Name: Imagem de cálcio de dois fótons da atividade do prosencéfalo em peixes-zebra adultos com comportamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Aprenda a realizar imagem de cálcio de dois fótons no prosencéfalo de peixes-zebra adultos durante comportamento. Este método permite visualizar a atividade neuronal individual em contextos comportamentais complexos.

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de Biologia Molecular, Academia Sinica, e Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia, Taiwan. A Oficina de Máquinas do Instituto de Física, Academia Sinica ajudou a fabricar peças personalizadas. Também queremos agradecer a P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basileia, Suíça) pelo projeto do mecanismo de bloqueio rápido do estágio principal.

Todos os procedimentos com animais foram aprovados e realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Academia Sinica. Detalhes dos instrumentos de pesquisa podem ser encontrados na Tabela de Materiais.
1. Preparação da câmara de gravação
<ol><li>Prepare um tanque semi-hexagonal, uma placa de base e um estágio de cabeça (Figura 1A; Arquivos complementares 1-3). O estágio principal consiste em dois postes metálicos presos a uma placa circular. A placa circular contém ranhuras que podem ser travadas na placa de base. Depois de serem travados juntos, o estágio da cabeça e a placa de base são colocados no fundo do tanque semi-hexagonal.</li>
	<li>Coloque o tanque semi-hexagonal sobre a plataforma experimental do microscópio. A plataforma deve ser capaz de se mover nas direções X e Y sem atingir o limite do estágio de tradução.</li>
	<li>Aponte a luz infravermelha (IR) de 810 nm e a câmera para o palco principal para gravação comportamental. Certifique-se de que o campo de visão da câmera seja grande o suficiente para caber em um peixe-zebra adulto.<ol><li>Para evitar que o laser de dois fótons e o estímulo visual interfiram no registro comportamental, configure um filtro passa-curta de 875 nm e um filtro passa-longa de 700 nm na frente da câmera, respectivamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Para apresentar o estímulo visual, fixar filmes de retroprojeção na face interna das três paredes do tanque semi-hexagonal (Figura 1A).</li>
	<li>Aponte os três projetores para as três superfícies do tanque. As três imagens devem ser alinhadas para formar uma cena visual contínua. Para evitar que as luzes do projetor contaminem o sinal de fluorescência de cálcio, coloque um filtro de densidade neutra e um filtro de cor vermelha (600 nm, passa-longa) na frente de cada projetor e coloque um filtro passa-banda (510/80 nm) na frente do tubo fotomultiplicador (PMT).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65526/65526fig1v8.jpg"> Figura 1: Instrumentos necessários para a cirurgia de apoio de cabeça. (A) O mecanismo de bloqueio rápido entre a placa circular do estágio da cabeça e a placa de base dentro do tanque semi-hexagonal. Arquivos CAD (computer-aided design) das peças personalizadas podem ser encontrados em Arquivos Suplementares 1-4. (B) Barra de cabeça em forma de Ω para o apoio de cabeça. (C) O micromanipulador de três eixos utilizado para posicionar a barra de cabeçote no local de fixação. Inserção: orientação da barra principal na argila. (D) Canhão para segurar o peixe durante a cirurgia. Inset: orientação dos peixes dentro do canhão. (E) Módulo de carregamento de peixes e o micromanipulador usado para carregar os peixes no palco principal. Inset: orientação dos peixes dentro do módulo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65526/65526fig1v8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. Cirurgia de apoio de cabeça
<ol><li>Prepare uma barra de cabeça em forma de Ω (Figura 1B; Arquivo Suplementar 4) para o apoio de cabeça do peixe-zebra. Para fazer isso, anexe um pedaço de argila modeladora à base de óleo a um micromanipulador de três eixos. Certifique-se de que a argila é sólida o suficiente para segurar a barra da cabeça, mas macia o suficiente para se desprender da barra da cabeça após o apoio de cabeça.</li>
	<li>Insira um braço da barra da cabeça na argila e oriente a barra da cabeça horizontalmente (Figura 1C). Isso garantirá que a fixação posterior da barra da cabeça no peixe-zebra seja nivelada. NOTA: A barra principal pode ser feita de titânio (24 mg) ou aço inoxidável (43 mg) e pode ser reutilizada para múltiplos experimentos. O material da barra de cabeça não afeta o comportamento do peixe-zebra adulto (o peso varia de 300-1.000 mg) sob um apoio de cabeça.</li>
	<li>Prepare o canhão, um tubo oco para segurar o corpo do peixe no lugar durante a cirurgia (Figura 1D).</li>
	<li>Preparar 0,03% e 0,01% de metanossulfonato de tricaína (TMS; ver Tabela de Materiais) na água do tanque de peixes. Este será usado para anestesiar e manter os peixes em um estado sedado durante a cirurgia.</li>
	<li>Prepare quatro cotonetes de tecido para remover o excesso de pele e água dos locais de fixação no crânio. Para preparar cada cotonete, corte um papel toalha em um quadrado de 3 cm e dobre ao longo de sua diagonal para produzir uma estrutura semelhante a um tubo. Torça as extremidades do tubo em um ponto fino. O local de fixação é muito pequeno, então um ponto fino permite um controle mais fino do cotonete.</li>
	<li>Preparar um módulo de carregamento de peixes para o micromanipulador (Figura 1E). NOTA: O módulo consiste em dois postes de aço unidos por uma braçadeira de ângulo reto. Um poste se prende ao micromanipulador, enquanto o outro poste segura uma braçadeira giratória que carrega os peixes. O módulo é usado para posicionar os peixes no palco da cabeça com controle fino. A pinça giratória serve como um ajustador de passo para mudar o ângulo de passo do peixe.</li>
	<li>Anestesiar os peixes com 0,03% de EMT em água de tanque de peixes. Ao longo das etapas seguintes, use uma seringa para entregar a EMT a 0,01% na água do tanque de peixes até a boca em pulsos curtos a cada 90 s. O fluxo de água da perfusão deve induzir o movimento branquial. Isso permitirá que os peixes sobrevivam por mais de 40 minutos durante a cirurgia. NOTA: Tg[neuroD:GCaMP6f] é usado devido à sua ampla expressão do indicador de cálcio no prosencéfalo tanto na fase larval quanto na fase adulta10. NOTA: Opcionalmente, use a perfusão por gravidade para fornecer fluxo constante de água para a boca durante os períodos em que ambas as mãos estão ocupadas.</li>
	<li>Embrulhe o peixe em uma cápsula (Figura 2A) que mantenha o peixe dentro do canhão.<ol><li>Embrulhe o peixe anestesiado em um pedaço de papel umedecido começando da ponta da cauda até cerca de 1 mm caudal à guelra. Certifique-se de que o invólucro esteja apertado para evitar o deslizamento do peixe para fora do tecido.</li>
		<li>Enrole um tubo de plástico macio com uma fenda longitudinal (por exemplo, um tubo termoencolhível de tamanho médio cortado aberto) ao redor do tecido de papel para cobrir os peixes desde a extremidade da cauda até cerca de 2 mm caudal à guelra. A tubulação garante que o corpo do peixe permaneça reto durante toda a cirurgia.</li>
		<li>Embrulhe uma toalha de papel ao redor da tubulação até um diâmetro aproximadamente semelhante ao diâmetro do canhão.</li>
		<li>Embrulhe um tubo de plástico macio cortado do bulbo de uma pipeta de transferência de plástico ao redor do papel toalha. Isso garante que a cápsula possa ser carregada suavemente no canhão.</li>
		<li>Coloque o peixe no canhão.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizar bisturi para retirar a pele que recobre os locais de fixação, duas áreas triangulares do crânio rostrolateral ao cerebelo e acima das brânquias (Figura 2B), retirando em seguida a pele que cobre a região entre os locais de fixação. Use cotonetes de tecido para secar os locais de fixação e limpar qualquer pele restante.<ol><li>Use uma plataforma ajustável para apoiar a cabeça durante a remoção da pele, mas a plataforma não deve entrar em contato com os olhos para evitar lesões oculares durante a operação. NOTA: A remoção completa da pele nos locais de fixação é crucial para reduzir os artefatos de movimento durante a aquisição de imagens.</li>
	</ol></li>
	<li>Aplique uma gota de cola de tecido (ver Tabela de Materiais) no centro de cada local de fixação usando uma ponta de pipeta de 10 μL. NOTA: A cola de tecido cobre os locais de fixação e seca rapidamente. A cola de tecido fornece uma interface de ligação entre o crânio e o cimento dentário usado para colar a barra da cabeça e impede que a água das brânquias atinja o local de fixação.</li>
	<li>Coloque o corpo do peixe na posição ereta e posicione a barra da cabeça ligeiramente acima e caudal aos locais de fixação em preparação para a colagem da barra da cabeça.</li>
	<li>Preparar cimento dentário (ver Tabela de Materiais) e usá-lo imediatamente para colar a barra da cabeça ao crânio (Figura 2C). O procedimento é sensível ao tempo e deve ser feito em até 45 s.<ol><li>Misture uma colher pequena de polímero com quatro gotas de monômero rápido e uma gota de catalisador V. Mexa a mistura uniformemente por 15 s.</li>
		<li>Use uma micropipeta e uma ponteira de pipeta de 10 μL para aplicar a mistura nos locais de fixação e na região entre os locais. Evite cobrir as brânquias e os olhos.</li>
		<li>Pressione suavemente a barra da cabeça sobre o cimento usando o micromanipulador. Cubra a barra da cabeça com o cimento restante.</li>
		<li>Aguarde 12 min para permitir a cura do cimento dental. Evite o contato da água com o cimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Para melhorar o acesso óptico ao prosencéfalo para imagens de cálcio, remova a pele acima do telencéfalo. A retirada da pele pode ser feita em 3 min com cinco cortes com bisturi (Figura 2D). Certifique-se de que as gotículas lipídicas aderidas à superfície dos crânios sejam removidas.</li>
	<li>Após a cura, retire a argila da barra da cabeça.</li>
	<li>Transfira toda a cápsula do canhão para o ajustador de passo no módulo de carregamento de peixes do micromanipulador.</li>
	<li>Use o micromanipulador para posicionar o peixe. A barra da cabeça deve ser posicionada no topo dos postes metálicos do palco da cabeça. Aumente ligeiramente o ângulo de inclinação dos peixes para que a superfície do prosencéfalo possa ser melhor alinhada ao plano óptico durante a obtenção de imagens de dois fótons.</li>
	<li>Cole a barra da cabeça nos postes metálicos com cola curável por ultravioleta (UV). Uma exposição UV de 15 s é suficiente para a cura.</li>
	<li>Retire o peixe da cápsula e prenda o estágio da cabeça na placa de base dentro do tanque semi-hexagonal.</li>
	<li>Mergulhe o animal na água do tanque de peixes. Os peixes devem começar a respirar e se recuperar da anestesia dentro de 1-2 minutos. NOTA: Opcionalmente, use a perfusão da seringa para fornecer água fresca à boca.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65526/65526fig02.jpg"> Figura 2: Principais passos durante a cirurgia de apoio de cabeça. (A) Composição da cápsula dentro do canhão. (B) Locais de fixação no crânio (vermelho). As setas vermelhas especificam os locais dos vasos sanguíneos. (C) Superior: barra da cabeça presa ao crânio do peixe. Fundo: peixe carregado no palco da cabeça. (D) Cortes necessários para remover a pele acima do prosencéfalo. Os números denotam a sequência de corte. Evitar a retirada de pele no local marcado (ponta de seta) para evitar sangramento do animal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65526/65526fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. Imagem de dois fótons
<ol><li>Ligue o laser e aguarde 30 min para que a energia se estabilize. Ajuste o comprimento de onda para 920 nm e a potência para cerca de 50 mW na amostra. NOTA: O feixe de laser controlado pelo scanner ressonante move-se lentamente nos pontos de retorno do caminho de varredura. Para evitar danos teciduais, uma célula de Pockels é usada para reduzir a potência do laser nos pontos de retorno.</li>
	<li>Colocar a câmara de registro contendo o peixe-zebra contido na cabeça na plataforma experimental (Figura 3A). A plataforma deve ser capaz de se mover nas direções X e Y sem atingir o limite do estágio de tradução.</li>
	<li>Coloque a lente objetiva o mais próximo possível da superfície do prosencéfalo. A lente objetiva deve estar voltada para a borda frontal da pupila (Figura 3B).</li>
	<li>Abra o obturador a laser e ative o PMT. Eleve gradualmente a lente objetiva (~1 mm) até que o prosencéfalo dorsal seja revelado na imagem de fluorescência (Figura 3C).</li>
	<li>Para aumentar o número de neurônios registrados, use um atuador piezo para adquirir imagens em múltiplas profundidades (seis planos de imagem, separados por 15 μm). Isso aumentará o rendimento dos dados às custas da taxa de quadros. Habilite a varredura rápida do eixo Z para controlar o atuador piezo (modo uniforme, número de fatias = 6, tamanho do passo = 15 μm, forma de onda = dente de serra, tempo de flyback = 4 ms, atraso do atuador = 8 ms).</li>
	<li>Para gravação de comportamento, ligue as luzes infravermelhas (IR) de 810 nm em ambos os lados do tanque. Ajuste o ângulo para iluminar todo o corpo, que deve ser claramente visível na câmera.</li>
	<li>Ligue os projetores.</li>
	<li>Comece a gravar dados.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65526/65526fig3v2.jpg"> Figura 3: Configuração para realizar imagens de cálcio, gravação comportamental e exibição de estímulos visuais . (A) Três projetores apresentam um estímulo visual nas paredes do tanque semi-hexagonal. Luzes IR na lateral são usadas para iluminar o corpo do peixe-zebra. (B) Posicionamento da lente objetiva. Esquerda: vista frontal. Direita: vista lateral. A distância entre a lente objetiva de 16x e a região do cérebro alvo é de cerca de 2,5 mm. (C) Exemplo de imagem de dois fótons. Esquerda: projeção máxima de todo o prosencéfalo dorsal em Tg[neuroD:GCaMP6f]. Direita: imagem ampliada para revelar neurônios em várias regiões do cérebro. Inset: uma ampliação maior de uma região diferente do cérebro. As imagens são médias de 10 s de dados gravados a 5Hz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65526/65526fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Rastreamento de Comportamento e Padrão de Atividade Neural no Prosencéfalo do Peixe-Zebra

<ol><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
<li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li>
<li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li>
<li>Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+neuroscience+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Circuit neuroscience in zebrafish.</a> Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).</li>
<li>Kappel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+recognition+of+social+signals+by+a+tectothalamic+neural+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit.</a> Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).</li>
<li>Bartoszek, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ongoing+habenular+activity+is+driven+by+forebrain+networks+and+modulated+by+olfactory+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli.</a> Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).</li>
<li>Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+classical+and+operant+learning+behaviors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish.</a> Learning & Memory. 19 (4), 170-177 (2012).</li>
<li>Buske, C., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+shoaling+behavior+is+accompanied+by+changes+in+the+dopaminergic+and+serotoninergic+systems+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Psychobiology%22%5BJournal%5D)">Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish.</a> Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).</li>
<li>Huang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li>
<li>Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+z-scanning+with+a+macroscopic+voice+coil+motor+for+fast+3D+multiphoton+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).</li>
<li>Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scattering+compensation+by+focus+scanning+holographic+aberration+probing+%28F-SHARP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP).</a> Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).</li>
<li>Torigoe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+capable+of+generating+future+state+prediction+error+show+improved+active+avoidance+behavior+in+virtual+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality.</a> Nature Communications. 12 (1), 5712(2021).</li>
</ol>

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para conter a cabeça de peixes-zebra adultos para imagens de cálcio de dois fótons. Há duas etapas críticas para obter um apoio de cabeça que seja estável o suficiente para imagens de varredura a laser. Primeiro, a barra da cabeça deve ser colada nos locais de fixação específicos dos crânios. Outras partes do crânio são muitas vezes muito finas para fornecer estabilidade mecânica e podem até ser fraturadas durante movimentos fortes do corpo. Em segundo lugar, a pele acima dos loca...

A imagem por fluorescência do cálcio com indicadores codificados geneticamente ou corantes sintéticos tem sido um poderoso método de medir a atividade neuronal em animais com comportamento, incluindo primatas não humanos, roedores, aves e insetos1. A atividade de centenas de células, até aproximadamente 800 μm abaixo da superfície cerebral, pode ser medida simultaneamente por meio de imagens com múltiplos fótons 2,3. A atividade de tipos celulares específicos também pode ser medida pela expressão de indicadores de cálcio em populações neuronais geneticamente definidas. A aplicação do método de imagem para modelos de pequenos vertebrados abre novas possibilidades no campo da computação neuronal em regiões cerebrais.
O peixe-zebra é um sistema modelo amplamente utilizado em pesquisas em neurociência. Larvas de peixes-zebra em torno de 6 dias pós-fertilização têm sido utilizadas para imagens de cálcio devido ao seu cérebro em miniatura e corpo transparente4. Os peixes-zebra juvenis (3-4 semanas de idade) também são utilizados para estudar os mecanismos neurais subjacentes às vias sensório-motoras5,6. No entanto, o nível máximo de desempenho para comportamentos complexos, incluindo aprendizagem associativa e comportamentos sociais, é alcançado em idade mais avançada 7,8. Assim, um protocolo confiável é necessário para estudar múltiplas funções cognitivas no cérebro de peixes-zebra adultos usando métodos de imagem. Enquanto larvas de peixe-zebra e peixes-zebra juvenis podem ser incorporados em agarose para imagens in vivo, peixes-zebra adultos com 2 meses ou mais sofrem de hipóxia em tais condições e são fisicamente fortes demais para serem contidos pela agarose. Portanto, um procedimento cirúrgico é necessário para estabilizar o cérebro e permitir que o animal respire livremente através das brânquias.
Aqui, descrevemos um protocolo de apoio de cabeça que envolve um novo design de uma única barra de cabeça. O tempo cirúrgico reduzido de 25 min é duas vezes mais rápido que o método anterior9. Descrevemos também o projeto da câmara de gravação (tanque semi-hexagonal), do estágio principal e de um mecanismo de bloqueio rápido para combinar as duas partes9. Finalmente, a configuração para apresentar um estímulo visual imersivo para estudar a atividade e os comportamentos cerebrais desencadeados visualmente também é descrita. Em geral, os procedimentos descritos aqui podem ser usados para realizar imagens de cálcio de dois fótons em populações celulares geneticamente definidas em um peixe-zebra adulto contido na cabeça, permitindo a investigação de atividades cerebrais durante vários paradigmas comportamentais.

<table><tbody><tr><td>Cartão de aquisição</td><td>MBF Biociências</td><td>Vidrio vDAQ</td><td>Microscópio</td></tr><tr><td>Filme de retroprojeção</td><td>Kimoto</td><td>Tela Diland - GSK</td><td>Estímulo visual presente</td></tr><tr><td>Filtro passa-banda (510/80 nm)</td><td>Chroma</td><td>ET510/80m</td><td>Microscópio</td></tr><tr><td>Placa base para o tanque semi-hexagonal</td><td>Feito sob medida</td><td>ver arquivos suplementares</td><td>Câmara de gravação</td></tr><tr><td>Filtro da câmera (< 875 nm)</td><td>Óptica Edmund</td><td>#86-106</td><td>Registro de comportamento</td></tr><tr><td>Filtro da câmera (>700 nm)</td><td>Óptica Edmund</td><td>#43-949</td><td>Registro de comportamento</td></tr><tr><td>Lente da câmera</td><td>Thorlabs</td><td>MVL50M23</td><td>Registro de comportamento</td></tr><tr><td>Visão Camaleão-S</td><td>Coerente</td><td>Visão-S</td><td>Laser</td></tr><tr><td>Placa circular para o estágio de cabeça</td><td>Feito sob medida</td><td>ver arquivos suplementares</td><td>Câmara de gravação</td></tr><tr><td>Controlador para atuador piezo</td><td>Instrumento Physik &nbsp;</td><td>E-665. CR</td><td>Microscópio</td></tr><tr><td>Amplificador de corrente</td><td>Thorlabs</td><td>TIA60</td><td>Microscópio</td></tr><tr><td>Elitedent Q-6</td><td>Rolence Enterprise</td><td>Q-6</td><td>Cirurgia: Lâmpada UV</td></tr><tr><td>Filtro de Emissão 510/80 nm</td><td>Chroma</td><td>ET510/80m</td><td>Microscópio</td></tr><tr><td>Barra de cabeça</td><td>Feito sob medida</td><td>ver arquivos suplementares</td><td>Câmara de gravação</td></tr><tr><td>Luz infravermelha</td><td>Thorlabs</td><td>M810L3</td><td>Registro de comportamento</td></tr><tr><td>Projetor de LED</td><td>AAXA</td><td>Projetor P2B LED Pico</td><td>Estímulo visual presente</td></tr><tr><td>Papel de papel úmido (Kimwipe)</td><td>Ciência Kimtech</td><td>34155</td><td>Cirurgia: papel úmido</td></tr><tr><td>Estágio de amostragem motorizado XY</td><td>Zaber</td><td>X-LRM050</td><td>Microscópio</td></tr><tr><td>Filtros de Densidade de Neutro (50% de Transmissão)</td><td>Thorlabs</td><td>NE203B</td><td>Estímulo visual presente</td></tr><tr><td>& Oslash; Suporte de 1/2"</td><td>ThorLabs</td><td>PH1.5V</td><td>Cirurgia: tubo oco para canhão</td></tr><tr><td>& Oslash; Poste óptico de aço inoxidável de 1/2"</td><td>ThorLabs</td><td>TR150/M</td><td>Cirurgia: módulo de carregamento de peixes</td></tr><tr><td>Lente objetiva 16x, 0,8NA</td><td>Nikon</td><td>CF175</td><td>Microscópio</td></tr><tr><td>Argila de modelagem à base de óleo</td><td>Ly Hsin Clay</td><td>C4086</td><td>Cirurgia: suporte da barra de cabeça</td></tr><tr><td>Adesivo óptico</td><td>Produtos Norland</td><td>NOA68</td><td>Cirurgia: cola curável por UV</td></tr><tr><td>Tubo fotomultiplicador</td><td>Hamamatsu</td><td>H11706P-40</td><td>Microscópio</td></tr><tr><td>Atuador piezo</td><td>Instrumento Physik &nbsp;</td><td>P-725.4CA PIFOC</td><td>Microscópio</td></tr><tr><td>Célula Pockels</td><td>Conópticos</td><td>M350-80-LA-BK-02</td><td>Microscópio</td></tr><tr><td>Filtro Red Wratten (> 600 nm)</td><td>Óptica Edmund</td><td>#53-699</td><td>Estímulo visual presente</td></tr><tr><td>Sistema de Varredura Ressonante-Galvo</td><td>INSS</td><td>RGE-02</td><td>Microscópio</td></tr><tr><td>Grampo de ângulo reto para &oslash; Poste de 1/2"</td><td>ThorLabs</td><td>RA90/M</td><td>Cirurgia: módulo de carregamento de peixes</td></tr><tr><td>Grampo Rotativo para &Oslash; Poste de 1/2"</td><td>ThorLabs</td><td>SWC/M</td><td>Cirurgia: módulo de carregamento de peixes</td></tr><tr><td>ScanImage</td><td>MBF Biociências</td><td>Versão básica</td><td>Microscópio</td></tr><tr><td>Tanque semi-hexagonal</td><td>Feito sob medida</td><td>ver arquivos suplementares</td><td>Câmara de gravação</td></tr><tr><td>Super-Bond C&; Uniforme B</td><td>Sun Medical Co.</td><td>Super-Bond C&; B</td><td>Cirurgia: cimento dentário</td></tr><tr><td>Metanassulfonato de tricaína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>Cirurgia: anestésico</td></tr><tr><td>Câmera USB</td><td>FLIR</td><td>BFS-U3-13Y3M-C</td><td>Registro de comportamento</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>Cirurgia: cola de tecido</td></tr></tbody></table>

imagem de cálcio de dois fótons da atividade do prosencéfalo em peixes-zebra adultos com comportamento

Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish

O peixe-zebra adulto (Danio rerio) exibe um rico repertório de comportamentos para o estudo das funções cognitivas. Eles também têm um cérebro em miniatura que pode ser usado para medir atividades em regiões cerebrais por meio de métodos de imagem óptica. No entanto, relatos sobre o registro da atividade cerebral em peixes-zebra adultos têm sido escassos. O presente estudo descreve procedimentos para a realização de imagens de cálcio de dois fótons no prosencéfalo dorsal de zebrafish adultos. Nós nos concentramos em etapas para impedir que peixes-zebra adultos movam suas cabeças, o que fornece estabilidade que permite imagens de varredura a laser da atividade cerebral. Os animais com a cabeça contida podem mover livremente suas partes do corpo e respirar sem ajudas. O procedimento visa encurtar o tempo da cirurgia de apoio de cabeça, minimizar o movimento cerebral e maximizar o número de neurônios registrados. Uma configuração para apresentar um ambiente visual imersivo durante a imagem de cálcio também é descrita aqui, que pode ser usada para estudar correlatos neurais subjacentes a comportamentos desencadeados visualmente.

O protocolo consiste em duas partes: cirurgia de apoio de cabeça e cintilografia de cálcio de dois fótons das atividades neuronais no prosencéfalo. O sucesso da cirurgia é definido pela sobrevivência do animal e pela estabilidade do apoio de cabeça. A taxa de sobrevida pode ser muito melhorada pela perfusão frequente da solução de EMT a 0,01% pela boca durante a cirurgia. Os peixes devem se recuperar da anestesia e respirar ativamente dentro de 1-2 minutos após serem imersos na água do tanque de peixes. A imagem de cálci...

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar imagens de cálcio de dois fótons no prosencéfalo dorsal de zebrafish adultos.

Imagem de cálcio de dois fótons da atividade do prosencéfalo em peixes-zebra adultos com comportamento

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used ...

O prosencéfalo dos peixes hospeda áreas suspeitas de serem homólogas a regiões cerebrais de mamíferos envolvidas em comportamentos complexos. Estes incluem o hipocampo, o córtex, e a amígdala. Atualmente, estamos tentando entender o efeito da informação sensorial sobre a atividade dessas regiões cerebrais.A pesquisa atual em neurociência de peixes-zebra usa imagens de dois fótons de cálcio de larvas imobilizadas. Combinado com ensaios de comportamento baseados em realidade virtual, para estudar o processamento sensório-motor no cérebro. A maioria das pesquisas sobre o cérebro do peixe-zebra é feita em larvas, no entanto, alguns comportamentos complexos em peixes não se desenvolvem completamente até a idade adulta.Nosso protocolo permite o estudo da atividade cerebral no adulto durante o comportamento. Este protocolo reduziu o tempo cirúrgico em cinquenta por cento em relação ao método anterior. É uma abordagem mais eficiente para conter a cabeça de peixes-zebra adultos para uma melhor imagem.Este protocolo de apoio de cabeça abriu uma oportunidade para realizar um experimento in vivo no cérebro de peixes-zebra adultos. Além da imagem de cálcio de dois fótons, o apoio de cabeça pote

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra o método para estudar a detecção visual de presas em larvas de peixe-zebra transgênicas usando imagens fluorescentes baseadas em indicadores de cálcio com seus neurônios expressando complexos indicadores de cálcio fluorescentes.

Analisando a atividade neuronal evocada por presas em uma larva de peixe-zebra transgênica

Fonte: Schramm, P. et al. Imagem in vivo de tecido cerebral totalmente ativo em larvas e juvenis de peixe-zebra acordados por remoção de crânio e pele. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra a imagem in vivo de neurônios cerebelares em larvas transgênicas de peixe-zebra, que expressam proteínas fluorescentes em neurônios de Purkinje. O processo envolve anestesiar as larvas, imobilizá-las em agarose e remover cuidadosamente a pele pigmentada para aumentar a penetração da luz e a intensidade da...

Imagem in vivo do cérebro larval de peixe-zebra para visualização de neurônios cerebelares

Um método simples para gravar os potenciais de campo extracelulares no larval do peixe-zebra é descrita prosencéfalo. O método proporciona um...

Prosencéfalo gravação eletrofisiológico em larval Zebrafish

Este artigo descreve como um peixe-zebra adulto podem ser imobilizados, entubado, e usado para experimentos in vivo eletrofisiológicos para permitir gravações e manipulação da atividade neural em um animal intacto.

Gravação eletrofisiológica no cérebro de Intacta Zebrafish Adulto

Aqui, apresentamos um protocolo para ablate uma subpopulação geneticamente rotulada de neurônios por um laser de dois fotões de larvas de peixe-zebra.

Ablação de uma população Neuronal, usando um Laser de dois fotões e sua avaliação usando imagens de cálcio e gravação comportamental em larvas de Zebrafish

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para investigar os mecanismos celulares subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso. Aqui descrevemos uma técnica para usar microscopia confocal de lapso de tempo para visualizar um grande número de células multicoloridas com rótulo barco-íris em tempo real dentro do sistema nervoso zebrafish em desenvolvimento.

Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo

Aqui apresentamos um método para a imagem do cérebro embrionário de zebrafish in vivo upto larval e juvenil estágios. Este procedimento microinvasivo, adaptado a partir de abordagens eletrofisiológicas, fornece acesso a detalhes celulares e subcelulares de neurônio maduro e pode ser combinado com estudos optogenéticos e neurofarmaológicos para caracterização da função cerebral e intervenção medicamentosa.

In vivo Imagem de Tecido Cerebral Totalmente Ativo em Larvas de Zebrafish Acordados e Juvenis por Remoção de Crânio e Pele

Apresentamos aqui um protocolo para imagens in vivo de todo o cérebro de larvas de peixes-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional. O procedimento experimental inclui preparo da amostra, aquisição e visualização das imagens.

In vivo Imagem do cérebro inteiro de larvas de peixe-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para examinar a atividade neural em regiões cerebrais de peixes-zebra transgênicos que expressam indicadores de cálcio GCaMP usando microscopia confocal.

In vivo Imagem de fluorescência confocal da atividade neural induzida por estimulação sensorial em peixes-zebra larvais parcialmente contidos

O vídeo atual demonstra um método que tira proveito da combinação de eletroporação e microscopia confocal para realizar imagens ao vivo em células individuais progenitoras neurais no cérebro anterior zebrafish em desenvolvimento.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Aprenda a realizar imagem de cálcio de dois fótons no prosencéfalo de peixes-zebra adultos durante comportamento. Este método permite visualizar a atividade neuronal individual em contextos comportamentais complexos.

Imagem de cálcio de dois fótons da atividade do prosencéfalo em peixes-zebra adultos com comportamento

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