Medindo a função mitocondrial de células T CD8 virgens e efetoras

Nosso laboratório estuda tolerância imunológica, vigilância imunológica e sinalização de receptores de antígenos por linfócitos. Descobrimos que o ácido lisofosfatídico interrompe a citotoxicidade das células T CD8, promovendo tolerância periférica, reduzindo a flexibilidade metabólica nas células efetoras. Usamos tecnologias para medir o metabolismo mitocondrial e as capacidades energéticas em células T CD8.

Nosso laboratório mostrou que o ácido lisofosfatídico modula a aptidão metabólica das células T CD8 e pode ser um importante determinante dos fenótipos das células T. Nosso protocolo aqui descrito avalia o metabolismo funcional e a bioenergética da sinalização do receptor de células T em tempo real. Para começar, adicione 200 microlitros de água destilada em cada poço de uma placa utilitária.

Coloque um cartucho sensor em cima da placa utilitária, garantindo que as extremidades do cartucho sensor estejam submersas para permitir a hidratação adequada. Incube a placa de utilidade com o cartucho do sensor a 37 graus Celsius por no mínimo 10 horas em uma incubadora sem dióxido de carbono. Em seguida, encha um tubo cônico de 50 mililitros com 50 mililitros de solução calibrante e incuba.

No dia seguinte, sacuda o prato para remover a água destilada. Reidrate a placa com 200 microlitros de calibrante. Recoloque o cartucho do sensor na parte superior da placa de utilidade e coloque a placa de volta na incubadora sem dióxido de carbono.

Em seguida, use uma pipeta multicanal para ressuspender 10 milhões de células T CD8 em 4,5 mililitros de meio completo. Pipetar 90 microlitros da suspensão para cada poço, seguidos de 90 microlitros do meio designado por poço durante o pré-tratamento. Pipete 180 microlitros de meio completo nos poços de canto para evitar a evaporação.

Em seguida, coloque a microplaca com as células T CD8 em uma incubadora sem dióxido de carbono. Coloque os adaptadores de placa firmemente no cartucho do sensor. Após a incubação, use adaptadores de placa para pipetar oligomicina, FCCP, rotenona e antimicina A nas respectivas portas.

Coloque a microplaca na incubadora sem dióxido de carbono uma hora antes de iniciar o ensaio. Abra o software e calibre o analisador do instrumento 30 minutos antes de carregar a microplaca. Rotule os poços e revise o esquema de injeção no sistema de software.

Em seguida, carregue o cartucho do sensor no instrumento durante a calibração. Execute o ensaio através do software. Para injeções adicionais, modifique os esquemas de injeção usando a câmara adicional para a injeção.

Carregue anti-CD3 e anti-CD28 na porta A do cartucho do sensor. Carregue a oligomicina na porta B, FCCP na porta C e rotenona e antimicina A na porta D. Para estimulação individual anti-CD3 e anti-CD28, pipete 20 microlitros de anti-CD3 biotinilado a 10 microgramas por mililitro nos poços designados do cartucho do sensor. Pipete 20 microlitros de anti-CD28 e estreptavidina nos poços designados.

Para estimulação anti-CD3 ou CD28, combine e pipete 20 microlitros de anti-CD3, anti-CD28 e estreptavidina biotinilados nos poços designados. Preparar os alvéolos de controlo injectando meios. Para estimulação combinada anti-CD3 e CD-28, use uma proporção de um para um cordão para célula e pipete cinco microlitros de esferas magnéticas anti-CD3 CD-28 nos poços designados contendo 200.000 células por poço.

Prepare os alvéolos de controlo com meios apenas para injecção. Ajuste os venenos em cada porta para atingir as concentrações finais pós-injeção. Certifique-se de que o esquema de injeção reflita os pontos de tempo atualizados antes de carregar a microplaca no instrumento.

Programe o software para executar o ensaio de estimulação TCR aguda por um total de 140 minutos. Modifique o esquema para incluir 10 medições pontuais antes da injeção de oligomicina. A estimulação aguda do TCR usando anti-CD3 e/ou anti-CD28 biotinilado com estreptavidina e estimulação de esferas magnéticas anti-CD3 e/ou CD-28 resultou em aumento da taxa de consumo de oxigênio e da taxa de acidificação extracelular em comparação com controles somente de mídia.

A estimulação com esferas magnéticas anti-CD3 e CD-28 mostrou respostas metabólicas comparáveis às injeções biotiniladas de anti-CD3 e CD-28 com aumentos semelhantes na taxa de consumo de oxigênio e na taxa de acidificação extracelular.