento de biofilmes multi-espécies que contêm espécies normalmente identificados na placa dental supragengival humano. Métodos para descrever arquitetura biofilme, a viabilidade de biofilme, e uma abordagem para a colheita de biofilme para análises dependentes de cultura ou independentes de cultivo são realçados.

A utilização de uma alta taxa de transferência<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic Sistema de Desenvolvimento Oral Biofilms Multi-espécies

Este estudo apresenta o desenvolvimento de metodologias reprodutíveis para estudar inibidores de biofilme e seus efeitos sobre a multicelularidade de Bacillus subtilis.

Metodologias para o estudo<em&gt; B. subtilis</em&gt; Os biofilmes como um modelo para a caracterização de pequena molécula biofilme Inibidores

Este protocolo descreve um novo método para crescer e qualitativamente analisar biofilme bacteriano sobre hifas fúngicas por microscopia confocal e eletrônica.

Um novo método para a análise qualitativa Multi-escala de Bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica Colonies Usando Confocal e Microscopia Eletrônica

Este protocolo descreve a visualização do desenvolvimento do biofilme após a exposição a fatores do hospedeiro usando um modelo de câmara de lâminas. Este modelo permite a visualização direta do desenvolvimento do biofilme, bem como a análise dos parâmetros do biofilme usando programas de software de computador.

Visualizando os Efeitos de escarro no desenvolvimento de biofilmes usando um modelo Chambered lamela

As alterações induzidas por antimicrobianos na arquitetura do biofilme de Pseudomonas aeruginosa diferem entre os isolados clínicos cultivados de pacientes com fibrose cística e infecção pulmonar crônica. Após a microscopia confocal, o software COMSTAT pode ser utilizado para quantificar variações na arquitetura do biofilme (por exemplo, área de superfície, espessura, biomassa) para isolados individuais para avaliar a eficácia de agentes anti-infecciosos.

Quantificando os efeitos dos antimicrobianos na arquitetura de biofilme in vitro usando o software COMSTAT

O meio de escarro de fibrose cística sintética (SCFM2) pode ser utilizado em combinação com microscopia de varredura a laser confocal e classificação celular ativada por fluorescência para observar agregados bacterianos em alta resolução. Este artigo detalha métodos para avaliar populações agregadas durante o tratamento antimicrobiano como uma plataforma para estudos futuros.

Ferramentas para a avaliação em tempo real de um modelo de infecção por pseudomonas aeruginosa

Este protocolo descreve uma abordagem que combina métodos estáticos e dinâmicos para avaliar a eficácia de peroxiácidos orgânicos para erradicar biofilmes na indústria de laticínios. Esta abordagem também pode ser usada para testar a eficácia de novas formulações biológicas ou químicas para o controle de biofilmes.

Avaliação da Eficácia dos Perácidos Orgânicos na Erradicação de Biofilmes Laticínios Usando uma Abordagem Combinando Métodos Estáticos e Dinâmicos

Este protocolo oferece um fluxo de trabalho modular BSL-2 que combina ensaios de biomassa cristal-violeta, cinética de contraste de fase em time-lapse, mapeamento confocal 3D/matricial, ultraestrutura SEM e um módulo in vivo de infecção por hamster para cultivar, quantificar, caracterizar e investigar o papel funcional do biofilme de Leptospira , possibilitando avaliação padronizada de mutantes e intervenções anti-biofilme em laboratórios.

Um Fluxo de Trabalho Modular para Análise Quantitativa, Estrutural e Funcional de Biofilmes de Leptospira

Aprenda a quantificar e visualizar biofilmes de Acinetobacter usando violeta de cristal e microscopia confocal. Este protocolo revela variações na formação de biofilmes entre diferentes cepas, auxiliando no controle de infecções.

Quantificação, Avaliação de Viabilidade e Estratégias de Visualização para Biofilmes de Acinetobacter

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