Name: Microdiálise Intradérmica: Uma Abordagem para Investigação de Novos Mecanismos de Disfunção Microvascular em Humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprenda a técnica de microdiálise intradérmica para investigar disfunção microvascular em humanos. Este método minimamente invasivo permite dissecar farmacologicamente mecanismos de vasodilatação e vasoconstrição na circulação cutânea.

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Todos os procedimentos são aprovados pelo Comitê de Revisão Institucional da Universidade Estadual da Pensilvânia antes do recrutamento dos participantes.
1. Configuração do equipamento
<ol><li>Ligue a unidade de aquecimento local e o medidor de vazão laser Doppler. NOTA: Ambos devem ser calibrados antes da coleta de dados de acordo com as instruções do fabricante. O medidor de vazão laser Doppler deve ser conectado ao hardware de aquisição de dados com amostragem em 100 Hz (100 amostras/min) e registro contínuo em um software de aquisição de dados. Enquanto outros hardwares e softwares de aquisição de dados podem ser usados, para simplificar, as instruções restantes refletem os recursos de hardware e software do LabChart do PowerLab.</li>
	<li>Abra um arquivo de software LabChart. NOTA: Um arquivo de referência com a entrada de dados desejada e recursos de coleta contínua de dados deve ser feito com antecedência. Deve haver um painel para cada laser Doppler e aquecedor local que corresponda a cada local de microdiálise, e os painéis devem corresponder às entradas de canal apropriadas na unidade de hardware de aquisição de dados.</li>
</ol>2. Colocação de fibras de microdiálise
<ol><li>Identificar os grandes vasos sanguíneos visíveis da pele na face ventral do antebraço e indicá-los com um marcador permanente (utilizar um torniquete para visualizar os vasos, se necessário; identificar vasos na pele pigmentada escura pode exigir maior confiança na palpação).</li>
	<li>Esfregue a área que engloba as marcas e uma porção generosa da área circundante usando cotonetes betadina. Limpe a betadina com compressas com álcool. Cubra a área esterilizada da pele com um campo estéril e aplique gelo por ~5 min para anestesiar a área.</li>
	<li>Retire o gelo e insira uma agulha introdutora (23 G, 25 mm de comprimento), chanfrada virada para cima, na camada dérmica da pele a uma profundidade de 2-3 mm (dependendo da espessura individual da pele). Avançar a agulha, tomando o cuidado de permanecer na camada dérmica, e sair da pele a ~20 mm do ponto de inserção. NOTA: Para confirmar a profundidade adequada de colocação na pele, a forma da agulha deve ser visível e facilmente palpável, mas a cor da agulha deve ser ocultada. Se mais de uma sonda de microdiálise for necessária para o experimento, quaisquer duas agulhas introdutoras precisarão ser colocadas ≥2,5 cm de distância e posicionadas antes da inserção da sonda de microdiálise. As sondas não devem ser colocadas ao longo do mesmo vaso principal.</li>
	<li>Deixando a agulha no lugar, conecte a sonda (através da trava Luer) a uma seringa contendo solução de Ringer com lactato. Alimentar a extremidade oposta da sonda através da agulha introdutora até que a membrana semipermeável da sonda esteja próxima, mas ainda fora da abertura da agulha introdutora. Perfundir lentamente uma pequena quantidade de solução de Ringer através da fibra até que a solução seja visivelmente perfundida através dos poros da membrana para confirmar a integridade da membrana.</li>
	<li>Se estiver usando uma sonda de microdiálise da Harvard Bioscience e uma agulha introdutora, siga as etapas 2.5.1-2.5.2.<ol><li>Após a confirmação da função da sonda, alimente a sonda através da agulha introdutora até que a membrana esteja completamente contida na camada dérmica da pele dentro da agulha introdutora.</li>
		<li>Com o uso de um dedo, prenda a sonda no lugar proximal à agulha e retire a agulha na direção oposta à inserção. Colocar a porção externa da fibra na pele para evitar o deslocamento da membrana semipermeável durante o experimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Se estiver usando uma sonda de microdiálise da Bioanalytical Systems e uma agulha introdutora, siga as etapas 2.6.1-2.6.2.<ol><li>Após a confirmação da função da sonda, segure o cubo da agulha introdutora e a porção distal da sonda de microdiálise em uma das mãos e, simultaneamente, retire a agulha oposta à direção de inserção, movendo a sonda de microdiálise para o lugar.</li>
		<li>Ajuste a sonda conforme necessário para garantir que a membrana semipermeável esteja completamente enterrada na pele. Colocar a fibra externa na pele para evitar o deslocamento da membrana semipermeável durante o experimento.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Hiperemia
<ol><li>Enquanto aguarda que a resposta hiperêmica à inserção da agulha diminua (~60-90 min), coloque a seringa de uso único na bandeja do suporte da seringa nas bombas de microinfusão. Perfundir solução de Ringer com lactato, soro fisiológico ou solução veículo (a solução na qual o agente farmacológico experimental é dissolvido; 2 μL/min) durante a fase de hiperemia. NOTA: Enquanto as sondas de microdiálise não podem ser removidas durante esta fase de ~60-90 min, o participante pode ajustar sua posição corporal ou mover sua mão, ou a trava Luer da sonda pode ser removida da seringa e presa com fita adesiva ao braço do participante para permitir que ele fique em pé por um breve período. Uma vez instrumentadas com aquecedores locais e sondas de Doppler fluxometria a laser (LDF) e uma vez iniciada a coleta de dados, as sondas LDF não podem ser movidas.</li>
	<li>Quando a vermelhidão da pele, que é um indicador da resposta hiperêmica ao trauma da agulha, tiver diminuído, conecte a unidade de aquecimento local à pele que cobre a membrana semipermeável através do disco adesivo da sonda, garantindo que o centro do aquecedor se alinhe com o caminho da sonda de microdiálise.</li>
	<li>Coloque a sonda LDF na abertura no centro do aquecedor local para que o laser fique diretamente perpendicular à superfície da pele. Uma vez que as sondas de LDF são colocadas e seguras, clique em iniciar no software de aquisição de dados para registrar e exibir continuamente os valores de fluxo de hemácias (fluxo de hemácias; unidades de perfusão, UP). Se a hiperemia tiver diminuído completamente, o fluxo de hemácias será estável em ~5-20 UP (a pulsatilidade dos vasos abaixo da sonda LDF pode ser refletida por pequenas elevações na UP que coincidem com os batimentos cardíacos).</li>
	<li>Coloque um manguito automático de pressão arterial no braço de um sujeito que não tenha sido instrumentado.</li>
	<li>Ajuste os aquecedores locais a 33 °C para fixar a temperatura da pele dentro de uma faixa termoneutra25, eliminando assim quaisquer variações na influência dos estímulos térmicos. Para adicionar um comentário à gravação contínua no software de aquisição de dados para indicar eventos no experimento, clique na caixa de texto no canto superior direito da tela, digite um comentário, selecione quais canais devem receber o comentário e clique em adicionar.</li>
</ol>4. Protocolo dose-resposta à acetilcolina
<ol><li>Uma vez que o fluxo de hemácias tenha se estabilizado em resposta ao calor local de 33 °C, inicie a coleta de dados basais, distinguida no arquivo de software de aquisição de dados por um comentário iniciar a linha de base. Pelo menos um mínimo de 5-10 min de linha de base estável é necessário para a análise dos dados; reinicie a linha de base a qualquer momento durante este ponto da coleta de dados, se necessário, e marque isso no arquivo LabChart. No último minuto da linha de base, colete uma medida de pressão arterial e insira os valores em um comentário no arquivo LabChart.</li>
	<li>Ao final dos 5-10 min de coleta de dados basais, meça e registre a pressão arterial basal e insira a linha de base final do comentário no software de aquisição de dados.</li>
	<li>Desligue as bombas de microinfusão e troque as seringas cheias de solução de Ringer com lactato pela seringa preenchida com a menor concentração de ACh (10−10 M).</li>
	<li>Fixe as novas seringas no lugar e confirme a perfusão do fluido através da extremidade da sonda antes de ligar novamente as bombas de microinfusão. Digite o comentário start −10 na gravação do software de aquisição de dados.</li>
	<li>Cada concentração de ACh será perfundida por 5-10 min a 2 μL/min. No minuto final de perfusão, para cada concentração, medir e registrar a pressão arterial. Uma vez terminado o tempo de perfusão para uma determinada concentração, substitua a seringa pela próxima concentração mais alta (por exemplo, a solução de ACh de 10−10 M é trocada por uma solução de ACh de 10−9 M), conforme descrito nas etapas 4.2-4.4.</li>
	<li>Imediatamente após a perfusão da concentração final de ACh (10−1 M), substitua a seringa de ACh por uma contendo solução de Ringer e aumente a temperatura do aquecedor local para 43 °C. Uma vez estabilizado o fluxo de hemácias, substitua a solução de Ringer por nitroprussiato de sódio (28 mM) para produzir vasodilatação local máxima induzida pelo calor e induzida farmacologicamente. Medir e registrar a pressão arterial a cada ~3 min durante esta fase de vasodilatação máxima.</li>
	<li>Uma vez que um platô máximo de fluxo de hemácias tenha ocorrido (~5 min de PU estável), finalize o experimento. Selecione parar no canto inferior direito do software de aquisição de dados para encerrar a coleta contínua de dados.</li>
</ol>5. Protocolo de aquecimento local
<ol><li>Uma vez estabilizado o fluxo eritrocitário após a hiperemia, inicie a coleta de dados basais e indique isso no arquivo do software de aquisição de dados com um comentário. No último minuto da linha de base, colete uma medida da pressão arterial e insira os valores em um comentário no arquivo do software de aquisição de dados.</li>
	<li>Aumente os aquecedores locais para 39 °C ou 42 °C, dependendo das necessidades do protocolo (explicado na seção de discussão).</li>
	<li>Uma vez que o fluxo de hemácias tenha estabilizado em resposta à aplicação de calor local (~40-60 min de aquecimento), perfundir N G-nitro-l-arginina metil éster (L-NAME; 15 mM dissolvido em solução de Ringer; 2 μL/min; um inibidor da sintase NO) através da(s) sonda(s) de microdiálise.</li>
	<li>Uma vez que o fluxo de hemácias tenha se estabilizado em resposta ao L-NAME (~15-25 min de perfusão), aumente os aquecedores locais para 43 °C.</li>
	<li>Uma vez que o fluxo de hemácias tenha se estabilizado em resposta a 43 °C (um platô de ~2-5 min ocorre após ~20-45 min de aquecimento), perfundir nitroprussiato de sódio (28 mM dissolvido em solução de Ringer) através da(s) sonda(s) de microdiálise.</li>
	<li>Uma vez que um platô máximo de fluxo de hemácias tenha ocorrido (~5 min de PU estável), finalize o experimento. Selecione parar no canto inferior direito do software de aquisição de dados para encerrar a coleta de dados.</li>
</ol>6. Remoção das sondas de microdiálise
<ol><li>Após o término do experimento, use uma tesoura cirúrgica para cortar as sondas de microdiálise. Remova cuidadosamente as sondas de LDF dos aquecedores e remova os aquecedores da pele. Remova suavemente a fita que mantém as sondas no lugar sobre a pele.</li>
	<li>Identifique visualmente qual local de punção em cada lado da sonda formou o menor coágulo sanguíneo. Corte a porção da sonda perto do local com o coágulo menor, deixando ~1 dentro da sonda fora da pele sem cortes.</li>
	<li>Limpe a parte da pele ao redor dos locais de entrada e saída da sonda com um cotonete de álcool, bem como o ~1 de comprimento da sonda deixado no local menos coagulado.</li>
	<li>Deixe o álcool secar na pele. Em seguida, segure a porção da sonda que se estende do local da punção com o coágulo maior, oposto ao ~1 na porção na extremidade menos coagulada. Puxe lentamente a sonda em direção ao coágulo sanguíneo maior.</li>
	<li>Coloque gaze estéril sobre qualquer sangramento resultante da remoção da sonda e aplique pressão.</li>
</ol>

Investigando novos mecanismos de disfunção microvascular em humanos

<ol><li>Xu, J. Q., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Arias, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+in+the+United+States%2C+2021%5BTitle%5D)+AND+%22NCHS+Data+Brief%22%5BJournal%5D)">Mortality in the United States, 2021.</a> NCHS Data Brief. 456, (2022).</li>
<li>Tsao, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2023+update%3A+A+report+from+the+American+heart+association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2023 update: A report from the American heart association.</a> Circulation. 147 (8), e93(2023).</li>
<li>Cohuet, G., Struijker-Boudier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+target+organ+damage+caused+by+hypertension%3A+Therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of target organ damage caused by hypertension: Therapeutic potential.</a> Pharmacology & Therapeutics. 111 (1), 81-98 (2006).</li>
<li>Park, K. H., Park, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction%3A+Clinical+implications+in+cardiovascular+disease+and+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Korean+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction: Clinical implications in cardiovascular disease and therapeutic approaches.</a> Journal of Korean Medical Science. 30 (9), 1213-1225 (2015).</li>
<li>Levy, B. I., Ambrosio, G., Pries, A. R., Struijker-Boudier, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcirculation+in+hypertension%3A+a+new+target+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Microcirculation in hypertension: a new target for treatment.</a> Circulation. 104 (6), 735-740 (2001).</li>
<li>Sara, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+coronary+microvascular+dysfunction+among+patients+with+chest+pain+and+nonobstructive+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%3A+Cardiovascular+Interventions%22%5BJournal%5D)">Prevalence of coronary microvascular dysfunction among patients with chest pain and nonobstructive coronary artery disease.</a> Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Interventions. 8 (11), 1445-1453 (2015).</li>
<li>Weis, M., Hartmann, A., Olbrich, H. G., Hör, G., Zeiher, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+coronary+flow+reserve+on+left+ventricular+ejection+fraction+in+cardiac+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of coronary flow reserve on left ventricular ejection fraction in cardiac transplant recipients.</a> Transplantation. 65 (1), 103-108 (1998).</li>
<li>Rossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+skin+vasoreactivity+and+blood+flow+oscillations+in+hypertensive+patients%3A+Effect+of+short-term+antihypertensive+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Investigation of skin vasoreactivity and blood flow oscillations in hypertensive patients: Effect of short-term antihypertensive treatment.</a> Journal of Hypertension. 29 (8), 1569-1576 (2011).</li>
<li>Pepine, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+microvascular+reactivity+to+adenosine+predicts+adverse+outcome+in+women+evaluated+for+suspected+ischemia+results+from+the+National+Heart%2C+Lung+and+Blood+Institute+WISE+%28Women%27s+Ischemia+Syndrome+Evaluation%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Coronary microvascular reactivity to adenosine predicts adverse outcome in women evaluated for suspected ischemia results from the National Heart, Lung and Blood Institute WISE (Women's Ischemia Syndrome Evaluation) study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 55 (25), 2825-2832 (2010).</li>
<li>Matsuda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+clinical+significance+of+discordant+changes+in+fractional+and+coronary+flow+reserve+after+elective+percutaneous+coronary+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Prevalence and clinical significance of discordant changes in fractional and coronary flow reserve after elective percutaneous coronary intervention.</a> Journal of the American Heart Association. 5 (12), e004400(2016).</li>
<li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+noninvasive+physiological+assessment+of+coronary+circulatory+function+and+impact+on+cardiovascular+mortality+in+patients+with+stable+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Integrated noninvasive physiological assessment of coronary circulatory function and impact on cardiovascular mortality in patients with stable coronary artery disease.</a> Circulation. 136 (24), 2325-2336 (2017).</li>
<li>Roustit, M., Cracowski, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+endothelial+and+neurovascular+function+in+human+skin+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Assessment of endothelial and neurovascular function in human skin microcirculation.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 373-384 (2013).</li>
<li>Low, D. A., Jones, H., Cable, N. T., Alexander, L. M., Kenney, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+reviews+of+the+assessment+of+human+cardiovascular+function%3A+interrogation+and+understanding+of+the+control+of+skin+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Historical reviews of the assessment of human cardiovascular function: interrogation and understanding of the control of skin blood flow.</a> European Journal of Applied Physiology. 120 (1), 1-16 (2020).</li>
<li>Kenney, W. L., Cannon, J. G., Alexander, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+microvascular+dysfunction+correlates+with+serum+LDL+and+sLOX-1+receptor+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cutaneous microvascular dysfunction correlates with serum LDL and sLOX-1 receptor concentrations.</a> Microvascular Research. 85, 112-117 (2013).</li>
<li>Holowatz, L. A., Thompson, C. S., Minson, C. T., Kenney, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+acetylcholine-mediated+vasodilatation+in+young+and+aged+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of acetylcholine-mediated vasodilatation in young and aged human skin.</a> Journal of Physiology. 563, 965-973 (2005).</li>
<li>Sokolnicki, L. A., Roberts, S. K., Wilkins, B. W., Basu, A., Charkoudian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+nitric+oxide+to+cutaneous+microvascular+dilation+in+individuals+with+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Contribution of nitric oxide to cutaneous microvascular dilation in individuals with type 2 diabetes mellitus.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 292 (1), E314-E318 (2007).</li>
<li>DuPont, J. J., Ramick, M. G., Farquhar, W. B., Townsend, R. R., Edwards, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase-derived+reactive+oxygen+species+contribute+to+impaired+cutaneous+microvascular+function+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase-derived reactive oxygen species contribute to impaired cutaneous microvascular function in chronic kidney disease.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 306 (12), F1499-F1506 (2014).</li>
<li>Sprung, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide-mediated+cutaneous+microvascular+function+is+impaired+in+polycystic+ovary+syndrome+but+can+be+improved+by+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide-mediated cutaneous microvascular function is impaired in polycystic ovary syndrome but can be improved by exercise training.</a> Journal of Physiology. 591 (6), 1475-1487 (2013).</li>
<li>Greaney, J. L., Saunders, E. F. H., Santhanam, L., Alexander, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+contributes+to+microvascular+endothelial+dysfunction+in+men+and+women+with+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress contributes to microvascular endothelial dysfunction in men and women with major depressive disorder.</a> Circulatory Research. 124 (4), 564-574 (2019).</li>
<li>Stanhewicz, A. E., Jandu, S., Santhanam, L., Alexander, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+angiotensin+II+sensitivity+contributes+to+microvascular+dysfunction+in+women+who+have+had+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Increased angiotensin II sensitivity contributes to microvascular dysfunction in women who have had preeclampsia.</a> Hypertension. 70 (2), 382-389 (2017).</li>
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<li>Dillon, G. A., Stanhewicz, A. E., Serviente, C., Greaney, J. L., Alexander, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+sulfide-dependent+microvascular+vasodilation+is+improved+following+chronic+sulfhydryl-donating+antihypertensive+pharmacotherapy+in+adults+with+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hydrogen sulfide-dependent microvascular vasodilation is improved following chronic sulfhydryl-donating antihypertensive pharmacotherapy in adults with hypertension.</a> Journal of Physiology. 321 (4), H728-H734 (2021).</li>
<li>Wong, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerve-mediated+and+nitric+oxide-dependent+cutaneous+vasodilation+in+normotensive+and+prehypertensive+non-Hispanic+blacks+and+whites%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sensory nerve-mediated and nitric oxide-dependent cutaneous vasodilation in normotensive and prehypertensive non-Hispanic blacks and whites.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (2), H271-H281 (2020).</li>
<li>Dillon, G. A., Greaney, J. L., Shank, S., Leuenberger, U. A., Alexander, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHA%2FACC-defined+stage+1+hypertensive+adults+do+not+display+cutaneous+microvascular+endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">AHA/ACC-defined stage 1 hypertensive adults do not display cutaneous microvascular endothelial dysfunction.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 319 (3), H539-H546 (2020).</li>
<li>Gagge, A. P., Stolwijk, J. A., Hardy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comfort+and+thermal+sensations+and+associated+physiological+responses+at+various+ambient+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Comfort and thermal sensations and associated physiological responses at various ambient temperatures.</a> Environmental Research. 1 (1), 1-20 (1967).</li>
<li>Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+limb+or+sex+differences+in+the+cutaneous+vascular+responses+to+exogenous+norepinephrine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lack of limb or sex differences in the cutaneous vascular responses to exogenous norepinephrine.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (12), 1417-1423 (2014).</li>
<li>Greaney, J. L., Stanhewicz, A. E., Kenney, W. L., Alexander, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+increases+in+skin+sympathetic+nerve+activity+contribute+to+age-related+decrements+in+reflex+cutaneous+vasoconstriction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Impaired increases in skin sympathetic nerve activity contribute to age-related decrements in reflex cutaneous vasoconstriction.</a> Journal of Physiology. 593 (9), 2199-2211 (2015).</li>
<li>Alba, B. K., Greaney, J. L., Ferguson, S. B., Alexander, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+function+is+impaired+in+the+cutaneous+microcirculation+of+adults+with+psoriasis+through+reductions+in+nitric+oxide-dependent+vasodilation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endothelial function is impaired in the cutaneous microcirculation of adults with psoriasis through reductions in nitric oxide-dependent vasodilation.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (2), H343-H349 (2018).</li>
<li>Greaney, J. L., Surachman, A., Saunders, E. F. H., Alexander, L. M., Almeida, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greater+daily+psychosocial+stress+exposure+is+associated+with+increased+norepinephrine-induced+vasoconstriction+in+young+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Greater daily psychosocial stress exposure is associated with increased norepinephrine-induced vasoconstriction in young adults.</a> Journal of the American Heart Association. 9 (9), e015697(2020).</li>
<li>Nakata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+catecholamine+neurotransmitters+released+from+cutaneous+vasoconstrictor+nerve+endings+in+men+with+cervical+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quantification of catecholamine neurotransmitters released from cutaneous vasoconstrictor nerve endings in men with cervical spinal cord injury.</a> American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (3), R345-R352 (2023).</li>
<li>Tucker, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+cutaneous+vasodilation+and+sweating%3A+Influence+of+adiposity+and+hydration+status%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic cutaneous vasodilation and sweating: Influence of adiposity and hydration status.</a> European Journal of Applied Physiology. 118 (8), 1703-1713 (2018).</li>
<li>Craighead, D. H., Alexander, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menthol-induced+cutaneous+vasodilation+is+preserved+in+essential+hypertensive+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Menthol-induced cutaneous vasodilation is preserved in essential hypertensive men and women.</a> American Journal of Hypertension. 30 (12), 1156-1162 (2017).</li>
<li>Brunt, V. E., Minson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCa+channels+and+epoxyeicosatrienoic+acids%3A+Major+contributors+to+thermal+hyperaemia+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">KCa channels and epoxyeicosatrienoic acids: Major contributors to thermal hyperaemia in human skin.</a> Journal of Physiology. 590 (15), 3523-3534 (2012).</li>
<li>Choi, P. J., Brunt, V. E., Fujii, N., Minson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approach+to+measure+cutaneous+microvascular+function%3A+An+improved+test+of+NO-mediated+vasodilation+by+thermal+hyperemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">New approach to measure cutaneous microvascular function: An improved test of NO-mediated vasodilation by thermal hyperemia.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (3), 277-283 (2014).</li>
<li>Johnson, J. M., Kellogg, D. L. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+thermal+control+of+the+human+cutaneous+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Local thermal control of the human cutaneous circulation.</a> Journal of Applied Physiology. 109 (4), 1229-1238 (2010).</li>
<li>Jung, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Doppler+flux+measurement+for+the+assessment+of+cutaneous+microcirculation-Critical+remarks%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Laser Doppler flux measurement for the assessment of cutaneous microcirculation-Critical remarks.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 55 (4), 411-416 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse e nada a divulgar.

A técnica de microdiálise intradérmica é uma ferramenta versátil na pesquisa vascular humana. Os pesquisadores podem alterar o protocolo para diversificar ainda mais suas aplicações. Por exemplo, descrevemos um protocolo dose-resposta de ACh, mas outras investigações sobre os mecanismos de vasoconstrição ou tônus vasomotor, em vez de vasodilatação isolada, têm utilizado abordagens dose-resposta de noradrenalina ou nitroprussiato de sódio 26,27,28,29,30,31.</...

A doença cardiovascular (DCV) é a principal causa de morte nos Estados Unidos1. A hipertensão arterial sistêmica (HA) é um fator de risco independente para acidente vascular cerebral, doença coronariana e insuficiência cardíaca e estima-se que afete mais de ~50% da população dos Estados Unidos2. A HA pode se desenvolver como uma DCV independente (HA primária) ou como resultado de outra condição, como doença renal policística e/ou distúrbios endócrinos (HAS secundárias). A amplitude das etiologias da HA dificulta as investigações sobre os mecanismos subjacentes e danos aos órgãos-alvo observados com a HA. Diversas e novas abordagens de pesquisa sobre a fisiopatologia da lesão de órgão-alvo associada à HA são necessárias.
Um dos sinais patológicos mais precoces da DCV é a disfunção endotelial, caracterizada por vasodilatação mediada pelo óxido nítrico (NO) 3,4,5. A dilatação mediada por fluxo é uma abordagem comum usada para quantificar a disfunção endotelial associada à DCV, mas a disfunção endotelial em leitos microvasculares pode ser independente e precursora da das grandes artérias condutos6,7,8. Além disso, as arteríolas de resistência são mais diretamente atuadas pelo tecido local do que as artérias condutas e têm controle mais imediato sobre a entrega de sangue rico em oxigênio. A função microvascular é preditora de sobrevida livre de eventos cardiovasculares adversos 9,10,11. A microvasculatura cutânea é um leito vascular acessível que pode ser utilizado para examinar respostas fisiológicas e farmacológicas a estímulos vasoconstritores ou vasodilatadores. A microdiálise intradérmica é uma técnica minimamente invasiva, cujo objetivo é investigar os mecanismos da função da musculatura lisa vascular e endotelial na microvasculatura cutânea com dissecção farmacológica direcionada. Esse método contrasta com outras técnicas, como a hiperemia reativa pós-oclusiva, que não permite a dissecção farmacológica, e a iontoforese, que permite a administração farmacológica, mas é menos precisa em seu mecanismo de ação (revisada detalhadamente em outro artigo12).
A lógica por trás do desenvolvimento e uso dessa técnica é extensivamente revisada em outra publicação13. Esta abordagem foi originalmente desenvolvida para uso em pesquisa neurológica em roedores e, em seguida, foi primeiramente aplicada em humanos para investigar os mecanismos subjacentes à vasodilatação ativa de um ponto de vista termorregulatório. No final da década de 1990, esse método foi utilizado para examinar mecanismos neurais e endoteliais em relação ao aquecimento local da pele. Desde então, a técnica tem sido utilizada para investigar uma série de mecanismos de sinalização neurovascular na pele.
Usando essa técnica, nosso grupo e outros têm questionado os mecanismos de disfunção endotelial na microvasculatura de várias populações clínicas, incluindo, mas não se limitando a, dislipidemia, envelhecimento primário, diabetes, doença renal crônica, síndrome dos ovários policísticos, pré-eclâmpsia, transtorno depressivo maior 14,15,16,17,18,19 e hipertensão arterial 20,21,22,23,24. Por exemplo, um estudo anterior verificou que mulheres normotensas com história de pré-eclâmpsia, que apresentam risco aumentado para DCV, apresentaram redução da vasodilatação mediada pelo NO na circulação cutânea em comparação com mulheres com história de gravidez normotensa20. Em outro estudo, adultos com diagnóstico de hipertensão primária demonstraram aumento da sensibilidade à angiotensina II na microvasculatura em comparação com controles saudáveis21, e a farmacoterapia anti-hipertensiva crônica doadora de sulfidrila em pacientes com hipertensão primária demonstrou diminuir a pressão arterial e melhorar a vasodilatação mediada por sulfeto de hidrogênio e NO22. Wong e cols.23 encontraram vasodilatação prejudicada mediada por sensorios e NO em adultos pré-hipertensos, coincidindo com nosso achado de progressão da disfunção endotelial com o aumento dos estágios de HA, conforme categorizado pelas diretrizes de 2017 da American Heart Association e do American College of Cardiology24.
A técnica de microdiálise intradérmica permite investigações mecanicistas rigorosamente controladas da função microvascular em estados de saúde e doença. Portanto, este trabalho tem como objetivo descrever a técnica de microdiálise intradérmica aplicada por nosso grupo e outros. Detalhamos os procedimentos de estimulação farmacológica do endotélio com acetilcolina (ACh) para examinar a relação dose-resposta e a estimulação fisiológica da produção endógena de NO com um protocolo de estímulo de aquecimento local de 39 °C ou 42 °C. Apresentamos resultados representativos para cada abordagem e discutimos as implicações clínicas dos achados decorrentes dessa técnica.

<table><tbody><tr><td>Seringas de 1 mL</td><td>Seringas BD</td><td>302100</td><td></td></tr><tr><td>Acetilcolina</td><td>Estados Unidos Farmacopeia</td><td>1424511</td><td>Dados piloto coletados em nosso laboratório indicam que a secagem da acetilcolina aumenta a variabilidade da resposta CVC; não seque, armazene em dessecador</td></tr><tr><td>Cotonetes de álcool</td><td>Mckesson</td><td>191089</td><td></td></tr><tr><td>Baby Bee Syringe Drive</td><td>Bioanalytical Systems, Incorporated</td><td>MD-1001</td><td>Neste estudo, foi utilizado o suporte opcional de 3 seringas (número catálico MD-1002)</td></tr><tr><td>Sondas Lineares de Microdiálise CMA 30</td><td>Aparelho Harvard</td><td>CMA8010460</td><td></td></tr><tr><td>Monitor de Ponto Connex</td><td>WelchAllyn</td><td>74CT-B</td><td>monitor automatizado de pressão arterial</td></tr><tr><td>Hive Syringe Pump Controller</td><td>Bioanalytical Systems,</td><td>Incorporated MD-1020</td><td>Controla até 4 Baby Bee Syringe Drives</td></tr><tr><td>LabChart 8</td><td>AD Instruments</td><td></td><td>**O hardware PowerLab e o software LabChart devem ser versões compatíveis</td></tr><tr><td>Solução de Lactato de Ringer</td><td>Avantor (VWR)</td><td>76313-478</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de fluxo sanguíneo Doppler a laser</td><td>Moor Instruments</td><td>MoorVMS-LDF</td><td></td></tr><tr><td>Kit de calibração da sonda Doppler a laser</td><td>Moor Instruments</td><td>CAL</td><td></td></tr><tr><td>Sonda Doppler a</td> laser <td>Moor Instruments</td> Sondas de Microdiálise <td>Linear VP12</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bioanalytical Systems, Inc.</td><td>MD-2000</td><td></td></tr><tr><td>NG-nitro-l-arginina éster metílico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>483125-M</td><td>L-NAME</td></tr><tr><td>Iodopovidona / betadine</td><td>Dynarex</td><td>1202</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab C Dispositivo de aquisição de dados</td><td>AD Instruments</td><td>PLC01</td><td>**</td></tr><tr><td>Interface do instrumento PowerLab C</td><td>AD Instruments</td><td>PLCI1</td><td>**</td></tr><tr><td>Discos adesivos de sonda</td><td>Moor Instruments</td><td></td><td>conecta unidade de aquecimento local à pele</td></tr><tr><td>Controlador de aquecedor de pele</td><td>Moor Instruments</td><td>moorVMS-HEAT 1.3</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de aquecimento pequena</td><td>Moor Instruments</td><td>VHP2</td><td></td></tr><tr><td>Cortinas estéreis</td><td>Adriana</td><td>89731</td><td></td></tr><tr><td>Gaze estéril</td><td>Dukal Corporation</td><td>2085</td><td></td></tr><tr><td>Luvas cirúrgicas estéreis</td><td>Esteem Número de catálogo Cardinal Health</td><td>8856N</td><td>seguido pelas iniciais do tamanho da luva e, em seguida, a letra "B" (por exemplo, 8856NMB para médio)</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-06287-26</td><td></td></tr></tbody></table>

microdiálise intradérmica: uma abordagem para investigação de novos mecanismos de disfunção microvascular em humanos

Intradermal Microdialysis: An Approach to Investigating Novel Mechanisms of Microvascular Dysfunction in Humans

A vasculatura cutânea é um tecido acessível que pode ser utilizado para avaliar a função microvascular em humanos. A microdiálise intradérmica é uma técnica minimamente invasiva utilizada para investigar mecanismos da musculatura lisa vascular e função endotelial na circulação cutânea. Essa técnica permite a dissecção farmacológica da fisiopatologia da disfunção endotelial microvascular indexada pela diminuição da vasodilatação mediada pelo óxido nítrico, um indicador de risco para o desenvolvimento de doença cardiovascular. Nessa técnica, uma sonda de microdiálise é colocada na camada dérmica da pele, e uma unidade de aquecimento local com uma sonda de fluxometria Doppler a laser é colocada sobre a sonda para medir o fluxo de hemácias. A temperatura local da pele é pinçada ou estimulada com aplicação direta de calor, e agentes farmacológicos são perfundidos através da sonda para estimular ou inibir vias de sinalização intracelular a fim de induzir vasodilatação ou vasoconstrição ou interrogar mecanismos de interesse (cofatores, antioxidantes, etc.). A condutância vascular cutânea é quantificada, e mecanismos de disfunção endotelial em estados patológicos podem ser delineados.

Protocolo dose-resposta à acetilcolina
A Figura 1A mostra um esquema detalhando o protocolo dose-resposta da ACh. A Figura 1B ilustra os traçados representativos dos valores de fluxo de hemácias (unidades de perfusão, UP; médias de 30 s) do protocolo padronizado de dose-resposta de ACh para um indivíduo ao longo do tempo. A Figura 1C ilustra um arquivo de dados brutos de um protocolo de d...

A microdiálise intradérmica é uma técnica minimamente invasiva utilizada para investigar a função microvascular na saúde e na doença. Tanto os protocolos dose-resposta quanto os de aquecimento local podem ser utilizados para explorar mecanismos de vasodilatação e vasoconstrição na circulação cutânea.

Microdiálise Intradérmica: Uma Abordagem para Investigação de Novos Mecanismos de Disfunção Microvascular em Humanos

The cutaneous vasculature is an accessible tissue that can be used to assess microvascular function in humans. Intradermal microdialysis is a minimally ...

Minha pesquisa examina mecanismos de disfunção vascular em humanos com risco de doença cardiovascular tradicional e não tradicional. Desenvolvi um modelo para examinar mecanismos de disfunção microvascular em humanos, que permite a dissecção farmacológica que antes era impossível. Exploramos vários alvos moleculares, mediando a disfunção vascular, traduzindo pesquisas pré-clínicas para humanos usando este novo bioensaio.Um dos desafios atuais em experimentos é que as respostas vasodilatadoras e vasoconstritoras são causadas por múltiplos mecanismos. Para isolar os mecanismos de interesse, agentes farmacológicos devem ser utilizados. Embora essa abordagem seja limitada, ela permite uma compreensão mais abrangente das respostas vasculares cutâneas.Em coortes clínicas como hipertensão e transtorno depressivo maior, ou TDM, descobrimos disfunção microvascular. As possíveis razões para essa disfunção nesses grupos são o aumento da arginase e a atividade reativa de espécies de oxigênio, respectivamente. O tratamento de salicilato a curto prazo mostrou-se eficaz na melhora da função microvascular e do TDM.Esta técnica é minimamente invasiva e permite a dissecção farmacológica bem controlada dos mecanismos de função de um leito vascular local. Isso se opõe a técnicas como hiperemia reativa pós-oclusiva e iontoforese, que são úteis, mas permitem um pouco de controle de uma ferramenta farmacológica. Nosso laboratório está atualmente investigando a contribuição da inflamação e da disfunção microvascular mediadora em mulheres com endometriose.Além disso, planejamos investigar mecanismos semelhantes em mulheres negras não hispânicas.

intradermal-microdialysis-an-approach-to-investigating-novel

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O acompanhamento dos níveis de neurotransmissores extracelular em regiões distintas do cérebro de animais que circulam livremente oferece insights sobre a relação entre a liberação do neurotransmissor e comportamento. Em microdiálise in vivo juntamente com detecção eletroquímica fornece anatômicas excelentes e resolução de química; e informações sobre como a neurotransmissão basal é alterada por manipulações farmacológicas ou fisiológicas.

Cirurgia estereotáxica sobrevivência em Roedores

A técnica é apresentada para a coleta in vivo de amostras de líquido intersticial de sites pertinentes tecido (pele aqui, experimentalmente inflamação) para a medição de produtos bioquímicos mediação dor e inflamação.

Bioensaio In-Vivo humanos para a medição de tecidos específicos de Mediadores nociceptiva e inflamatória

Modulação da hippocampally dependente de memória espacial de trabalho por microinjeção intrahippocampal direta, acompanhado e seguido...

Microinjeção insulina hipocampal e<em&gt; Em vivo</em&gt; Microdiálise Durante um teste de memória espacial

Capilaroscopia é uma metodologia não-invasiva, relativamente barato para a visualização direta da microcirculação. O antebraço técnica de fluxo de sangue proporciona aceitos não invasivos medidas da função endotelial.

Avaliação não invasiva da função microvascular e endotelial

O presente artigo descreve as considerações metodológicas para várias avaliações não invasivas da função e morfologia vascular que são comumente usadas em pesquisas médicas para avaliar diferentes estágios da aterosclerose.

Uma abordagem metodológica para avaliações não-invasivas de função vascular e Morfologia

Microdiálise é uma técnica comumente usada em pesquisas de neurociência. Portanto sondas comerciais estão em grande demand.In neste trabalho um conjunto de sonda é explicado em detalhes para construir um concêntrico, sonda de microdiálise confiável, feito sob medida para menos de 10 dólares.

Custom-made Microdiálise Probe projeto

Ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion regula distribuição de sangue ilhéu e mantém a função fisiológica das células β de ilhéu. Este protocolo descreve usando um monitor de laser Doppler para determinar o estado funcional das ilhotas pancreáticas vasomotion microvascular na vivo e avaliar as contribuições da microcirculação de ilhotas pancreáticas para doenças relacionadas com o pâncreas.

Laser Doppler: Uma ferramenta para medir ilhota Pancreatic Microvascular Vasomotion In Vivo

Sistemas de tele-microscopia são usados para examinar as propriedades funcionais das arteríolas isoladas de tecido adiposo em resposta a estímulos fisiológicos e farmacológicos. Esta técnica pode ser usada para examinar fenótipos microvasculares em domínios diferentes de tecido adiposo em seres humanos obesos.

Avaliação da função Microvascular de tecido adiposo humano usando tele-microscopia

Na vivo microdialysis permitiu a coleção de moléculas presentes no líquido intersticial do cérebro (ISF) de animais acordados, se comportando livremente. Para analisar moléculas relativamente grandes no ISF, o atual artigo enfoca especificamente o protocolo microdialysis usando sondas com alto peso molecular, cortar as membranas.

Na Vivo Microdialysis método para coletar grandes proteínas Extracellular do cérebro líquido intersticial com corte de alto peso molecular Probes

O presente protocolo descreve um método simples e eficiente para a coleta dinâmica e em tempo real de sangue de coração de ratos utilizando a técnica de microdiálise.

Extração Contínua Dinâmica de Sangue do Coração de Rato via Técnica de Microdiálise Não Invasiva

Aprenda a técnica de microdiálise intradérmica para investigar disfunção microvascular em humanos. Este método minimamente invasivo permite dissecar farmacologicamente mecanismos de vasodilatação e vasoconstrição na circulação cutânea.

Microdiálise Intradérmica: Uma Abordagem para Investigação de Novos Mecanismos de Disfunção Microvascular em Humanos

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