Name: Knockdown direcionado de genes no plexo coroide (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 43 s
Description: Aprenda técnicas de knockdown gênico direcionado no plexo coroide usando injeções ICV e vetores AAV2/5 em modelos murinos. Este método permite estudar respostas imunes em doenças neurológicas como esclerose múltipla.

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Agradecemos o apoio da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Grant No. 31800903, concedido a W. Zheng) e do Wenzhou Science and Technology Project (No. Y2020426, concedido a Y. Y. Weng) por este trabalho.

Todos os procedimentos em animais descritos neste estudo foram conduzidos de acordo com as diretrizes descritas no Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Wenzhou.
1. Animais
<ol><li>Compre camundongos C57BL/6 machos com idade entre 8-12 semanas e pesando 20-22 g.</li>
	<li>Obter a linhagem transgênica Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) e camundongos machos A2ARflox/fox .</li>
	<li>Atribua aleatoriamente os camundongos a dois grupos e aloja-se em gaiolas, com um máximo de cinco camundongos por gaiola, sob um ciclo padrão de 12 h claro/12 h escuro por 1 semana.</li>
	<li>Fornecer aos ratos comida e água suficientes e mantê-los a uma temperatura constante a 25 °C.</li>
</ol>2. Knockdown específico de ChP de A2ARs com AAV2/5-shRNA
<ol><li>Pese cada mouse e anote os valores.</li>
	<li>Anestesiar os camundongos por via intraperitoneal com pentobarbital sódico a 1% na dose de 6-8 mL/kg equivalente a 60-80 mg/kg de pentobarbital e colocar o mouse em uma almofada de aquecimento para mantê-lo aquecido. NOTA: É crucial administrar a dosagem correta de pentobarbital sódico de acordo com o peso do rato para garantir o sucesso da cirurgia. A anestesia não deve ser muito profunda, pois pode resultar em mortalidade, mas não deve ser muito superficial, pois o camundongo pode acordar durante o procedimento, potencialmente afetando a eficácia da injeção do vírus. Verifique a dose adequada de anestesia por pinça dos dedos dos pés e certifique-se de que os ratos não respondem.</li>
	<li>Use um barbeador de rato especializado para aparar o cabelo superior dos ratos anestesiados.</li>
	<li>Aplique pomada ocular em ambos os olhos para evitar o ressecamento e fixe os ratos em um aparelho estereotáxico para imobilizar o cérebro. Cubra o animal com um campo estéril.</li>
	<li>Esterilize completamente a pele da cabeça e pescoço dos ratos com três rodadas de desinfetante iodóforo e álcool a 75% para reduzir a infecção pós-operatória. Em seguida, aplique lidocaína a 1% topicamente no couro cabeludo de camundongos e faça uma pequena incisão para expor totalmente o crânio sob um microscópio. OBS: Utilizar instrumentos estéreis durante todo o procedimento.</li>
	<li>Preparar duas seringas de 10 μL: uma com AAV2/5-A 2A R-shRNA comprado (título: 6,27 × 109 vg/μL) e outra com AAV2/5-Scramble comprado (título:6,21× 109 vg/μL). NOTA: Ao usar a seringa, a extremidade frontal precisa ser conectada a um capilar de vidro, e uma faixa de 10 μL pode ser obtida controlando o comprimento do capilar de vidro.</li>
	<li>Utilizar o microscópio para localizar o bregma e lambda e definir o ponto de coordenadas (AP: -0,58; LM: ±1,10; DL: -2,20) na seringa de 10 μL (Figura 1). O ponto coordenado é baseado no atlas estereotáxico cerebral de camundongos15.</li>
	<li>Faça um pequeno orifício no crânio no ponto de coordenada ajustado. NOTA: Sob o microscópio, a perfuração é realizada usando uma microbroca estéril contra a superfície do crânio. Após a perfuração, removendo as meninges que cobrem o cérebro e expondo o parênquima cerebral subjacente, a lesão nos vasos sanguíneos é evitada. Essa etapa evita que a ponta do capilar de vidro seja quebrada pelas meninges. O diâmetro do orifício perfurado deve ser suficiente para permitir que a ponta da agulha entre no tecido cerebral.</li>
	<li>Administrar 2 μL do vírus AAV2/5-A2AR-shRNA no ventrículo cerebral através de injeção lateral a uma taxa constante de 100 nL/min. Mantenha a agulha no lugar por 10 minutos antes de retirar. Note-se que o vírus foi administrado com injeção unilateral.</li>
	<li>Sele a pele lesionada usando cola de biofibrina médica imediatamente para evitar a perda de vírus, que pode ser enxaguado com LCR depois de remover a agulha se a cola não for aplicada rapidamente. Além disso, não use cotonetes para limpar o LCR, pois também pode causar perda de vírus.</li>
	<li>Para facilitar a recuperação, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal em 37,0 ± 0,5 °C e aplique lidocaína a 1% topicamente no couro cabeludo do mouse. Permitir que os camundongos se recuperem por 2 semanas antes de induzir o modelo EAE, pois esse período é necessário para a expressão do vírus AAV2/5-A2AR-shRNA e subsequente knockdown A2AR.</li>
</ol>3. Knockdown específico de ChP de A2AR com um Cre/locus do sistema X-overP1 (Cre/LoxP)
Observação : os procedimentos a seguir podem ser obtidos usando o método descrito anteriormente. Consulte os passos 2.1-2.11 para obter métodos de injeção detalhados.
<ol><li>Injetar 2 μL de CRE-TAT recombinase em cada ventrículo lateral de um camundongo Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato como grupo experimental e 2 μL de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) como grupo controle. Usando o mesmo protocolo acima (seção 2), injete 2 μL de CRE-TAT recombinase em cada um dos ventrículos laterais de camundongos A2AR flox/flox juntamente com 2 μL de PBS estéril como grupo controle.</li>
	<li>Preparar cortes de tecido congelado e realizar coloração nuclear 2 semanas após a injeção de CRE-TAT recombinase. Consulte as etapas 4.1-4.3 para obter mais informações.</li>
</ol>4. Perfusão transcárdica em camundongos
<ol><li>Administrar 60-80 mg/kg de pentobarbital sódico para anestesiar profundamente os camundongos. Confirmar o plano de anestesia por uma pinça dos dedos dos pés e realizar a perfusão transcárdica usando 40 mL de solução estéril de PBS seguida de 20 mL de paraformaldeído (PFA) a 4%. NOTA: A perfusão bem-sucedida é indicada por uma cor branca no fígado, enquanto a presença de pulmões aumentados ou saída de PBS da boca durante a perfusão sugere uma falha do procedimento.</li>
	<li>Extraia rapidamente o cérebro do rato, garantindo uma degradação mínima das proteínas.</li>
	<li>Submergir o cérebro de camundongos em PFA/PBS a 4% durante a noite para pós-fixação, seguido de substituição por solução de sacarose PB a 30% por 72 h. NOTA: É fundamental evitar a desidratação excessiva do tecido cerebral, por isso o cérebro não deve ser deixado na solução de sacarose PB por muito tempo.</li>
</ol>5. Corte e coloração de tecidos congelados
<ol><li>Incorpore o cérebro de camundongo previamente desidratado em cola de temperatura de corte ideal (OCT), congele o cérebro embutido e use um micrótomo deslizante para cortar seções coronais com uma espessura de 20 μm.</li>
	<li>Coloque as seções cerebrais na lâmina de vidro. Quando as seções cerebrais estiverem secas, armazene-as em uma geladeira de -20 °C para experimentos subsequentes.</li>
	<li>Coloque cada lâmina de vidro em uma caixa de moldura e submerja a moldura em um recipiente cheio de PBS para enxaguar completamente a lâmina. Enxaguar suavemente as lâminas cerebrais com solução de PBS três vezes, por 10 min cada vez. NOTA: Deve-se ter cuidado para evitar que as seções cerebrais caiam da lâmina de vidro.</li>
	<li>Manchar as lâminas cerebrais com solução de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 10 min.</li>
	<li>Enxaguar as lâminas cerebrais com solução PBS por 5 min.</li>
	<li>Aplique uma gota de meio de montagem antifade nas seções cerebrais.</li>
	<li>Coloque uma lamínula nas seções cerebrais, sele a lamínula com esmalte e analise as seções usando um microscópio de fluorescência convencional.</li>
</ol>6. Indução do EAE
NOTA: Realizar indução de EAE após 2 semanas da injeção de shRNA ou CRE-TAT recombinase11.
<ol><li>Criar uma solução aquosa misturando 2,5 mg de glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG35-55) com 2 mL de PBS. Preparar uma solução completa de óleo de adjuvante de Freunds (CFA) misturando M. tuberculosis (H37Ra) com adjuvante de Freunds incompleto (IFA).</li>
	<li>Misture as soluções aquosas e oleosas na proporção de 1:1. Use um tubo de tee para bater a mistura em um estado de óleo em água. NOTA: O tee pipe também é chamado de tubo de três vias. É um tubo de plástico que pode controlar a direção da solução de fluxo para misturar totalmente o MOG35-55 e CFA.</li>
	<li>Use um homogeneizador de alta velocidade para fazer a emulsão de antígeno MOG para o modelo EAE em condições de banho de gelo.</li>
	<li>Anestesiar os camundongos por via intraperitoneal com pentobarbital sódico a 1% na dose de 6-8 mL/kg equivalente a 60-80 mg/kg de pentobarbital.</li>
	<li>Injetar subcutaneamente a emulsão do antígeno MOG em quatro pontos diferentes (pescoço, costas, quadris esquerdo e direito) a um volume de 10 mL/kg para um total de quatro injeções cada. NOTA: É importante selecionar cuidadosamente o local de injeção, pois diferentes locais podem ter efeitos variados na morbidade e mortalidade de camundongos. Além disso, injeções repetidas de MOG podem levar à tolerância imunológica, então a equipe de pesquisa escolheu um único método de injeção para evitar esse problema potencial.</li>
	<li>Injetar imediatamente 500 ng/mL de toxina pertussis (TP) por via intraperitoneal na dose de 5 mg/kg após a injeção de MOG. NOTA: O PT aumenta a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE) e facilita a infiltração de células T no cérebro.</li>
	<li>Após 48 h, injetar intraperitonealmente a solução de TP no mesmo volume.</li>
</ol>7. Escore de déficit neurológico
<ol><li>Avaliar e classificar os camundongos diariamente usando uma escala de classificação16 que varia de 0 a 15 para avaliar a incidência e gravidade do EAE de acordo com os seguintes déficits neurológicos: Cauda: 0 indica nenhum sinal, 1 representa uma cauda semiparalisada e 2 indica uma cauda totalmente paralisada. Membros: 0 indica nenhum sinal, 1 representa uma marcha fraca ou alterada, 2 indica paresia e 3 representa um membro totalmente paralisado.</li>
	<li>Atribua a um animal tetraplégico com paralisia completa uma pontuação de 12 e atribua à mortalidade uma pontuação de 15.</li>
</ol>8. Coloração hematoxilina-eosina (H&E)
<ol><li>Pegue o cérebro de camundongo desidratado e embuta-o em parafina derretida. Deixe o bloco de parafina esfriar e solidificar para uso posterior. NOTA: O bloco de parafina deve estar completamente seco e fresco para evitar danos teciduais.</li>
	<li>Corte o bloco de parafina cerebral de camundongo em lâminas de 5 μm de espessura. Coloque a secção do cérebro do rato em parafina numa lâmina de vidro e seque-a num forno a 60 °C durante 3 horas.</li>
	<li>Submergir as lâminas sequencialmente em solução de xileno I por 10 min, solução de xileno II por 10 min, álcool 100% I por 3 min, álcool 100% II por 3 min, álcool 95% por 3 min, álcool 90% por 3 min, álcool 80% por 3 min, álcool 70% por 3 min e água destilada por 1 min.</li>
</ol>9. Análise quantitativa da reação em cadeia da polimerase (qPCR)
<ol><li>Depois de perfundir os camundongos com PBS, remova a ChP dos ventrículos e extraia o RNA com Trizol. Sintetizar o cDNA usando o primeiro Strand cDNA Synthesis Kit.</li>
	<li>Realize análise de qPCR usando pré-mistura verde Ex Taq SYBR e um sistema de PCR em tempo real. Use os seguintes primers A2AR: forward - GCCATCCCATTCGCCATCA; reverso - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.</li>
</ol>

Silenciamento seletivo de genes no plexo coróide

<ol><li>Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+secretion+by+the+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus.</a> Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).</li>
<li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li>
<li>Wolburg, H., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus: biology and pathology.</a> Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).</li>
<li>Solar, P., Zamani, A., Kubickova, L., Dubovy, P., Joukal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier in disease.</a> Fluids Barriers CNS. 17 (1), 35(2020).</li>
<li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+in+health+and+in+disease%3A+dialogues+into+and+out+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain.</a> Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).</li>
<li>Myung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+is+an+important+circadian+clock+component%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus is an important circadian clock component.</a> Nature Communications. 9 (1), 1062(2018).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+FOXJ1-Cre+system+for+gene+inactivation+in+ciliated+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A transgenic FOXJ1-Cre system for gene inactivation in ciliated epithelial cells.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (5), 515-519 (2007).</li>
<li>Johansson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Otx2+regulates+choroid+plexus+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Otx2 regulates choroid plexus development and function.</a> Development. 140 (5), 1055-1066 (2013).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus+NKCC1+mediates+cerebrospinal+fluid+clearance+during+mouse+early+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus NKCC1 mediates cerebrospinal fluid clearance during mouse early postnatal development.</a> Nature Communications. 12 (1), 447(2021).</li>
<li>Spatazza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid-plexus-derived+Otx2+homeoprotein+constrains+adult+cortical+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Choroid-plexus-derived Otx2 homeoprotein constrains adult cortical plasticity.</a> Cell Reports. 3 (6), 1815-1823 (2013).</li>
<li>Zheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus-selective+inactivation+of+adenosine+A2A+receptors+protects+against+T+cell+infiltration+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus-selective inactivation of adenosine A2A receptors protects against T cell infiltration and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 52(2022).</li>
<li>Steffensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotransporter-mediated+water+transport+underlying+cerebrospinal+fluid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cotransporter-mediated water transport underlying cerebrospinal fluid formation.</a> Nature Communications. 9 (1), 2167(2018).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klotho+controls+the+brain-immune+system+interface+in+the+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Klotho controls the brain-immune system interface in the choroid plexus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (48), E11388-E11396 (2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+serotypes+of+adeno-associated+virus+vector-+and+lentivirus-mediated+tropism+in+choroid+plexus+by+intracerebroventricular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Different serotypes of adeno-associated virus vector- and lentivirus-mediated tropism in choroid plexus by intracerebroventricular delivery.</a> Human Gene Therapy. 31 (7-8), 440-447 (2020).</li>
<li>Konsman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">The mouse brain in stereotaxic coordinates.</a> Psychoneuroendocrinology. 6 (28), 827-828 (2003).</li>
<li>Weaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elevated+matrix+metalloproteinase+%28MMP%29+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis+is+protective+by+affecting+Th1%2FTh2+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">An elevated matrix metalloproteinase (MMP) in an animal model of multiple sclerosis is protective by affecting Th1/Th2 polarization.</a> FASEB J. 19 (12), 1668-1670 (2005).</li>
<li>Kertser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroid+signaling+at+the+brain-immune+interface+impedes+coping+with+severe+psychological+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress.</a> Science Advances. 5 (5), 4111(2019).</li>
<li>Kaiser, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEIS-WNT5A+axis+regulates+development+of+fourth+ventricle+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus.</a> Development. 148 (10), (2021).</li>
<li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Reboldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-C+chemokine+receptor+6-regulated+entry+of+TH-17+cells+into+the+CNS+through+the+choroid+plexus+is+required+for+the+initiation+of+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17 cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE.</a> Nature Immunology. 10 (5), 514-523 (2009).</li>
<li>Jovanova-Nesic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus+connexin+43+expression+and+gap+junction+flexibility+are+associated+with+clinical+features+of+acute+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus connexin 43 expression and gap junction flexibility are associated with clinical features of acute EAE.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1173, 75-82 (2009).</li>
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<li>Mills, J. H., Alabanza, L. M., Mahamed, D. A., Bynoe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+adenosine+signaling+induces+CX3CL1+expression+in+the+brain+to+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Extracellular adenosine signaling induces CX3CL1 expression in the brain to promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 193(2012).</li>
</ol>

Os autores afirmam que não têm interesses financeiros concorrentes ou outras divulgações a declarar.

A pesquisa apresentou duas abordagens distintas para o knockdown direcionado de genes ChP. A primeira abordagem envolveu a injeção ICV de CRE-TAT, que contém Cre recombinase, em camundongos A2AR flox/flox. A segunda abordagem envolveu a injeção de ICV de AAV2/5 carregando shRNA de A2AR. Utilizando essas duas estratégias, o trabalho conseguiu o knockdown seletivo de A 2A R dentro da ChP e foi capaz de demonstrar os efeitos protetores da inibição da sinalização A2AR na ChP na pat...

Acreditava-se que o plexo coroide (PCc) ajudava a manter a homeostase funcional do cérebro por meio da secreção de líquido cefalorraquidiano (LCR) e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)1,2. Pesquisas crescentes nas últimas três décadas têm revelado que a ChP representa uma via distinta para a infiltração de células imunes no sistema nervoso central (SNC).
As tight junctions (TJs) da ChP, compostas por um epitélio de ChP monocamada, mantêm a homeostase imunológica, impedindo a entrada de macromoléculas e células imunes no cérebro3. No entanto, sob certas condições patológicas, o tecido ChP detecta e responde a padrões moleculares associados ao perigo (DAMPs) no LCR e no sangue, levando a infiltração imunológica anormal e disfunção cerebral 4,5. Apesar de seu papel crítico, o pequeno tamanho da ChP e a localização única no cérebro dificultam o estudo de sua função sem afetar outras regiões cerebrais. Portanto, manipular a expressão gênica especificamente na ChP é uma abordagem ideal para entender sua função.
Inicialmente, linhagens transgênicas da enzima de recombinação de ciclização (Cre), que expressam Cre sob o controle de promotores específicos de genes expressos na ChP, foram comumente utilizadas para deletar genes-alvo por meio de cruzamento com genes candidatos floxados 6,7,8. Por exemplo, o fator de transcrição Forkhead box J1 (FoxJ1) é expresso exclusivamente no epitélio ChP do cérebro pré-natal de camundongos7. Assim, a linhagem FoxJ1-Cre foi frequentemente utilizada para deletar genes localizados na ChP 6,9. No entanto, o sucesso desta estratégia depende muito da especificidade do promotor. Descobriu-se gradualmente que o padrão de expressão de FoxJ1 não era suficientemente distinto, pois FoxJ1 também estava presente em células epiteliais ciliadas em outras partes do cérebro e sistema periférico7. Para superar essa limitação, foi realizada injeção intracerebroventricular (ICV) de Cre recombinase para liberar a recombinase nos ventrículos das linhas transgênicas floxed. Essa estratégia apresentou alta especificidade, evidenciada pela presença de fluorescência do tdTomato apenas no tecido daChP10,11. No entanto, este método ainda é limitado pela disponibilidade de linhagens de camundongos transgênicos floxed. Para resolver essa questão, pesquisadores têm empregado a injeção de ICV de vírus adenoassociado (AAV) para alcançar knockdown específico de ChP ou a superexpressão de genes-alvo12,13. Uma avaliação abrangente de diferentes sorotipos de AAV para infecção por ChP revelou que AAV2/5 e AAV2/8 exibem fortes habilidades de infecção na ChP, enquanto não infectam outras regiões cerebrais. No entanto, AAV2/8 infectou o ependima ao redor dos ventrículos, enquanto o grupo AAV2/5 não apresentou infecção14. Este método tem a vantagem de superar as limitações da aquisição de animais transgênicos floxed.
Este artigo descreve um protocolo passo-a-passo para knockdown gênico na ChP usando dois métodos: ICV de AAV2/5 carregando shRNA do receptor de adenosina A 2A (A 2A R) e proteína Cre recombinase consistindo de sequência TAT (CRE-TAT) recombinase para alcançar knockdown ChP-específico de A2A R. Os resultados do estudo sugerem que derrubar A2AR na ChP pode aliviar a encefalomielite autoimune experimental (EAE). Este protocolo detalhado fornece orientação útil para estudos da função ChP e knockdown específico de genes na ChP.

<table><tbody><tr><td>Camundongos A2ARflox/flox</td><td>Laboratório Estadual de Oftalmologia, Optometria e Ciências Visuais, Universidade</td><td></td><td></td>Médica de Wenzhou</tr><tr><td>AAV2/5-A2AR-ShRNA vírus</td><td>Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD</td><td>pt-4828</td><td></td></tr><tr><td>meio de montagem antifade</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>capilar de vidro de borosilicato</td><td>Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>aparelho estereotáxico cerebral</td><td>RWD, Shenzhen</td><td>69100</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6 camundongos</td><td>Pequim Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRE-TAT recombinase</td><td>Millipore</td><td>SCR508</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Absin</td><td>B25A031</td><td></td></tr><tr><td>máquina de fatiar congelada</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>H37Ra</td><td>Becton Dickinson e companhia</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>seringa Hamilton</td><td>Hamilton, American</td><td>P/N:&nbsp; 86259</td><td></td></tr> microscópio <tr><td>confocal</td> adjuvante incompleto <td>Zeiss</td><td>LSM900</td><td></td>do laser de</tr><tr><td>Freunds</td><td>Sigma</td><td>F5506</td><td></td></tr><tr><td>MOG35-55</td><td>Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD</td><td>4010006243</td><td></td></tr><tr><td>OCT cola</td><td>Epredia</td><td>6502p</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeído</td><td>Chengdu Kelong reagente químico Empresa</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>pentobarbital sódico</td> Pistola <td>de pipeta PC13003</td><td></td><td>Boyun Biotech</td></tr> Kit de síntese de cDNA <tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>N45014F</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript 1ª fita</td><td>Takara</td><td>&nbsp; 6110A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR em Tempo Real</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato camundongos</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sacarose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A502792-0500</td><td></td></tr><tr><td>homogeneizador de super alta velocidade</td><td>IKA</td><td>3737025</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>solução</td> de xileno 15596026 <td></td></tr><tr><td></td><td>Empresa de reagentes químicos Chengdu Kelong</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

knockdown direcionado de genes no plexo coroide

Targeted Knockdown of Genes in the Choroid Plexus

O plexo coroide (PCh) serve como uma porta de entrada crítica para a infiltração de células imunes no sistema nervoso central (SNC) em condições fisiológicas e patológicas. Pesquisas recentes mostraram que regular a atividade da ChP pode oferecer proteção contra distúrbios do SNC. No entanto, estudar a função biológica da ChP sem afetar outras regiões cerebrais é um desafio devido à sua estrutura delicada. Este estudo apresenta um novo método para knockdown gênico em tecido ChP usando vírus adenoassociados (AAVs) ou enzima de recombinação de ciclização (Cre) proteína recombinase consistindo de sequência TAT (CRE-TAT). Os resultados demonstram que, após a injeção de AAV ou CRE-TAT no ventrículo lateral, a fluorescência foi concentrada exclusivamente na ChP. Usando esta abordagem, o estudo derrubou com sucesso o receptor de adenosina A 2A (A2A R) na ChP usando RNA de interferência (RNAi) ou Cre/locus de sistemas X-overP1 (Cre/LoxP), e mostrou que esse knockdown poderia aliviar a patologia da encefalomielite autoimune experimental (EAE). Essa técnica pode ter implicações importantes para pesquisas futuras sobre o papel da ChP nos distúrbios do SNC.

knockdown de A2AR específico para ChP por injeção ICV de AAV2/5-shRNA ou CRE-TAT O papel de A2AR na ChP como um poderoso regulador da informação neural na patogênese do EAE permanece obscuro. Derrubar a expressão de A 2A R específica de ChP poderia lançar luz sobre os efeitos regulatórios de A2AR no sistema imunológico central em EAE e outras inflamações do sistema nervoso. Este estudo usou a injeção ICV de CRE-TAT para diminuir a expressão de A 2A R na ChP ...

Aqui, descrevemos um método para alterar seletivamente a expressão gênica no plexo coroide, evitando qualquer impacto em outras áreas cerebrais.

Knockdown direcionado de genes no plexo coroide

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and ...

O objetivo desta pesquisa é investigar as técnicas de manipulação da expressão gênica no plexo coroide. Nosso estudo introduziu os dois métodos que permitem a técnica exclusivamente no plexo coroide, sem qualquer impacto discernível em outras regiões. Nossos achados podem potencialmente melhorar futuros estudos da função do plexo coroide em neurociência.Nossa pesquisa revisou que inibir a infiltração de células T através do plexo coroide através do bloqueio seletivo de adenosina para um receptor é suficiente para proteger camundongos da patologia EAE. Esse achado reforça a noção de que a detecção da atividade porta de entrada no plexo coroide poderia representar uma nova estratégia promissora para o tratamento da esclerose múltipla. Este estudo apresenta dois métodos alternativos para manipulação da expressão gênica no plexo coroide.Injeção de ICV de Cre recombinase nesses camundongos transgênicos ou injeção de ICV de AAV2/5, ou é alvo de SHI nos camundongos WT. Esses métodos superam problemas com a promoção da especificidade e do melhoramento transgenético de camundongos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um método para condicionalmente knockdown expressão de uma proteína alvo na retina zebrafish adulto é descrito, que envolve a injeção intravítrea injeção morpholinos antisense e electroporating-los na retina. A proteína resultante é derrubado por vários dias, o que permite testar o papel da proteína na regeneração ou retina intacta.

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

Neste vídeo, demonstramos um método para realizar a transdução de vetores lentivirais shRNA para obter linhagens celulares knockdown estáveis em células-tronco hematopoiéticas e progenitoras imortalizadas (iHSPCs).

Nocaute de gene mediado por RNA de grampo curto em iHSPCs in vitro: um sistema de expressão de shRNA baseado em lentivírus em iHSPCs para knockdown de expressão gênica específica

Nós demonstramos uma técnica minimamente invasiva referido como eletroporação zona neonatal subventricular. A técnica consiste em injectar o DNA de plasmídeo nos ventrículos laterais de bebés recém-nascidos e na aplicação de corrente eléctrica para fornecer e manipular geneticamente as células estaminais...

Eletroporação Zona Neonatal subventricular

Neste artigo, é demonstrar um método para a manipulação da expressão de genes nas células dos ventrículos do telencéfalo peixe-zebra adultos utilizando oligonucleótidos anti-sentido morfolino. Apresenta-se este método como um protocolo eficiente e rápida, que pode ser utilizado para estudos funcionais no cérebro adulto vertebrado.

Micromanipulação de expressão gênica no cérebro adulto Zebrafish Usando microinjeção Cerebroventricular de Morpholino Oligonucleotides

Linhas celulares Repórter oferecer um meio de visualizar, monitorar e isolar as células de interesse de populações heterogêneas. No entanto, utilizando a recombinação homóloga convencional em células estaminais embrionárias humanas-alvo do gene é extremamente ineficiente. Relata-se alvo CNS mesencéfalo específico fator de transcrição PITX3 loco com EGFP usando zinc-finger nuclease reforçada recombinação homóloga.

Zinc-finger nucleases Gene maior focalização em células estaminais embrionárias humanas

Periventricular nodular heterotopia (PNH) é a forma mais comum de malformação do desenvolvimento cortical (MCD) na idade adulta, mas sua base genética permanece desconhecida em casos mais esporádicos. Recentemente desenvolvemos uma estratégia para identificar genes candidatos romance para MCDs e confirmar diretamente seu papel causal em vivo.

Uma nova estratégia combinando Array-CGH, todo-exome sequenciamento e eletroporação no Utero em roedores para identificar Genes causadores de malformações do cérebro

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho sobre como combinar artificial microRNA mediada por RNA interferência com optogenetics para estimular especificamente pré-sináptica boutons com reduzida expressão de genes seletiva dentro de circuitos neuronais intactos.

Combinação de Optogenetics com microRNAs Artificial para caracterizar os efeitos do Gene Knockdown na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intacta

No presente estudo, a expressão é derrubada de dois componentes sinalizadores a jusante da via PERK, a calcineurina citoprotetora e o CHOP pró-apoptótico, utilizando shRNAs específicos. De maneiras opostas, eles modulam a suscetibilidade dos neurônios corticais primários à atrofia da neurite após a indução do estresse do retículo endoplasmático.

Modulação molecular por shRNAs específicos entregues por lentivírus em neurônios estressados do retículo endoplasmático

Desenvolvemos uma nova abordagem de perda de função que envolve a introdução e integração genômica de sequências artificiais de micro-RNA em embriões de pintinhos usando eletroporação em ovo e o sistema transposon Tol2. Esta técnica fornece uma metodologia robusta e estável de knockdown gênico para estudos da função gênica durante o desenvolvimento.

Abordagem da Perda de Função na Retina de Pintinhos Embrionários Utilizando a Expressão Transgênica Mediada por Transposon Tol2 de MicroRNAs Artificiais

A eletroporação de organoides cerebrais de primatas fornece uma abordagem precisa e eficiente para introduzir modificações genéticas transitórias em diferentes tipos de progenitores e neurônios em um sistema modelo próximo ao desenvolvimento do neocórtex (pato)fisiológico de primatas. Isso permite o estudo de processos neurodesenvolvimentais e evolutivos e também pode ser aplicado para modelagem de doenças.

Microinjeção Direcionada e Eletroporação de Organoides Cerebrais de Primatas para Modificação Genética

Aqui, apresentamos a manipulação genética aguda de organoides corticais humanos fatiados por eletroporação. Esses modelos organoides corticais são particularmente passíveis de injeção, pois estruturas semelhantes a ventrículos podem ser prontamente identificadas após o corte, permitindo a investigação funcional do desenvolvimento cortical humano, distúrbios do neurodesenvolvimento e evolução cortical.

Eletroporação de organoides corticais humanos fatiados para estudos da função gênica

Aprenda técnicas de knockdown gênico direcionado no plexo coroide usando injeções ICV e vetores AAV2/5 em modelos murinos. Este método permite estudar respostas imunes em doenças neurológicas como esclerose múltipla.

Knockdown direcionado de genes no plexo coroide

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