Name: Medindo a função mitocondrial de células T CD8 virgens e efetoras (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Aprenda a medir o metabolismo mitocondrial em células T CD8 usando o teste de estresse mitocondrial. Este método permite analisar a bioenergética e a sinalização do receptor de células T em tempo real.

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<table><tbody><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD28</td><td>Biolegend</td><td>102116</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3/CD28 Dynabeads</td><td>ThermoFisher</td><td>11456D</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilated anti-CD3 Biolegend</td><td></td><td>317320</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108321-42-2</td><td></td></tr><tr><td>Kit de isolamento</td> <td>de células T CD8a+Filtros de Células Miltenyi Biotec</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>(100 &micro; m)</td> <td>TRATAMENTO CELULAR</td><td>229485</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8008</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>26873-85-8</td><td>meio gradiente de densidade&nbsp;</td></tr><tr><td>FCCP ((4-(trifluorometoxi) fenil) carbonohidrazonoílo dicianeto)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-6152</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>LS Colunas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Colunas de seleção positiva</td></tr><tr><td>Coluna de separação de células magnéticas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-301</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca</td><td>Agilent</td><td>102601-100</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>113-24-6</td><td></td></tr><tr><td>Recobinante IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Meio de cavalo-marinho</td><td>Agilent</td><td>103576-100</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho sensor</td><td>Agilent</td><td>102601-100</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Placa estéril de 6 poços</td><td>CELL TREAT</td><td>230601</td><td></td></tr><tr><td>Placa estéril de 24 poços</td><td>CELL TREAT</td><td>229524</td><td></td></tr><tr><td>XF Calibrant</td><td></td><td>Agilent 102601-100</td><td></td></tr></tbody></table>

medindo a função mitocondrial de células t cd8 virgens e efetoras

Measuring Mitochondrial Function of Na&#239;ve and Effector CD8 T Cells

As capacidades metabólicas glicolíticas e oxidativas podem ser medidas usando um ensaio funcional mitocondrial que avalia as capacidades visando componentes da cadeia de transporte de elétrons em pontos de tempo específicos (Figura 2A). Diferentes esquemas de injeção podem ser carregados nas portas do cartucho do sensor para modificar o ensaio tradicional e avaliar a estimulação aguda do TCR (Figura 2B, C). O número de células e a concentração d...

Medindo a função mitocondrial de células T CD8 virgens e efetoras

Understanding how immunometabolism impacts the function, differentiation, and fate of lymphocytes has garnered significant interest and attention. ...

measuring-mitochondrial-function-of-nave-and-effector-cd8-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Mediada por células-linfocitotoxicidade (CML) os ensaios podem ser usados ​​para testar as respostas auto-reativos e mecanismos de estudo de morte celular in vitro. No entanto, usando live-célula confocal técnicas de imagem microscópica com corantes fluorescentes, do tipo e da cinética de morte celular, bem como as vias utilizadas podem ser estudados em maior detalhe.

Métodos para avaliar Mediated Beta Morte celular por linfócitos T citotóxicos

Este vídeo demonstra a avaliação do funcionamento mitocondrial das células endoteliais vasculares cerebrais (CVE) usando um ensaio de fluxo extracelular. As células CVE são plaqueadas em uma placa de cultura de células de fluxo extracelular. Os sensores de fluxo extracelular são hidratados antes do carregamento e calibração no bioanalisador. A placa contendo células é então carregada para análise.

Avaliação da função mitocondrial em células endoteliais vasculares cerebrais

Este protocolo descreve um ensaio de citotoxicidade sensível baseado em células. Ao enumerar a diminuição na frequência de células T CD4+ alvo vivas na presença de um número crescente de células T CD8+ efetoras, este ensaio permite a avaliação direta da atividade citolítica de células T CD8+ específicas do antígeno.

Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade

Aqui descrito é um método para detectar e quantificar as proteínas da membrana exterior mitocondrial por imunomarcação das mitocôndrias isoladas a partir de tecidos de roedores e de análise por citometria de fluxo. Este método pode ser estendido para avaliar os aspectos funcionais de subpopulações mitocondriais.

Imunodetecção de membrana externa proteínas por citometria de fluxo de mitocôndrias isoladas

Este artigo ilustra um poderoso método para quantificar as mitocôndrias ou lisossomos em células vivas. A combinação de corantes lisossomo mitocôndria-específico ou com conjugado fluorescente anticorpos marcadores de superfície permite a quantificação dessas organelas em populações de células mistas, como as células primárias de amostras de tecido, colhidas por meio de citometria de fluxo multicolor.

Quantificação de baseados em citometria de fluxo multicolor de mitocôndrias e lisossomos em células T

Nós descrevemos aqui um ensaio in vivo cytometry-baseado do fluxo da matança que permita a examinação do immunodominance em respostas citotóxicas do linfócito de T (CTL) a um antígeno modelo do tumor. Nós fornecemos exemplos de como este ensaio elegante pode ser empregado para estudos mecanistic e para o teste da eficácia da droga.

Adaptando os ensaios de citotoxicidade in vivo para estudar Imunodominância em respostas de células T CD8+ específicas do tumor

Aqui descrevemos um método confiável para medir a massa mitocondrial e o potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas cultivadas ex vivo e células T.

Medição da massa mitocondrial e potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas e células T por citometria flow

A adaptação metabólica é fundamental para as células T, pois dita diferenciação, persistência e citotoxicidade. Aqui, é apresentado um protocolo otimizado para monitorar a respiração mitocondrial em células T primárias humanas diferenciadas por citocinas ex vivo .

Monitoramento em tempo real da respiração mitocondrial em células T primárias humanas diferenciadas por citocinas

Um procedimento para estudar a dinâmica do metabolismo do DNA mitocondrial (mtDNA) em células usando um formato de placa multi-poço e imagens automatizadas de imunofluorescência para detectar e quantificar a síntese e distribuição do mtDNA é descrito. Isso pode ser usado para investigar os efeitos de vários inibidores, estresses celulares e silenciamento gênico no metabolismo do mtDNA.

Quantificação baseada em imagens de alto rendimento da síntese e distribuição do DNA mitocondrial

Esta técnica descreve um fluxo de trabalho eficaz para visualizar e medir quantitativamente o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido dentro de células HeLa usando imagens ao vivo baseadas em fluorescência.

Quantificação Baseada em Fluorescência do Potencial de Membrana Mitocondrial e Níveis de Superóxido Usando Imagem Viva em Células HeLa

Os métodos para estudar a bioenergética mitocondrial sob concentrações de substrato fisiologicamente relevantes em células imunes são limitados. Fornecemos um protocolo detalhado que usa fluorespirometria de alta resolução para avaliar as mudanças na resposta do potencial da membrana mitocondrial à demanda de energia em células T humanas, monócitos e células mononucleares periféricas.

Fluorespirometria de alta resolução para avaliar mudanças dinâmicas no potencial da membrana mitocondrial em células imunes humanas

Aprenda a medir o metabolismo mitocondrial em células T CD8 usando o teste de estresse mitocondrial. Este método permite analisar a bioenergética e a sinalização do receptor de células T em tempo real.

Medindo a função mitocondrial de células T CD8 virgens e efetoras

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