Name: Células estromais mesenquimais derivadas de tecido adiposo co-cultivadas com glia mista primária para reduzir a inflamação induzida por príons (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprenda a co-cultura de células estromais mesenquimais derivadas de tecido adiposo com glia mista primária para reduzir a inflamação induzida por príons em doenças neurodegenerativas. Este método demonstra potencial terapêutico.

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Os autores agradecem à Lab Animal Resources por sua criação de animais. Nossas fontes de financiamento para este manuscrito incluem o Fundo Boettcher, o Fundo Murphy Turner, a Faculdade de Medicina Veterinária da CSU e o Conselho de Pesquisa da Faculdade de Ciências Biomédicas. A Figura 2A, a Figura 2C e a Figura 3A foram criadas com BioRender.com.

Os camundongos foram criados e mantidos no Lab Animal Resources do Colorado State, credenciado pela Association for Assessment and Accreditation of Lab Animal Care International, de acordo com o protocolo # 1138, aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Colorado State University.
1. Isolar e infectar glia mista cortical primária com príons
<ol><li>Para isolar a glia mista primária contendo astrócitos e microglia, obtenha filhotes de camundongos C57Bl / 6 com idade entre zero e dois dias de idade. NOTA: Este protocolo é adaptado de protocolos anteriores 15,16.</li>
	<li>Eutanasiar os filhotes, um de cada vez, por decapitação e extrair seu cérebro, separando e descartando o cerebelo e o tronco cerebral.<ol><li>Coloque o cérebro em uma placa de Petri de 3 cm contendo MEM/EBSS frio com 2x Penicilina/estreptomicina/neomicina (PSN). Sob um escopo de dissecação, separe os hemisférios cerebrais e remova e descarte o mesencéfalo. Remova e descarte o hipocampo e as meninges do córtex.</li>
		<li>Coloque ambos os hemisférios corticais em um tubo cônico de 50 mL contendo 5 mL de MEM/EBSS + 2x PSN e coloque no gelo.</li>
	</ol></li>
	<li>Em uma capa de cultura de tecidos, remova o meio do tubo cônico de 50 mL aspirando suavemente com uma pipeta, deixando os pedaços de tecido cortical no fundo do tubo. Com uma pipeta de vidro revestida, adicione 10 mL de meio de dissociação pré-aquecido e triture o tecido com a pipeta de vidro 10-20x.</li>
	<li>Transferir a suspensão para um copo de 50 ml contendo um pequeno barra de agitação e colocar numa placa de agitação na posição mais baixa, cerca de 30 rpm, durante 10 min. Retire o copo da placa de agitação e coloque-o num ângulo de 30° durante 3 minutos para permitir que o tecido assente no fundo. Remova a suspensão celular (sobrenadante) e transfira para um novo tubo cônico de 50 mL no gelo.</li>
	<li>Adicione DNase-I (4.000 U / mL) a 10 mL de meio de dissociação e ressuspenda o tecido e mexa por mais 10 minutos. Repita adicionando novos meios de dissociação (sem DNase-I) 2-4 vezes adicionais (uma vez para cada dois filhotes de camundongo usados) e transferindo a suspensão celular para o tubo cônico de 50 mL no gelo, até que apenas o tecido fibroso permaneça no fundo do béquer.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular no tubo cónico durante 10 min a 1.000 × g a 4 °C. Aspirar o sobrenadante e substituí-lo por meio de crescimento glial. Conte as células com um hemocitômetro e coloque as células em placas com uma densidade de 106 em placas tratadas com cultura de células de 10 cm. Colocar numa incubadora a 37 °C com 5% de CO2.</li>
	<li>Após 24 h, remova a mídia e substitua-a por uma nova mídia glial. Deixe as células atingirem 100% de confluência em 2 semanas; Em seguida, divida e coloque em placas para experimentação.</li>
	<li>Para infecção por príon in vitro , placa glia a 100.000 células por poço em placas de 6 poços e deixe atingir 80% -100% de confluência. Exponha homogeneizados cerebrais, tanto príon quanto normais, diluídos a 20% em PBS à luz UV por 30 minutos antes de adicionar à cultura de células. Aspire o meio da glia a ser infectada e, a cada poço, adicione 1,5-2 mL de meio de crescimento glial contendo um volume final de 0,1% de homogeneizado cerebral normal ou príon.</li>
	<li>Após 72 h, aspirar o meio e lavar as células com PBS para remover qualquer homogeneizado cerebral residual. Substitua por meios de crescimento glial frescos (sem homogeneizados cerebrais).</li>
	<li>Para isolar as células AdMSCs, use uma pipeta sorológica e aspire suavemente o tecido adiposo junto com ~ 1 mL de solução de HBSS / tripsina. Transferir para uma placa de Petri de 4 cm contendo 2 ml de meio DMEM/F12 com 200 U/ml de mistura de DNase-I e 400 U/ml de colagenase/Dispase. Com uma tesoura pequena, corte os pedaços de tecido adiposo em pedaços pequenos (menos de 5 mm de tamanho) e incube a 37 ° C por 1,5 h.</li>
	<li>Transfira o conteúdo da placa de Petri para um tubo cônico de 50 mL com uma pipeta sorológica e triture a mistura ~ 10x com a pipeta. Certifique-se de que o tecido se rompa facilmente e forme uma mistura relativamente homogênea. Centrifugue a mistura a 4 °C por 5 min a 1.000 × g para granular a fração vascular estromal, que aparecerá em vermelho.</li>
	<li>Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e lavar o sedimento com 5 ml de PBS estéril pré-aquecido e centrifugar a 4 °C a 1.000 × g durante 3 min. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio AdMSC (DMEM com baixo teor de glicose contendo L-glutamina e suplementado com 15% de soro fetal bovino inativado pelo calor (hiFBS), 1% de aminoácidos, 1% de aminoácidos não essenciais e 1% de PSN).</li>
	<li>Coloque um filtro de células de 40 μm em cima de um tubo cônico estéril fresco de 50 mL e pipete a suspensão celular através do filtro para remover qualquer tecido não dissociado. Adicione 9 mL de meio AdMSC a um prato tratado com cultura de células de 10 cm e pipete a suspensão de células coadas no prato. Colocar numa incubadora a 37 °C com 5% de CO2.</li>
	<li>Remova e substitua por um novo meio AdMSC no dia seguinte. Espere que as células se tornem 80-90% confluentes quando estiverem prontas para serem passadas entre 72 h e 96 h.</li>
	<li>Isole as AdMSCs conforme descrito acima e passe duas vezes para obter uma população homogênea consistente 14. Lave as células duas vezes com PBS estéril e pipete 2 mL de tripsina pré-aquecida (0,25%) em cada placa. Incubar as células a 37 °C durante 5 minutos ou até que se desloquem completamente da placa. Adicione 8 mL de meio AdMSC pré-aquecido a cada placa, pipete para misturar a suspensão celular, transfira para o tubo cônico e centrifugue a 1.000 × g a 4 ° C para pellet.</li>
	<li>Ressuspenda as AdMSCs em 3-10 mL de meio (dependendo do número de placas usadas) e conte as células usando um hemocitômetro. Placa de 100.000 células/poço em placas de 6 poços contendo meios AdMSC. Colocar numa incubadora a 37 °C com 5% de CO2 durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, estimule as células com citocinas ou homogeneizado cerebral.<ol><li>Para células estimuladas por citocinas, faça meios AdMSC contendo 10 ng/mL de TNFα ou 200 ng/mL de IFNγ. Use meios novos para poços de controle.</li>
		<li>Para tratamentos com homogeneizado cerebral infectado por príons, obtenha 20% de homogeneizado cerebral (em PBS) de camundongos príons infectados terminalmente (cepas 22L ou RML). Faça AdMSC com uma concentração final de 0,1% de homogeneizado cerebral infectado por príons ou normal para controles.</li>
		<li>Aspire o meio dos poços e pipete 1,5 mL de meio contendo citocinas ou homogeneizado cerebral para os poços correspondentes. Execute em triplicado. Devolva as placas para a incubadora.</li>
	</ol></li>
	<li>Remova o meio, lave as células 2x com PBS pré-aquecido, isole o RNA adicionando 350 mL de tampão de lise contendo 1% de βME a cada poço e use um levantador de células para remover os lisados celulares. Realize o isolamento de RNA seguindo o protocolo do fabricante do mini kit, incluindo uma etapa de digestão DNase. Para RT-qPCR, transcreva reversamente 25 ng de RNA por amostra e amplifice o cDNA com SYBR Green e primers para cada gene a 10 mM. Analise a expressão de mRNA usando o método 2-ΔΔCT e normalize para a expressão do gene de referência β-actina 17. NOTA: Todos os RT-PCR foram feitos seguindo as diretrizes do MIQE.</li>
	<li>Placa BV2 microglia a 50.000 células por poço, ou glia mista primária a 100.000 células por poço em uma placa de 6 poços. Trate as células BV2 no dia seguinte com meios contendo 0,1% de homogeneizado cerebral normal ou infectado por príons. Para glia mista, espere até que as células sejam 80-90% confluentes para infectar com o homogeneizado cerebral.</li>
	<li>Incubar as células em meios contendo homogeneizado cerebral por 72 h. Lave as células 2x com PBS para remover o homogeneizado cerebral restante e adicione meios frescos e retorne à incubadora.</li>
	<li>Use AdMSCs na passagem 3 para co-cultura. Se estimular AdMSCs, use meios contendo 10 ng/mL de TNFα e trate por 24 h antes da co-cultura com BV2 ou glia mista. Lave AdMSCs estimuladas 3x com PBS para remover qualquer TNFα restante.</li>
	<li>Tripsinize AdMSCs conforme descrito na etapa 1.15 e ressuspenda no meio AdMSC.</li>
	<li>Gire a suspensão AdMSC a 1.000 × g a 4 °C por 5 min. Durante esse período, substitua o meio nas células BV2 ou glia mista por 2 mL por poço de meio AdMSC e coloque inserções para placas de 6 poços com um tamanho de poro de 0,4 micrômetros na metade dos poços. Adicione 2 mL de mídia AdMSC a cada inserção e mais 2 mL de mídia aos poços que não recebem inserções.</li>
	<li>Quando terminar de peletizar AdMSCs, ressuspenda o pellet no meio AdMSC. Conte as AdMSCs com um hemocitômetro e adicione 50.000-100.000 células a cada inserção.</li>
	<li>Para células BV2, incubar coculturas por 24 h. Para glia mista, incubar por apenas 24 h e até 7 dias.</li>
	<li>Após a incubação com AdMSCs pelo tempo desejado, remova as inserções e descarte-as ou coloque-as em uma nova placa de 6 poços, lave as inserções 2x com PBS, adicione tampão fornecido pelo kit de isolamento de RNA às células mistas da glia ou BV2 e raspe as inserções para analisar o RNA da AdMSC.</li>
	<li>Trate as AdMSCs na passagem 2 com meios contendo 10 ng/mL de TNFα. No dia seguinte, lave as células com PBS estéril pré-aquecido 3x e incube em meio AdMSC sem soro por 4 h.</li>
	<li>Para realizar o ensaio de células migratórias, adicione 25.000 AdMSCs por inserto e incube as células por 24 h a 37 ° C. Durante esse tempo, as células migratórias se moverão da câmara superior da inserção e aderirão à parte inferior da inserção. Aspire cuidadosamente o conteúdo do poço e das inserções e lave 2x com PBS, deixando 1 mL de PBS em cada poço para garantir que as inserções permaneçam úmidas de cada lado.</li>
	<li>Um de cada vez, usando uma pinça, remova as inserções e limpe suavemente, mas completamente, a câmara superior com um cotonete para remover quaisquer células que não tenham migrado. Aspire o PBS restante e pipete 500 μL de solução de cristal violeta para o poço e a câmara superior do inserto, garantindo que a membrana do inserto esteja totalmente submersa.</li>
	<li>Incubar as pastilhas por 1 h em solução de cristal violeta à temperatura ambiente. Para melhor reter a cor, execute as próximas etapas rapidamente, com apenas uma inserção por vez.<ol><li>Aspire a solução de cristal violeta do poço e da câmara superior do inserto e lave 3x com PBS. Limpe a câmara superior novamente com um cotonete.</li>
		<li>Coloque o inserto em um poço em uma nova placa de 24 poços contendo 1 mL de PBS. Coloque a placa acima de um microscópio invertido com uma câmera acoplada. Usando a objetiva de 10x, tire imagens de quatro áreas aleatórias em direção ao centro da inserção, focando apenas na parte inferior da inserção.</li>
	</ol></li>
	<li>Depois de fazer isso com cada poço, faça upload de imagens para o software de processamento de imagem de sua escolha e ajuste o fundo para aumentar o contraste com as células manchadas de roxo. Conte as células manualmente com um contador de células.</li>
</ol>

Cocultura de AdMSCs e glia para reduzir a inflamação induzida por príons

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<li>Stansley, B., Post, J., Hensley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+review+of+cell+culture+systems+for+the+study+of+microglial+biology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 115(2012).</li>
<li>Shan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effect+of+autologous+compact+bone-derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+on+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effect of autologous compact bone-derived mesenchymal stem cell transplantation on prion disease.</a> Journal of General Virology. 98 (10), 2615-2627 (2017).</li>
<li>Johnson, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+immune+cells+trafficking+fluorescent+prion+rods+hours+after+intraperitoneal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Monitoring immune cells trafficking fluorescent prion rods hours after intraperitoneal infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2349(2010).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSC-secreted+TGF-beta+regulates+lipopolysaccharide-stimulated+macrophage+M2-like+polarization+via+the+Akt%2FFoxO1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">MSC-secreted TGF-beta regulates lipopolysaccharide-stimulated macrophage M2-like polarization via the Akt/FoxO1 pathway.</a> Stem Cell Research and Therapy. 10, 345(2019).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Aqui, demonstramos um protocolo confiável e relativamente barato para avaliar os efeitos das células estromais mesenquimais derivadas do tecido adiposo (AdMSCs) na diminuição da inflamação induzida por príons em um modelo de células gliais. As AdMSCs podem ser facilmente isoladas e expandidas em cultura para uso em menos de 1 semana. Este protocolo produz consistentemente uma população heteróloga de células que expressam marcadores consistentes com os das células estromais mesenquimais por imunofluorescência e citometria...

A inflamação glial desempenha um papel fundamental em uma variedade de doenças neurodegenerativas, incluindo Parkinson, Alzheimer e doença do príon. Embora a agregação anormal de proteínas seja atribuída a grande parte da patogênese da doença e da neurodegeneração, as células gliais também desempenham um papel na exacerbação disso 1,2,3. Portanto, direcionar a inflamação induzida pela glia é uma abordagem terapêutica promissora. Na doença do príon, a proteína príon celular (PrPC) se dobra incorretamente para a proteína príon associada à doença (PrPSc), que forma oligômeros e agregados e interrompe a homeostase no cérebro 4,5,6.
Um dos primeiros sinais da doença do príon é uma resposta inflamatória de astrócitos e micróglia. Estudos que suprimem essa resposta, seja pela remoção da microglia ou modificação dos astrócitos, geralmente não mostraram melhora ou piora da patogênese da doença em modelos animais 7,8,9. Modular a inflamação glial sem eliminá-la é uma alternativa intrigante como terapêutica.
As células estromais mesenquimais (CTMs) têm entrado em cena como tratamento para uma variedade de doenças inflamatórias, devido à sua capacidade de modular a inflamação de forma parácrina 10,11. Eles mostraram a capacidade de migrar para locais de inflamação e responder a moléculas de sinalização nesses ambientes, secretando moléculas anti-inflamatórias, fatores de crescimento, microRNAs e muito mais 10,12,13. Demonstramos anteriormente que as MSCs derivadas do tecido adiposo (denotadas AdMSCs) são capazes de migrar para o homogeneizado cerebral infectado por príons e responder a esse homogeneizado cerebral regulando positivamente a expressão gênica de citocinas anti-inflamatórias e fatores de crescimento.
Além disso, as AdMSCs podem diminuir a expressão de genes associados ao Fator Nuclear-kappa B (NF-κB), o domínio de pirina da família Nod-Like Receptor contendo sinalização de inflamassoma 3 (NLRP3) e ativação glial, tanto na microglia BV2 quanto na glia mista primária 14. Aqui, fornecemos protocolos sobre como isolar AdMSCs e glia mista primária de camundongos, estimular AdMSCs para regular positivamente genes moduladores, avaliar a migração de AdMSC e co-cultivar AdMSCs com glia infectada por príons. Esperamos que esses procedimentos possam fornecer uma base para uma investigação mais aprofundada do papel das MSCs na regulação da inflamação induzida pela glia em doenças neurodegenerativas e outras.

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina</td><td>Cytiva</td><td>SH30042,01</td><td></td></tr><tr><td>pipetas sorológicas de 5 mL</td><td>Celltreat</td><td>229005B</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de 6 poços</td><td></td><td></td> Celltreat 229106 <td></td></tr><tr><td>placas de cultura de células de 10 cm</td><td>Peak Serum</td><td>PS-4002</td><td></td></tr><tr><td>pipetas sorológicas de 10 ml</td><td>Celltreat</td><td>229210</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 15 mL</td><td>Celltreat</td><td>667015B</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 50 mL</td> Linha celular de microglia <td>Celltreat</td><td>667050B</td><td></td></tr><tr><td>BV2</td><td>AcceGen Biotech</td><td>ABC-TC212S</td><td></td></tr><tr><td>Elevador de células</td><td>Biologix Research Company</td><td>70-2180</td><td></td></tr><tr><td>Cristal violeta</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>&nbsp; 12785</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Thermo Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Caisson Labs</td><td>DFL14-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos essenciais</td><td>Thermo Scientific</td><td>11130051</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (100%)</td><td>EMD Millipore</td><td>EX0276-1</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (calor inativado)</td><td>Peak Serum</td><td>PS-FB4</td><td>Pode ser comprado como inativado por calor ou inativado no laboratório</td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>EMD Millipore</td><td>1.04003.1000</td><td></td></tr><tr><td>Glass 10 mL pipeta sorológica</td><td>Corning</td><td>&nbsp; 7077-10N</td><td></td></tr><tr><td>Hank ' s Balanças Solução Salina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8264-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro/Câmara Neubauer</td><td>Daigger</td><td>HU-3100</td><td></td></tr><tr><td>Alta Glicose DMEM</td><td>Cytiva</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>baixa glicose DMEM contendo L-glutamina</td><td>Cytiva</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>MEM/EBSS</td><td>Cytiva</td><td>SH30024. </td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais</td> FS <td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145-100M</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (16%)</td><td>MP Biomedicals</td><td>219998320</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina/neomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4083-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Cytiva</td><td>&nbsp; SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Proteína IFN-gama de camundongo recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>485-MI</td><td></td></tr><tr><td>Proteína TNF-alfa (aa 80-235) de camundongo recombinante, CF</td><td>R& D Systems</td><td>410-MT</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td>Cubra dentro de pipetas de vidro aspirando para cima e para baixo duas vezes em Sigmacote e deixando secar completamente. Embrulhe em papel alumínio e pipetas de autoclave 24 h depois.</td></tr><tr><td>Stemxyme</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004106</td><td>Mistura de colagenase/dispase Cotonete</td></tr><tr><td>estéril, embalado individualmente</td><td>Puritan Medical</td><td>&nbsp; 25-8061WC</td><td></td></tr><tr><td>Thincert Inserções de Cultura de Tecidos, 24 poços, Tamanho dos Poros=8 &micro; m</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662638</td><td></td></tr><tr><td>Thincert Insertos de Cultura de Tecidos, 6 poços, Tamanho dos Poros=0.4 &micro; m</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657641</td><td></td></tr></tbody></table>

células estromais mesenquimais derivadas de tecido adiposo co-cultivadas com glia mista primária para reduzir a inflamação induzida por príons

Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells Co-Cultured with Primary Mixed Glia to Reduce Prion-Induced Inflammation

As células estromais mesenquimais (MSCs) são potentes reguladores da inflamação por meio da produção de citocinas anti-inflamatórias, quimiocinas e fatores de crescimento. Essas células mostram uma capacidade de regular a neuroinflamação no contexto de doenças neurodegenerativas, como a doença do príon e outros distúrbios de desdobramento de proteínas. As doenças priônicas podem ser esporádicas, adquiridas ou genéticas; Eles podem resultar do desdobramento e agregação da proteína príon no cérebro. Essas doenças são invariavelmente fatais, sem tratamentos disponíveis.
Um dos primeiros sinais da doença é a ativação de astrócitos e microglia e inflamação associada, que ocorre antes da agregação de príons detectável e perda neuronal; assim, as propriedades anti-inflamatórias e regulatórias das MSCs podem ser colhidas para tratar a astrogliose na doença do príon. Recentemente, mostramos que as MSCs derivadas do tecido adiposo (AdMSCs) co-cultivadas com células BV2 ou glia mista primária reduzem a inflamação induzida por príons por meio da sinalização parácrina. Este artigo descreve um tratamento confiável usando AdMSCs estimuladas para diminuir a inflamação induzida por príons.
Uma população heterozigótica de AdMSCs pode ser facilmente isolada do tecido adiposo murino e expandida em cultura. Estimular essas células com citocinas inflamatórias aumenta sua capacidade de migrar para o homogeneizado cerebral infectado por príons e produzir moduladores anti-inflamatórios em resposta. Juntas, essas técnicas podem ser usadas para investigar o potencial terapêutico das MSCs na infecção por príons e podem ser adaptadas para outras doenças neuroinflamatórias e de desdobramento de proteínas.

A estimulação de AdMSCs com TNFα ou interferon-gama (IFNγ) por 24 h induz alterações na expressão de moléculas anti-inflamatórias e fatores de crescimento. O tratamento de AdMSCs com TNFα ou interferon-gama (IFNγ) aumenta o mRNA do gene 6 estimulado por TNF (TSG-6), enquanto o TNFα, mas não o IFNγ, causa um aumento no mRNA do fator de crescimento transformador beta-1 (TGFβ-1). A estimulação com TNFα ou IFNγ induz um aumento no mRNA do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), mas nenhuma alteraçã...

As células estromais mesenquimais derivadas do tecido adiposo (AdMSCs) têm propriedades imunomoduladoras potentes, úteis para o tratamento de doenças associadas à inflamação. Demonstramos como isolar e cultivar AdMSCs murinas e glia mista primária, estimular AdMSCs para regular positivamente genes anti-inflamatórios e fatores de crescimento, avaliar a migração de AdMSCs e co-cultivar AdMSCs com glia primária mista infectada por príons.

Células estromais mesenquimais derivadas de tecido adiposo co-cultivadas com glia mista primária para reduzir a inflamação induzida por príons

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are potent regulators of inflammation through the production of anti-inflammatory cytokines, chemokines, and growth ...

Nosso trabalho se concentra nas doenças do príon, que são doenças neurodegenerativas fatais causadas pelo dobramento incorreto da proteína príon no cérebro. Poucos estudos se concentraram no impacto das células gliais na morte neuronal. Queremos entender se interromper a inflamação causada pelas células gliais pode ser uma abordagem terapêutica.Houve uma descoberta recente no campo de células estromais mesenquimais, revelando que as propriedades protetoras derivam das vesículas extracelulares que elas liberam. Nosso objetivo é aprofundar o conteúdo dessas vesículas e entender como elas fornecem proteção contra a inflamação glial induzida por príons. Atualmente, no campo da neurodegeneração, existem alguns caminhos que são bem-sucedidos em interromper a neuroinflamação.Isso inclui pequenas moléculas e modulação genética usando adeno ou lentivírus. No entanto, nenhum foi capaz de reduzir totalmente a inflamação, especificamente em grandes áreas do cérebro. A descoberta mais significativa que conseguimos estabelecer é que, por meio da terapia celular, somos capazes de retardar a progressão da doença do príon por meio da inibição da inflamação glial.O uso de um modelo de doença combinado com o modelo primário de células gliais nos permitirá continuar a perguntar sobre vias de estresse celular importantes na neuroproteção, de uma forma mais eficiente e direta do que o uso de modelos apenas in vivo.

adipose-derived-mesenchymal-stromal-cells-co-cultured-with-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui nós fornecemos um protocolo para a cultura de neurônios corticais de ratos na presença de uma camada de alimentação glial. Os neurônios cultivados estabelecer polaridade e criar sinapses, e pode ser separada da glia para uso em diversas aplicações, tais como eletrofisiologia, imageamento de cálcio, ensaios de sobrevivência celular, imunocitoquímica e RNA / DNA / isolamento de proteínas.

Bilaminar Co-cultura de neurônios de rato Primária Cortical e Glia

Isolar microglia primária a partir da heterogeneidade celular do cérebro é essencial para investigar o seu papel em ambas as condições fisiológicas e patológicas. Este protocolo descreve um isolamento mecânico e técnica de cultura mista de células que fornece alto rendimento e elevada pureza, viáveis ​​primárias células microgliais...

Isolamento Microglia primária a partir de cultura mista de células gliais de tecido de cérebro de rato neonatal

As células globóides são uma característica patológica definidora da doença de Krabbe, uma leucodistrofia que atualmente carece de uma terapia eficaz a longo prazo. Desenvolvemos um modelo de cultura de células para estudar a biologia inata e o potencial patogênico da microglia ativada e sua transformação em células globóides.

Um In Vitro Modelo para o Estudo da Cellular Fisiopatologia em Globóides Leucodistrofia celular

Gânglios da raiz dorsal (DRG) são estruturas que contêm os neurónios sensoriais do sistema nervoso periférico. Quando dissociada, podem ser co-cultivadas com células estaminais do tipo SC, derivadas de tecido adiposo (ASC), proporcionando um valioso modelo para estudar a regeneração de nervos em vitro e mielinização, simulando o ambiente in vivo, no local da lesão.

Dorsal Root Ganglia neurônios e células-tronco diferenciadas adiposo-derivados: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultura modelo para estudar a regeneração do nervo periférico

Em organismos multicelulares, os fatores solúveis secretados provocam respostas de diferentes tipos de células como resultado da sinalização parácrina. Os sistemas de co-cultura de inserção oferecem uma maneira simples de avaliar as mudanças mediadas por fatores solúveis secretados na ausência de contato célula-célula.

Desenvolvimento de um Sistema Insert Co-cultura de dois tipos celulares na ausência de célula-célula Contact

O desenvolvimento de dor neuropática envolve alterações patológicas das células gliais medula espinhal. Um sistema de cultura de células gliais de confiança derivados de tecidos de medula espinal adulta e concebido para estudar estas células in vitro é inexistente. Portanto, vamos mostrar aqui como estabelecer culturas gliais mistas primárias de tecido da medula espinhal do rato adulto.

Preparação de culturas mista glial primários de rato adulto Spinal Cord Tissue

Neste documento, apresentamos um protocolo para a cultura 3D do rato as células da glia derivado do cérebro, incluindo astrócitos, oligodendrócitos e micróglia. Vamos demonstrar a cultura de células primárias, síntese de hidrogel de ácido hialurônico methacrylated (HAMA), encapsulamento HAMAphoto-polimerização e celular e amostra de processamento de imagem microscópica confocal e varredura de elétrons.

Melhorado o hidrogel 3D culturas de células gliais primárias para In Vitro modelagem de Neuroinflammation

Um protocolo para a isolação de micróglia primária do cérebro murino é apresentado. Esta técnica ajuda a promover o entendimento atual de condições neurológicas. Centrifugação de gradiente de densidade e separação magnética são combinados para produzir rendimento suficiente de uma amostra altamente puro. Além disso, descrevem as etapas para a caracterização da micróglia.

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Aqui apresentamos um protocolo para isolamento in vitro de múltiplas populações de células gliais de um SNC de camundongo. Este método permite a segregação de micróglias regionais, células precursoras de oligodendrócitos e astrócitos para estudar os fenótipos de cada um em uma variedade de sistemas de cultura.

Dissecção e isolamento da glia murina de múltiplas regiões do sistema nervoso central

Este protocolo descreve uma co-cultura microglia-neuronal estabelecida a partir de células neuronais primárias isoladas de embriões de camundongos nos dias embrionários 15-16 e microglia primária gerada a partir dos cérebros de camundongos neonatais nos dias pós-natais 1-2.

Geração e co-cultura de microglia primária murina e neurônios corticais

Aprenda a co-cultura de células estromais mesenquimais derivadas de tecido adiposo com glia mista primária para reduzir a inflamação induzida por príons em doenças neurodegenerativas. Este método demonstra potencial terapêutico.

Células estromais mesenquimais derivadas de tecido adiposo co-cultivadas com glia mista primária para reduzir a inflamação induzida por príons (Vídeo) | JoVE Journal

Células estromais mesenquimais derivadas de tecido adiposo co-cultivadas com glia mista primária para reduzir a inflamação induzida por príons

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