Um Protocolo Simples, Rápido e Parcialmente Automatizado para o Isolamento de Núcleos Únicos de Tecidos Congelados de Mamíferos para Sequenciamento de Núcleo Único
28 de julho de 2023
O estudo descreve um protocolo simples, rápido e parcialmente automatizado para isolar núcleos de alta qualidade de tecidos congelados de mamíferos para sequenciamento de RNA de núcleo único a jusante.
Esta pesquisa se concentra em apoiar estudos de descoberta de drogas usando o sequenciamento de RNA de núcleo único para investigar a eficácia e a segurança de tratamentos potenciais. Portanto, estamos desenvolvendo protocolos padronizados de extração de núcleos para amostras de tecido fresco congelado de vários órgãos. Nosso objetivo era automatizar e padronizar a extração de núcleos para alcançar resultados consistentes e confiáveis, reduzindo a variabilidade não biológica.
A vantagem é a automação parcial através do uso de um dissociador robótico e o fluxo de trabalho simples e curto que pode ser aplicado em várias amostras de tecidos de diferentes espécies. Ter protocolos padronizados pode nos ajudar a responder a perguntas sobre a biodistribuição de medicamentos, bem como explorar os mecanismos subjacentes a quaisquer sinais de segurança que possamos observar. No futuro, testaremos a aplicabilidade do nosso protocolo para outras aplicações downstream, como ATAC-seq ou multiômica.
Também tentaremos estabelecer protocolos para detectar transgenes expressos viricamente em núcleos únicos.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo padronizado e parcialmente automatizado para a extração de núcleos de alta qualidade a partir de tecidos de mamíferos congelados, com o objetivo de aumentar a eficácia e a confiabilidade do sequenciamento de RNA de núcleos individuais. O protocolo serve para aprimorar estudos de descoberta de fármacos ao reduzir a variabilidade não biológica.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Sequenciamento de RNA de núcleos individuais
- Estudos de descoberta de fármacos
- Isolamento de alta qualidade de núcleos
Contexto
- Desenvolvimento de protocolos padronizados de extração de núcleos
- Foco em amostras de tecidos frescos congelados de diversos órgãos
- Objetivo de abordar a biodistribuição de fármacos e sinais de segurança
Métodos Utilizados
- Extração parcialmente automatizada de núcleos usando um dissociador robótico
- Tecidos de mamíferos de diversas espécies
- Implementação da purificação por gradiente de sacarose
Resultados Principais
- Núcleos de alta qualidade obtidos sem sinais de detritos ou agregação
- Resultados consistentes em diferentes tipos de tecidos
- Baixa variabilidade técnica e proporções celulares semelhantes entre amostras
Conclusões
- O estudo automatiza e padroniza com sucesso a extração de núcleos.
- Este protocolo pode ajudar significativamente na obtenção de respostas para questões biológicas em descoberta de fármacos e avaliações de segurança.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento padronizado de núcleos individuais a partir de tecidos congelados permite um perfilamento transcriptômico robusto na descoberta de fármacos, apoiando investigações de eficácia e segurança. Ao minimizar a variabilidade não biológica por meio de automação parcial, este protocolo aumenta a confiança preditiva no sequenciamento de RNA de núcleo único em etapas subsequentes. Sua adaptabilidade a diferentes tipos de tecidos o posiciona como uma capacidade reutilizável para desvio mecanicista em toda a carteira de projetos e validação de alvos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação do mecanismo de fármacos e da expressão gênica específica de tecidos em amostras de difícil dissociação ou amostras arquivadas.
- Reduz a variabilidade técnica, apoiando a validação funcional de alvos e a redução de riscos mecanicistas.
- Facilita a geração de dados reprodutíveis para triagem de portfólio orientada por hipóteses.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prepara suspensões de núcleos de alta qualidade adequadas para protocolos padronizados de sequenciamento de RNA de único núcleo.
- Garante reprodutibilidade do ensaio e consistência na saída quantitativa em diversos tipos de tecidos e espécies.
- Permite o processamento escalonável e parcialmente automatizado de amostras para avaliação confiável de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Alinha-se à análise de tecidos relevantes para doenças na descoberta translacional de biomarcadores ao utilizar amostras congeladas ou arquivadas.
- Mantém a continuidade desde a fase inicial de descoberta até a validação pré-clínica, apoiando estudos com múltiplos tecidos e múltiplas espécies.
- Oferece uma base para futuras aplicações de multiômica e ATAC-seq, conforme referido na perspectiva do protocolo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo integra-se na interface entre a descoberta inicial e a pesquisa pré-clínica, permitindo análise transcritômica de alta fidelidade a partir de tecidos congelados para identificação de compostos líderes e estudos mecanicistas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao permitir a transcriptômica de núcleo único em diversos tecidos.
- Triagem: Fornece preparações reprodutíveis e quantitativas de núcleos para ensaios de sequenciamento posteriores.
- Análises: Oferece saídas padronizadas, como contagens de genes, contagens de UMI e conteúdo mitocondrial, para comparação entre amostras.
- Pesquisa Translacional: Facilita a análise da biodistribuição de fármacos e sinais de segurança em tecidos relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece um protocolo amplamente adaptável para múltiplos tipos de tecidos e espécies, apoiando estudos abrangentes em todo o portfólio.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos transcriptômicos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e automação parcial de fluxos de trabalho de isolamento de núcleos.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao reduzir a variabilidade técnica.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de candidatos a fármacos com base em dados moleculares robustos.
Considerações sobre a Implementação
- Exige expertise no manuseio de tecidos, isolamento de núcleos e fluxos de trabalho de sequenciamento downstream.
- Requer acesso a um dissociador robótico, contador celular fluorescente automatizado e infraestrutura padrão de biologia molecular.
- Exige padronização entre equipes para garantir a reprodutibilidade entre estudos e locais.
- Adaptável a diversos tecidos de mamíferos com mínima otimização, conforme demonstrado em múltiplas espécies.
- Limitações potenciais incluem a necessidade de ajustes no protocolo para tecidos não padrão ou futuras aplicações de multiômica.
