Name: Bioimpressão 3D de hidrogéis fototáveis para estudo da ativação de fibroblastos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Aprenda a bioimpressão 3D de hidrogéis fototáveis para estudar a ativação de fibroblastos em modelos de tecido pulmonar. Esta técnica permite controlar a rigidez da matriz extracelular e investigar mecanismos de doenças pulmonares crônicas.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Adam Feinberg (Carnegie Mellon University) e àqueles que organizaram o 3D Bioprinting Open-Source Workshop. Esses indivíduos possibilitaram o aprendizado das técnicas de bioimpressão FRESH e a construção da bioimpressora 3D utilizada para esses estudos. Além disso, os autores gostariam de agradecer Biorender.com, que foi usado para produzir figuras neste manuscrito. Este trabalho foi apoiado por vários grupos ou fontes de financiamento, incluindo a Rose Community Foundation (DDH e CMM), um Colorado Pulmonary Vascular Disease Research Award (DDH e CMM), a National Science Foundation sob Award 1941401 (CMM), o Departamento do Exército sob o Prêmio W81XWH-20-1-0037 (CMM), o Instituto Nacional do Câncer do NIH sob o Prêmio R21 CA252172 (CMM), o Ludeman Family Center for Women's Health Research da University of Colorado Anschutz Medical Campus (DDH e CMM), o National Heart, Lung, and Blood Institute dos Institutos Nacionais de Saúde sob os prêmios R01 HL080396 (CMM), R01 HL153096 (CMM), F31 HL151122 (DDH) e T32 HL072738 (DDH e AT).

Hidrogéis bioimpressos fotosintonizáveis para sondar as respostas celulares ao enrijecimento da MEC

<ol><li>Ahrens, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+cellular+alignment+in+engineered+cardiac+tissue+via+bioprinting+anisotropic+organ+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks.</a> Advanced Materials. 34 (26), e2200217(2022).</li>
<li>Lin, N. Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+reabsorption+in+3D+vascularized+proximal+tubule+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5399-5404 (2019).</li>
<li>Grigoryan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivascular+networks+and+functional+intravascular+topologies+within+biocompatible+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multivascular networks and functional intravascular topologies within biocompatible hydrogels.</a> Science. 364 (6439), 458-464 (2019).</li>
<li>Kang, Y., Datta, P., Shanmughapriya, S., Ozbolat, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+tumor+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of tumor models for cancer research.</a> ACS Applied Biomaterials. 3 (9), 5552-5573 (2020).</li>
<li>Davis-Hall, D., Thomas, E., Pena, B., Magin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-bioprinted%2C+phototunable+hydrogel+models+for+studying+adventitial+fibroblast+activation+in+pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">3D-bioprinted, phototunable hydrogel models for studying adventitial fibroblast activation in pulmonary arterial hypertension.</a> Biofabrication. 15 (1), (2022).</li>
<li>Mirdamadi, E., Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Palchesko, R. N., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRESH+3D+bioprinting+of+a+full-size+model+of+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">FRESH 3D bioprinting of a full-size model of the human heart.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (11), 6453-6459 (2020).</li>
<li>Shiwarski, D. J., Hudson, A. R., Tashman, J. W., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+FRESH+3D+printing+as+a+platform+for+advanced+tissue+biofabrication%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Emergence of FRESH 3D printing as a platform for advanced tissue biofabrication.</a> APL Bioengineering. 5 (1), 010904(2021).</li>
<li>Petrou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clickable+decellularized+extracellular+matrix+as+a+new+tool+for+building+hybrid+hydrogels+to+model+chronic+fibrotic+diseases+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro.</a> Journal of Materials Chemistry B. 8 (31), 6814-6826 (2020).</li>
<li>Hewawasam, R. S., Blomberg, R., Serbedzija, P., Magin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modification+of+human+decellularized+extracellular+matrix+for+incorporation+into+phototunable+hybrid+hydrogel+models+of+tissue+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Chemical modification of human decellularized extracellular matrix for incorporation into phototunable hybrid hydrogel models of tissue fibrosis.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (12), 15071-15083 (2023).</li>
<li>Saleh, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+hydrogels+comprised+healthy+or+diseased+decellularized+extracellular+matrix+to+study+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid hydrogels comprised healthy or diseased decellularized extracellular matrix to study pulmonary fibrosis.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 15 (5), 505-519 (2022).</li>
<li>Guvendiren, M., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffening+hydrogels+to+probe+short-+and+long-term+cellular+responses+to+dynamic+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Stiffening hydrogels to probe short- and long-term cellular responses to dynamic mechanics.</a> Nature Communications. 3, 792(2012).</li>
<li>Rosales, A. M., Vega, S. L., DelRio, F. W., Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+with+reversible+mechanics+to+probe+dynamic+cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+English%22%5BJournal%5D)">Hydrogels with reversible mechanics to probe dynamic cell microenvironments.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 56 (40), 12132-12136 (2017).</li>
<li>Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+fibrosis%3A+therapeutic+translation+for+fibrotic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease.</a> Nature Medicine. 18 (7), 1028-1040 (2012).</li>
<li>Huertas, A., Tu, L., Humbert, M., Guignabert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammation+within+the+vascular+wall+in+pulmonary+arterial+hypertension%3A+more+than+a+spectator%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammation within the vascular wall in pulmonary arterial hypertension: more than a spectator.</a> Cardiovascular Research. 116 (5), 885-893 (2020).</li>
<li>Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+fibrosis%3A+novel+roles+and+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators.</a> Frontiers in Pharmacology. 5, 123(2014).</li>
<li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrotic+extracellular+matrix+activates+a+profibrotic+positive+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).</li>
<li>Habiel, D. M., Hogaboam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+fibroblast+proliferation+and+survival+in+idiopathic+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in fibroblast proliferation and survival in idiopathic pulmonary fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 5, 2(2014).</li>
<li>Hu, C. J., Zhang, H., Laux, A., Pullamsetti, S. S., Stenmark, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+contributing+to+persistently+activated+cell+phenotypes+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms contributing to persistently activated cell phenotypes in pulmonary hypertension.</a> The Journal of Physiology. 597 (4), 1103-1119 (2019).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+fibroblasts+with+a+proinflammatory+epigenetically+altered+phenotype+in+severe+hypoxic+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Emergence of fibroblasts with a proinflammatory epigenetically altered phenotype in severe hypoxic pulmonary hypertension.</a> The Journal of Immunology. 187 (5), 2711-2722 (2011).</li>
<li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform-reversible+embedding+of+suspended+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform-reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), e1500758(2015).</li>
<li>Brown, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+photocrosslinking+of+click+hydrogels+to+probe+myoblast+mechanotransduction+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Secondary photocrosslinking of click hydrogels to probe myoblast mechanotransduction in three dimensions.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (37), 11585-11588 (2018).</li>
<li>Ondeck, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamically+stiffened+matrix+promotes+malignant+transformation+of+mammary+epithelial+cells+via+collective+mechanical+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamically stiffened matrix promotes malignant transformation of mammary epithelial cells via collective mechanical signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3502-3507 (2019).</li>
<li>Caliari, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffening+hydrogels+for+investigating+the+dynamics+of+hepatic+stellate+cell+mechanotransduction+during+myofibroblast+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Stiffening hydrogels for investigating the dynamics of hepatic stellate cell mechanotransduction during myofibroblast activation.</a> Scientific Reports. 6, 21387(2016).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+amplification+of+fibrosis+through+matrix+stiffening+and+COX-2+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression.</a> Journal of Cell Biology. 190 (4), 693-706 (2010).</li>
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<li>Chelladurai, P., Seeger, W., Pullamsetti, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases and their inhibitors in pulmonary hypertension.</a> European Respiratory Journal. 40 (3), 766-782 (2012).</li>
<li>Caracena, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+epithelial+cells+and+microenvironmental+stiffness+synergistically+drive+fibroblast+activation+in+three-dimensional+hydrogel+lung+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Alveolar epithelial cells and microenvironmental stiffness synergistically drive fibroblast activation in three-dimensional hydrogel lung models.</a> Biomaterials Science. 10 (24), 7133-7148 (2022).</li>
<li>Ruskowitz, E. R., DeForest, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+analysis+of+cellular+response+to+ultraviolet+light+for+biomaterial+synthesis+and+modification%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide analysis of cellular response to ultraviolet light for biomaterial synthesis and modification.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (5), 2111-2116 (2019).</li>
<li>Kruse, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+pH+on+cell+viability%2C+cell+migration%2C+cell+proliferation%2C+wound+closure%2C+and+wound+reepithelialization%3A+In+vitro+and+in+vivo+study%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">The effect of pH on cell viability, cell migration, cell proliferation, wound closure, and wound reepithelialization: In vitro and in vivo study.</a> Wound Repair and Regeneration. 25 (2), 260-269 (2017).</li>
<li>Filippi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusable+biohybrid+designs+for+bioprinted+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue.</a> Advanced Healthcare Materials. , e1500758(2023).</li>
<li>Matthiesen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+3D+culture+and+bioprinting+using+peptide-functionalized+hyaluronan+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Science+and+Technology+of+Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Astrocyte 3D culture and bioprinting using peptide-functionalized hyaluronan hydrogels.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 24 (1), 2165871(2023).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+a+skin+patch+with+dual-crosslinked+gelatin+%28GelMA%29+and+silk+fibroin+%28SilMA%29%3A+An+approach+to+accelerating+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Bioprinting a skin patch with dual-crosslinked gelatin (GelMA) and silk fibroin (SilMA): An approach to accelerating cutaneous wound healing.</a> Materials Today Bio. 18, 100550(2023).</li>
<li>Bliley, J. M., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-bioprinted+human+tissue+and+the+path+toward+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">3D-bioprinted human tissue and the path toward clinical translation.</a> Science Translational Medicine. 14 (666), eabo7047(2022).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar. Partes deste manuscrito são reproduzidas com permissão da © IOP Publishing https://doi.org/10.1088/1758-5090/aca8cf. 5 Todos os direitos reservados.

Reações de polimerização em duplo estágio em resposta à exposição controlada à luz podem enrijecer biomateriais com controle espacial e temporal. Vários estudos têm utilizado essa técnica para avaliar interações célula-matriz em diversas plataformas5,8,9,10,11,21,22,23.<sup class=...

A bioimpressão 3D é uma tecnologia transformadora que permite aos pesquisadores depositar com precisão células e biomateriais em volumes 3D e recriar a complexa estrutura hierárquica dos tecidos biológicos. Na última década, avanços na bioimpressão 3D criaram tecidos cardíacos humanos batidos1, modelos funcionais de tecidos renais2, modelos de trocas gasosas dentro do pulmão3 e modelos tumorais para pesquisa de câncer4. A invenção de técnicas de bioimpressão 3D incorporadas, como a bioimpressão Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel (FRESH), tornou possível reproduzir estruturas complexas de tecidos moles, como vasos sanguíneos pulmonares5 e até coração humano6 em 3D. A bioimpressão 3D FRESH facilita a impressão camada por camada de biotintas macias e de baixa viscosidade através da extrusão em um banho de suporte de desbaste de cisalhamento. O banho de suporte consiste em um material como micropartículas de gelatina bem embaladas que atua como um plástico Bingham e mantém a forma e a estrutura pretendidas da biotinta após a impressão. Uma vez que a construção impressa tenha se solidificado, o banho de suporte pode então ser dissolvido aumentando a temperatura para 37 °C7.
Um artigo de revisão recente resumiu os materiais que foram bioimpressos em 3D em várias publicações usando a técnica FRESH. Esses materiais de origem natural variam desde colágeno tipo I até ácido hialurônico metacrilado e representam vários mecanismos diferentes de gelificação7. A maioria das pesquisas realizadas com essa técnica de bioimpressão 3D emprega biomateriais estáticos que não se alteram em resposta a estímulos externos. Biomateriais dinâmicos de hidrogel fotosajustáveis têm sido utilizados por nosso laboratório e outros 8,9,10,11,12 para modelar uma variedade de doenças fibróticas. Ao contrário dos biomateriais estáticos, as biotintas fotosajustáveis permitem que um modelo amolecido com menor valor de módulo de elasticidade seja criado e posteriormente enrijecido para explorar respostas celulares a aumentos no enrijecimento microambiental.
As doenças fibróticas caracterizam-se pelo aumento da produção de matriz extracelular, que pode causar cicatrizes e enrijecimento13. O enrijecimento tecidual pode iniciar novas lesões e destruição do tecido impactado, causando danos permanentes aos órgãos e até a morte; As desordens fibróticas são responsáveis por um terço da mortalidade mundial. Os fibroblastos produzem excesso e matriz extracelular aberrante nesse estadopatológico 14,15. O aumento da proliferação fibroblástica e a deposição de matriz extracelular enrijecem ainda mais o tecido e ativam uma alça de feedback positivo profibrótico16,17,18,19. O estudo da ativação de fibroblastos é vital para a compreensão das doenças fibróticas. Aqui apresentamos a hipertensão arterial pulmonar (HAP) humana como um exemplo de um distúrbio fibrótico no qual é importante imitar a geometria 3D do vaso sanguíneo usando bioimpressão 3D e introduzir as capacidades de enrijecimento dinâmico dos hidrogéis fotosajustáveis. A HAP é uma condição na qual a pressão nas artérias pulmonares principais ultrapassa os níveis normais e aplica tensão no coração, aumentando a ativação do fibroblasto adventício da artéria pulmonar humana (FAAPH) e enrijece os tecidos dos vasos sanguíneos16,17,18,19. Uma formulação de biotinta de poli(etilenoglicol)-alfa metacrilato (PEGαMA) fototunable permite o enrijecimento temporal em construtos e ajuda a modelar tanto o tecido saudável quanto a progressão da doença 5,8,9,10. A exploração desta característica única permite a quantificação da ativação e proliferação de HPAAF em resposta ao enrijecimento microambiental em 3D e pode fornecer informações valiosas sobre os mecanismos celulares envolvidos nesta doença. O protocolo aqui descrito permitirá aos pesquisadores criar modelos 3D que recapitulam mudanças no microambiente extracelular durante a progressão da doença ou reparo tecidual e estudar a ativação de fibroblastos.

<table><tbody><tr><td>Kit de Radiômetro/Fotômetro AccuMax</td><td>Spectronics Corporation</td><td>XPR-3000</td><td>Para medir a intensidade da luz, usado para fotoendurecer</td></tr><tr><td>Ácido Acético&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401-500</td><td>Usado durante a síntese de PEGaMA</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A184</td><td>Usado com as criosseções</td></tr><tr><td>ActinGreen 488 ReadyProbes</td><td>Fisher Scientific</td><td>R37110</td><td>Usado para coloração de</td></tr><tr><td>folha de alumínio</td><td>Reynolds</td><td>F28028</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano anidro (THF)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>401757-1L</td><td>Usado durante a síntese de PEGaMA</td></tr><tr><td>Argônio Gás Comprimido</td><td>Airgas</td><td>AR R300</td><td>Usado durante a síntese de PEGaMA</td></tr><tr><td>8 Arm Poli(etilenoglicol)-hidroxila (PEG-OH)</td><td>JenKem Technology</td><td>8ARM-PEG-10K</td><td>Usado durante a síntese de PEGaMA</td></tr><tr><td>365 nm Filtro passa-banda</td><td>Edmund Optics</td><td>65-191</td><td>Usado para fotoendurecimento</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9700-100</td><td>Usado durante o processo de coloração</td></tr><tr><td>Buchner Funnel</td><td>Quark Glass</td><td>QFN-8-14</td><td>Usado durante a síntese de PEGaMA</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Invitrogen</td><td>65-0853-39</td><td>Usado durante o processo de coloração</td></tr><tr><td>Celite 545 (Auxiliar de filtração)</td> <td>EMD Millipore</td><td>CX0574-1</td><td>Usado durante a síntese de PEGaMA</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio carregadas</td><td>Globe Scientific</td><td>1358W</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio-d</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151823-10X0.75ML</td><td>Usado para caracterizar o PEGaMA</td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Kit de Proliferação de Células</td><td>Invitrogen</td><td>C10637</td><td>Usado para colorir</td></tr><tr><td>tubos cônicos de 50 mL</td><td>CELLTREAT</td><td>667050B</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Segurança Criogênica</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-25000-85</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM 1850-3-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Diálise</td><td>Repligen</td><td>132105</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>Usado para coloração</td></tr><tr><td>Éter Dietílico</td><td>Fisher Scientific</td><td>E1384</td><td>Usado durante a síntese de PEGaMA</td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td>componente Bioink</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Cytiva</td><td>SH30271. </td><td></td></tr><tr><td>Papel de Filtro</td> FS <td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>Usado durante a síntese de PEGaMA</td></tr><tr><td>Sistema de Liofilização Freezone 2.5L</td><td>Labconco</td><td>LA-2.5LR</td><td>Liofilizador</td></tr><tr><td>Fusion 360</td><td>Autodesk</td><td>N/A</td><td>Download de software</td></tr><tr><td>Seringa à prova de gás de 2,5 mL</td><td>Hamilton</td><td>81420</td><td>Usado para bioimpressão</td></tr><tr><td>15 Gauge 1.5" IT Series Tip</td><td>Jensen Global</td><td>JG15-1.5X</td><td>Usado para bioimpressão</td></tr><tr><td>30 Gauge 0.5" HP Series Tip</td><td>Jensen Global</td><td>JG30-0.5HPX</td><td>Usado para bioimpressão</td></tr><tr><td>de cabra Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Anticorpo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A21422</td><td>Usado para coloração</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>C2H5NO2</td><td>Usado durante o processo de coloração</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>1461</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Usado durante o processo de coloração</td></tr><tr><td>Fibroblastos adventícios da artéria pulmonar humana (HPAAFs)</td><td>AcceGen</td><td>ABC-TC3773&nbsp;</td><td>De um paciente do sexo masculino de 2 anos de idade</td></tr><tr><td>Ácido Clorídrico (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>Usado para ajustar o pH das soluções</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td>N/A</td><td>Download gratuito de software</td></tr><tr><td>ImmEdge&reg; Caneta</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>Usado durante o processo de coloração</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>VWR</td><td>VWR51014991</td><td></td></tr><tr><td>LifeSupport Pasta de micropartículas de gelatina (pasta de gelatina)</td> <td>Advanced Biomatrix</td><td>5244-10GM</td><td>Usado para bioimpressão</td></tr><tr><td>Microscópio de luz Microscópio de luz</td><td>invertida</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td></tr><tr><td>Lítio Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoilfosfinato ( LAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900889-5G</td><td>Fotoiniciador usado para fotoendurecimento</td></tr><tr><td>de Nitrogênio Líquido</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LulzBot Mini 2&nbsp;</td><td>LulzBot</td><td>N/A</td><td>Bioprinter adaptado</td></tr><tr><td>Metacriloxietil Tiocarbamoil Rodamina B&nbsp;</td><td>Policiências Inc.</td><td>669775-30-8</td><td></td></tr><tr><td>pistões capilares CP1000</td><td>VWR</td><td>76178-166</td> da <td>pipeta do deslocamento positivo das pontas</td></tr> MMP2 do Pincha do <tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631-4L</td><td></td>Microman do<td>2-Methylbutane</td></tr><tr><td>(KCGGPQGIWGQGCK)</td> <td>GL Biochem</td><td>N/A</td><td>Bioink componente</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human &alpha;SMA Monoclonal Anticorpo</td><td>Fisher Scientific</td><td>MA5-11547</td><td>Usado para coloração</td></tr><tr><td>Série OmniCure 2000</td><td> Lumen Dynamics</td><td>S2000-XLA</td><td>Fonte de luz UV usada para fotoendurecimento</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)&nbsp;</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>15710</td><td>Usado para fixar amostras</td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Mettler Toledo&nbsp;</td><td>FP20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de pH</td><td>Cytiva</td><td>10362010</td><td></td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Hyclone Laboratories, Inc.</td><td>Cytiva SH30256. </td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Pipetas</td> FS <td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L Pontas de Pipeta</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3710</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; L Pontas de Pipeta</td><td>USA Scientific</td><td>1183-1510</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L Pontas de Pipeta</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0700</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Pontas de Pipeta</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2721</td><td></td></tr><tr><td>Poli(Etilenoglicol)-Alfa Metacrilato (PEG&alpha; MA)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Consulte o manuscrito para as etapas de síntese</td></tr><tr><td>Poli(Óxido de Etileno) (PEO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372773-250G</td><td>Pipeta de Deslocamento Positivo do componente Bioink</td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>FD10004G</td><td>100-1000 &micro; L</td></tr><tr><td>Hidróxido de Potássio (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473-500G</td><td>Usado para ajustar o pH das soluções</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Usado durante o processo de coloração</td></tr><tr><td>Pronterface</td><td>All3DP</td><td>N/A</td><td>Download do software</td></tr><tr><td>Iodeto de Propídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864-10ML</td><td>Usado para coloração</td></tr><tr><td>do Peptídeo RGD (CGRGDS)</td><td>GL Biochem</td><td>N/A</td><td>Componente Bioink</td></tr><tr><td>Rocker</td><td>VWR</td><td>10127-876</td><td></td></tr><tr><td>Evaporador Rotativo&nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td>11100V2022</td><td>Usado durante a síntese de PEGaMA</td></tr><tr><td>Grampos</td> de<td>Elástico</td><td>808659</td><td></td></tr><tr><td>Schlenk Flask&nbsp;</td><td>Kemtech America</td><td>F902450</td><td>Usado durante a síntese de PEGaMA</td></tr><tr><td>Slic3r</td><td>Slic3r</td><td>N/A</td><td>Download do software</td></tr><tr><td>Meio de Crescimento de Células de Músculo Liso-2 (SmGM-2) BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3182</td><td>O kit contém componentes CC-3181 e CC-4149</td></tr><tr><td>Hidreto de Sódio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223441-50G</td><td>Usado durante a síntese de PEGaMA</td></tr><tr><td>Sorvall ST 40R</td><td>Centrifuge Fisher Scientific</td><td>75-004-525</td><td></td></tr><tr><td>Stir Bar</td><td>VWR</td><td>58948-091</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa</td><td>VWR</td><td>28145-483</td><td>Usado para esterilizar soluções de filtro</td></tr><tr><td>T-75 Balão tratado com cultura de tecidos VWR</td><td></td><td>82050-856</td><td>Usado para trabalho</td></tr> <tr>de cultura de células<td>Tissue-Tek Cyromold</td><td>Sakura</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Composto Tissue-Tek O.C.T (OCT)</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-Carboxietil) Fosfina (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Biorreagents</td><td>C34H622O11</td><td>Usado durante o processo de coloração</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td>Usado para cultura de células trabalho</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-062</td><td>Usado para trabalho de cultura de células</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>C58H114O26</td><td>Usado durante o processo de coloração</td></tr><tr><td>Microscópio Vertical</td><td>Olympus</td><td>BX63F</td><td>Capacidades do microscópio fluorescente</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>PolyScience</td><td>WBE20A11B</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de 24 poços</td><td>Corning</td><td>3527</td><td></td></tr></tbody></table>

bioimpressão 3d de hidrogéis fototáveis para estudo da ativação de fibroblastos

3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation

Os hidrogéis fotosajustáveis podem transformar-se espacial e temporalmente em resposta à exposição à luz. A incorporação desses tipos de biomateriais em plataformas de cultura celular e o desencadeamento dinâmico de mudanças, como o aumento da rigidez microambiental, permite aos pesquisadores modelar as mudanças na matriz extracelular (MEC) que ocorrem durante a progressão da doença fibrótica. Neste trabalho, é apresentado um método para bioimpressão 3D de um biomaterial hidrogel fototável capaz de duas reações sequenciais de polimerização dentro de um banho suporte de gelatina. A técnica de bioimpressão Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH) foi adaptada ajustando-se o pH do banho de suporte para facilitar uma reação de adição de Michael. Primeiro, a biotinta contendo poli(etilenoglicol)-alfa metacrilato (PEGαMA) foi reagida fora da estequiometria com um reticulante degradável por células para formar hidrogéis moles. Esses hidrogéis moles foram posteriormente expostos ao fotoinibidor e à luz para induzir a homopolimerização dos grupos não reagidos e enrijecer o hidrogel. Este protocolo abrange síntese de hidrogel, bioimpressão 3D, fotoenrijecimento e caracterizações de desfechos para avaliar a ativação de fibroblastos em estruturas 3D. O método aqui apresentado permite aos pesquisadores bioimprimir em 3D uma variedade de materiais que sofrem reações de polimerização catalisadas por pH e pode ser implementado para projetar vários modelos de homeostase, doença e reparo tecidual.

Este protocolo descreve como bioimprimir hidrogéis fototáveis em 3D dentro de um banho de suporte para criar construções capazes de enrijecimento dinâmico e temporal para estudar a ativação de fibroblastos em geometrias que mimetizam tecidos humanos. Primeiro, o protocolo explicou como sintetizar PEGαMA, a espinha dorsal desse sistema polimérico fotosintonizável. Medidas de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) mostraram sucesso na funcionalização do PEGαMA em 96,5% (Figura 1...

Este artigo descreve como bioimprimir hidrogéis fototáveis em 3D para estudar o enrijecimento da matriz extracelular e a ativação de fibroblastos.

Bioimpressão 3D de hidrogéis fototáveis para estudo da ativação de fibroblastos

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture ...

Projetamos modelos 3D de tecido pulmonar para ajudar o mundo a respirar mais facilmente. Nossa missão é usar biomateriais 3D e técnicas como a impressão 3D para construir plataformas que nos ajudem a entender o que está causando doenças pulmonares crônicas e como tratar melhor essas condições. Um desafio experimental em nossa pesquisa é a dificuldade de imprimir materiais macios em 3D em formas complexas.Depositamos células com precisão imprimindo nossa biotinta e banho de suporte de afinamento de tecido que ajuda a manter sua forma durante o processo de impressão. Nossos biomateriais fornecem controle sobre as propriedades mecânicas da amostra durante todo o curso do experimento. Esta formulação permite que os pesquisadores cultivem células em um hidrogel que combina com a rigidez do tecido pulmonar saudável e doente.Os usuários podem decidir quando enrijecer as amostras e medir as respostas celulares. Os biomateriais fotossintonizáveis utilizados neste protocolo permitem a criação de um modelo amolecido que pode ser posteriormente enrijecido para explorar as respostas celulares ao enrijecimento microambiental. Técnicas semelhantes que usam um biomaterial estático em vez de um biomaterial fotossintonizável resultam em um modelo que não pode ser enrijecido após a impressão.Resultados de outros estudos em nosso laboratório sugerem que sexo e idade desempenham papéis críticos na progressão da doença pulmonar. Modelos futuros estudarão essas variáveis e incluirão mais complexidade, como camadas adicionais específicas de células. A conjugação desses esforços resultará em bioimpressões mais realistas e levará a novas formas de tratar doenças fibróticas.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um bioprinter foi usada para criar hidrogéis modeladas com base num molde de sacrifício. O molde foi poloxâmero backfilled hidrogel com um segundo e, em seguida eluiu-se, deixando espaços vazios que foram preenchidos com uma terceira hidrogel. Este método utiliza eluição rápida e boa capacidade de impressão de poloxamero para gerar arquiteturas complexas de biopolímeros.

Impressão de Moldes reversa Thermoresponsive para a Criação de Patterned hidrogéis de dois componentes para Cultura de Células em 3D

Nós descrevemos um conjunto de protocolos que, juntos, oferecem uma bioink hidrogel que imita o tecido com o qual construções de tecido 3-D funcionais e viáveis ​​podem ser bioprinted para uso em aplicações in vitro de rastreio.

Bioprinting celularizado Constrói Usando um específico do tecido Hidrogel Bioink

A imagem de transferência de energia por ressonância de Förster (FRET) é uma ferramenta poderosa para estudos de biologia celular em tempo real. Aqui é apresentado um método para imagens de células FRET em microambientes fisiológicos de hidrogel tridimensional (3D) usando microscopia de epifluorescência convencional. Uma análise para sondas FRET raciométricas que produz razões lineares ao longo da faixa de ativação é descrita.

FRET Imaging no hidrogéis tridimensionais

Análogos de cartilagem e pele foram bioprinted usando um bioink de nanocellulose-alginato com base. Os bioinks era compartimentados antes da impressão através de uma unidade de mistura passiva de passo único. As construções foram demonstradas para ser uniformemente compartimentado, têm alta viabilidade e exibem favoráveis marcadores de diferenciação.

Bioprinting da cartilagem e Analogs de tecido de pele utilizando um romance passiva unidade técnica de mistura para Bioink Precellularization

Desenvolvemos um modelo de câncer de mama heterogênea consistindo de células de tumor e fibroblasto imortalizadas incorporadas em um bioink de alginato/gelatina de bioprintable. O modelo recapitula o microambiente do tumor na vivo e facilita a formação de esferoides tumor multicelulares, produzindo insights sobre os mecanismos de condução tumorigênese.

Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D em Vitro sistemas modelo induzem a formação de esferoide de célula

Apresentado aqui é um método para a bioimpressão 3D de gelatina methacriloyl.

Protocolos de bioimpressão 3D de bioinks baseados em hidrogel de gelatina

Aqui, desenvolvemos uma nova estratégia modificada multicamadas para bioinks semelhantes a líquidos (gelatina methacryloyl com baixa viscosidade) para evitar a sedimentação de células encapsuladas.

Usando bioink de hidrogel multicamadas em bioimpressão tridimensional para distribuição celular homogênea

O método apresentado envolve alongamento uniaxial de hidrogéis macios 3D embutidos na borracha de silicone, permitindo microscopia confocal ao vivo. Demonstra-se a caracterização das cepas de hidrogel externos e internos, bem como o alinhamento de fibras. O dispositivo e o protocolo desenvolvidos podem avaliar a resposta das células a vários regimes de tensão.

Tensão controlada de hidrogéis 3D sob imagem de microscopia ao vivo

O processamento de cisalhamento durante a formação de hidrogel resulta na produção de suspensões de microgel que se reestruturam rapidamente, mas rapidamente após a remoção das forças de cisalhamento. Tais materiais têm sido utilizados como matriz de suporte para bioimpressão de estruturas complexas carregadas de células. Aqui, são descritos os métodos utilizados para a fabricação do leito de suporte e das biotintas compatíveis.

Géis fluidos de agarose formados por processamento de cisalhamento durante gelificação para bioimpressão 3D em suspensão

Este estudo apresenta um novo banho de suspensão de submicrogel de κ-carragenina, exibindo notáveis propriedades reversíveis de transição de interferência-desobstrução. Esses atributos contribuem para a construção de tecidos e órgãos biomiméticos em bioimpressão 3D embarcada. A impressão bem-sucedida de tecidos semelhantes ao coração/esôfago com alta resolução e crescimento celular demonstra aplicações de bioimpressão e engenharia de tecidos de alta qualidade.

Bioimpressão Incorporada de Estruturas Semelhantes a Tecidos Usando Meio Submicrogel κ-Carragenana

Aprenda a bioimpressão 3D de hidrogéis fototáveis para estudar a ativação de fibroblastos em modelos de tecido pulmonar. Esta técnica permite controlar a rigidez da matriz extracelular e investigar mecanismos de doenças pulmonares crônicas.

Bioimpressão 3D de hidrogéis fototáveis para estudo da ativação de fibroblastos

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