Name: Vírus pseudotipados como uma ferramenta molecular para monitorar respostas imunes humorais contra SARS-CoV-2 via ensaio de neutralização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-21T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Aprenda a produzir vírus pseudotipados de SARS-CoV-2 usando sistema de três plasmídeos em células HEK 293T. Este método seguro em nível BSL-2 permite avaliar anticorpos neutralizantes em amostras de soro pós-vacinação.

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Reconhecemos a contribuição dos profissionais de saúde voluntários. Este projeto foi apoiado pelo Departamento de Excelência 2023/2027, MUR, Itália. A AR e a DZ foram apoiadas pela PRIN2022 (fundos da UE; NextGenerationEU)

O presente protocolo foi aprovado e segue as diretrizes do Comitê de Ética da Universidade de Verona (protocolo de aprovação número 1538). Consentimento informado por escrito foi obtido dos sujeitos humanos participantes do estudo. Amostras de sangue total foram coletadas de voluntários de profissionais de saúde que estavam no processo de receber vacinas anti-SARS-CoV-2. Essas amostras foram coletadas em tubos plásticos contendo anticoagulantes para posterior isolamento do soro15.
Todos os processos a seguir devem ser realizados em uma capa biológica Classe 2, trabalhando em condições estéreis. O manuseio do vírus deve ser realizado com cuidado, e todos os resíduos devem ser neutralizados em uma solução de água sanitária diluída. Uma visão geral do protocolo é exibida na Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig01v2.jpg"> Figura 1: Representação gráfica de um ensaio de neutralização. (A) produção de PV, (B) titulação de PV e (C) ensaio de neutralização. Todos os procedimentos são realizados em capuz biológico classe 2 em condições estéreis. A etapa de titulação (B) precisa ser realizada para padronizar os níveis de infectividade dos PVs antes do uso no ensaio de neutralização (C). Esta figura foi criada com o BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
1. Produção de PVs SARS-CoV-2 e teste de infecciosidade
<ol><li>Sementes 5 x 105 células HEK293T em meio Dulbecco Modified Eagle Medium completo (DMEM, alta glicose, 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina) em uma placa de 6 poços (6WP) para atingir uma densidade celular adequada compatível com o reagente de transfecção utilizado. No caso de realizar a transfecção com polietilenonimina (PEI) (preparar o reagente seguindo as instruções do fabricante), certifique-se de que as células atinjam 40-60% de densidade no dia da transfecção (passo 1.3). Manter as células em estufa umidificada a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Antes da transfecção, substitua o meio celular gasto por meio fresco sem antibióticos (DMEM, alta glicose, 10% FBS, 1% L-glutamina) para alcançar maior eficiência de transfecção. NOTA: No dia seguinte à semeadura, HEK293T células estão prontas para serem transfectadas.</li>
	<li>Transfect aderente HEK293T células com um reagente de transfecção adequado de acordo com as instruções do fabricante. Se estiver usando PEI, prepare duas misturas e siga os passos abaixo.<ol><li>Para preparar a mistura A, adicione 500 ng de pCMV-dR8.91 empacotando plasmídeo16, 750 ng de pCSFLW plasmídeorepórter 16, e 450 ng de Spike SARS-CoV-2 expressando plasmídeo em 100 μL de meio de soro reduzido.</li>
		<li>Para preparar a mistura B, adicionar 17,5 μL de PEI (concentração: 1 mg/mL) a 100 μL do meio de soro reduzido.</li>
		<li>Deixe ambas as misturas incubarem à temperatura ambiente (TR) por 5 min. Em seguida, misture o conteúdo de ambos os tubos adicionando a mistura de PEI B à mistura de DNA A.</li>
		<li>Incube o tubo por 20-30 min no RT. Agite o tubo suavemente a cada 3-4 min para melhorar a mistura. Finalmente, adicione a mistura às células HEK293T.</li>
	</ol></li>
	<li>16-20 h após a transfecção, substituir o meio de cultura por DMEM fresco e completo. Incubar a 37 °C e 5% CO2, para permitir a produção de PVs por células transfectadas.</li>
	<li>72 h após a transfecção, colher o sobrenadante contendo PVs. Em seguida, centrifugar a 1600 x g por 7 min à temperatura ambiente para remover restos celulares e células mortas e filtrá-lo através de um filtro de acetato de celulose de 0,45 μm.</li>
	<li>ETAPA OPCIONAL: Para aumentar o rendimento final do título PV, realizar múltiplas transfecções, agrupar o meio celular contendo PVs e concentrá-lo usando tubos concentradores.</li>
	<li>Prosseguir directamente com os passos seguintes ("titulação PV", secção 2) ou alicitar o meio contendo PV em tubos adequados para armazenar a -80 °C até à utilização. Preparar uma alíquota adicional (400-500 μL) para ser usada para titulação. NOTA: A confecção de alíquotas múltiplas garantirá a reprodutibilidade entre os experimentos, evitando ciclos excessivos de congelamento de degelo.</li>
</ol>2. Titulação dos PVs
<ol><li>Use o meio fresco contendo PV para as próximas etapas ou descongele a alíquota de teste (etapa 1.7) para realizar a titulação do novo estoque viral. O congelamento de alíquotas do mesmo estoque fotovoltaico garantirá a reprodutibilidade.</li>
	<li>Adicionar 50 μL de DMEM completo (ou meio completo compatível com a linhagem celular alvo em uso) em todos os poços de uma placa de poço de 96 (96WP) necessários para testar em duplicado o estoque fotovoltaico, deixando a linha "A" vazia. Adicione 100 μL de estoque de PVs à linha "A". Com base no número de preparações a serem testadas, deixar uma coluna sem o vírus como controle "somente célula" (Figura 2).</li>
	<li>Pipetar 50 μL da linha A para a linha B e repetir este processo até à linha G para obter diluições em série do stock inicial. Descarte o volume excedente da última linha.</li>
	<li>Destacar as células usando tripsina/ácido etilenodiaminotetracético 1x (EDTA) no tampão fosfato salino 1x (DPBS 1x) de Dulbecco, após remover o meio gasto e lavar as células com DPBS 1x duas vezes. Preparar as células para uma densidade de 4 x 105 células/mL. OBS: Neste protocolo, a infecção por PVs foi testada na linhagem celular suscetível HEK293T/ACE2; tais células foram derivadas de HEK293T, transduzidas usando um vetor lentiviral para expressar o receptor ACE2.</li>
	<li>Adicione 50 μL da suspensão celular em cada poço para garantir uma contagem de células de 2 x 104 células por poço.</li>
	<li>Incubar a 37 °C e 5% CO2, durante 48 h.</li>
	<li>Após a incubação, realizar o ensaio Luciferase para obter a leitura de acordo com as instruções do fabricante. Adicionar 100 μL do reagente luciferase aos poços e incubar no escuro em TR por 2 min. Mova o conteúdo de cada poço para uma placa preta de 96 poços (compatível com o leitor de placas disponível) e leia as placas em um leitor de placas de 96 poços. NOTA: O luminômetro usado para a leitura da luciferase produzirá um arquivo de planilha com os dados brutos e não processados que serão usados para análise a jusante (neste caso, um arquivo Excel). A infectividade do vírus será expressa em unidades de luminescência relativa (RLU) (descritas no ponto 4.1).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig02.jpg"> Figura 2: Layout representativo de uma placa de 96 poços para titulação de PVs. Um volume fixo de sobrenadante contendo PV é adicionado à linha A, colunas 1-11, e diluído em série. A última coluna é deixada como o controle "somente célula". Esta figura foi criada com o BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. Ensaio de neutralização
<ol><li>Descongelar soros dos pacientes no gelo. Inativar amostras de soro incubando-as a 56 °C por 30 min.</li>
	<li>Em uma placa de 96 poços, adicionar 50 μL do DMEM fresco completo (ou meio completo compatível com a linhagem celular alvo utilizada) em cada um dos seguintes poços: da linha B (colunas 1-10) à linha H (colunas 1-10). Colocar 95 μL do DMEM fresco e completo na linha A (colunas 1-10). Adicionar 50 μL e 100 μL de DMEM completo nos poços das colunas 11 e 12, respectivamente. Estes serão os controles infectados (controle de vírus, ou CV) e não infectados (somente células ou CC), respectivamente (Figura 3).</li>
	<li>Adicionar 5 μL de amostras de soro/plasma inactivadas termicamente na linha A (colunas 1-10). Cada amostra será em duplicata. Com uma pipeta multicanal, misture as amostras na primeira fileira e mova 50 μL de meio contendo soro da linha A para a linha B. Repita esse processo até a última linha (Figura 3). Descarte os 50 μL restantes.</li>
	<li>Descongelar o número necessário de alíquotas dos PVs e diluir para ≥ 104 RLU/mL. Adicionar 50 μL do meio PV diluído a cada poço (da coluna 1 à coluna 11) utilizando uma pipeta multicanal para atingir uma diluição de 1:1 de soro/plasma inactivado pelo calor para vírus. Incubar a 37 °C e 5% CO2, por 1 h para permitir que os anticorpos nas amostras de soro se liguem à proteína spike do SARS-CoV-2 nos PVs.</li>
	<li>Preparar pelo menos 5 ml de suspensão de células suscetíveis (HEK293T/ACE2) a uma densidade celular de 4 x 105 células/ml. Adicionar 50 μL da suspensão celular a cada poço e incubar a 37 °C e 5% CO2, durante 48 h.</li>
	<li>Após a incubação, realizar a leitura do ensaio de luciferase de acordo com as instruções do fabricante, conforme descrito no passo 2.7. NOTA: O luminômetro usado para leitura de luciferase produzirá um arquivo de planilha (neste caso, .xlsx) com os dados brutos e não processados que serão usados para análise a jusante (o arquivo de ensaio Luciferase).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig03.jpg"> Figura 3: Representação da placa com base na diluição do soro. O vermelho vivo corresponde a uma maior quantidade de soro, e a faixa azul brilhante (coluna 11) corresponde ao controle de células infectadas (CV, controle do vírus). A faixa azul clara (coluna 12) corresponde a células não infectadas (CC, controle celular). Esta figura foi criada com o BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
4. Análise de titulação
<ol><li>No arquivo de ensaio Luciferase, atribua os nomes/títulos às amostras correspondentes.</li>
	<li>Multiplique a medida de RLU pelos fatores de diluição (de cima para baixo da grade: 20x, 40x, 80x, 160x, 320x, 640x, 1.280x, 2.560x) para obter RLU/mL. Se forem utilizados diferentes factores de diluição, altere os factores de multiplicação em conformidade.</li>
	<li>Calcular a RLU/mL média para cada preparação fotovoltaica.</li>
</ol>5. Análise do ensaio de neutralização de PVs
<ol><li>No arquivo de planilha do ensaio Luciferase (neste caso, .xlsx), atribua os títulos correspondentes às amostras testadas. Insira o fator de diluição da amostra (40s, 80x, 160x, 320x, 640x, 1.280x, 2.560x, 5.120x). Calcular o Log10 dos fatores de diluição.</li>
	<li>Calcular a RLU média dos controles não infectados e infectados (Figura 3, colunas 11 e 12, respectivamente). Esses valores serão úteis para a normalização na etapa 5.5.</li>
	<li>Abra um novo documento para análise de dados. Selecione Análise X/Y, insira X como Números e Y como Insira 2 valores de replicação em subcolunas lado a lado.</li>
	<li>Insira os valores Log10 (diluição) como números X. Insira a RLU duplicada das amostras.</li>
	<li>Vá para Analisar &gt; Normalizar &gt; Sinalizar todas as amostras na mesma folha. Insira os valores médios de VC e CC em Como é definido 0%?, e Como é definido 100%?, respectivamente. Clique em OK.</li>
	<li>Na folha de dados normalizada, vá para Analisar análises &gt; XY &gt; Análises não lineares (ajuste de curva). Sinalize todos os exemplos e clique em OK. Para a Dose-resposta - Inibição, selecione log(inibidor) vs resposta normalizada - inclinação variável.</li>
	<li>Em Constrain, altere HillSlope para Must menor que 0.</li>
	<li>Em Saída, sinalize Criar tabela e gráfico de resumo. Clique em OK para obter as análises finais. Uma folha de trabalho com um modelo para a análise é fornecida no Arquivo Suplementar 1.</li>
</ol>

Avaliação da neutralização sérica contra SARS-CoV-2 com vírus pseudotipados

<ol><li>Ozaki, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+technology+transfer+of+a+GCLP-compliant+HIV-1+neutralizing+antibody+assay+for+human+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials.</a> Plos One. 7 (1), e30963(2012).</li>
<li>Pouget, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+liposomes+to+study+the+effect+of+Mycobacterium+tuberculosis+lipids+on+HIV-1+cis-+and+trans-infections%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945(2021).</li>
<li>McKay, L. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HCV+envelope+glycoprotein+down-modulates+NF-%CE%BAB+signalling+and+associates+with+stimulation+of+the+host+endoplasmic+reticulum+stress+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-κB signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831695(2022).</li>
<li>Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+pseudovirus+system+in+the+development+of+vaccine%2C+antiviral-drugs%2C+and+neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies.</a> Microbiological Research. 258, 126993(2022).</li>
<li>Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+on+the+development+of+pseudoviruses+for+enveloped+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses.</a> Reviews in Medical Virology. 28, e1963(2018).</li>
<li>D'Apice, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+neutralizing+activity+against+SARS-CoV-2+Wuhan-Hu-1+strain+and+variants+of+concern%3A+Performance+evaluation+of+a+pseudovirus-based+neutralization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay.</a> Frontiers in Immunology. 13, 981693(2022).</li>
<li>Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+reporter-expressing+mononegaviruses%3A+current+challenges+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives.</a> Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).</li>
<li>Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -L., Verhoeyen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+pseudotypes%3A+Precious+tools+to+improve+gene+modification+of+hematopoietic+cells+for+research+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy.</a> Viruses. 12, 1016(2020).</li>
<li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li>
<li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
<li>Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fourth+generation+lentiviral+Vector%3A+Simplifying+genomic+gymnastics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics.</a> Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).</li>
<li>Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+pseudovirus-luciferase+assay+for+rapid+and+quantitative+detection+of+neutralizing+antibodies+against+Enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71.</a> Plos One. 8 (6), e64116(2013).</li>
<li>Ferrara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+lentiviral+vectors+pseudotyped+with+Influenza+B+hemagglutinins%3A+application+in+vaccine+immunogenicity%2C+mAb+potency%2C+and+sero-surveillance+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies.</a> Frontiers in Immunology. 12, 661379(2021).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell-based+pseudovirus+entry+assay+to+identify+potential+viral+entry+inhibitors+and+neutralizing+antibodies+against+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2.</a> Genes & Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).</li>
<li>Dalle Carbonare, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serology+study+after+BTN162b2+vaccination+in+participants+previously+infected+with+SARS-CoV-2+in+two+different+waves+versus+na%C3%AFve%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Medicine%22%5BJournal%5D)">Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus naïve.</a> Communications Medicine. 1 (1), 38(2021).</li>
<li>Di Genova, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+titration%2C+neutralisation%2C+storage+and+lyophilisation+of+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2+%28SARS-CoV-2%29+lentiviral+pseudotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes.</a> Bio-protocol. 11 (21), e4236(2021).</li>
<li>Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bieńkowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+against+SARS-CoV-2+variants%3A+The+role+of+neutralization+assays%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+optimization+of+a+sensitive+pseudovirus-based+assay+for+HIV-1+neutralizing+antibodies+detection+using+A3R5+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).</li>
<li>Gauger, P. C., Vincent, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+virus+neutralization+assay+for+detection+and+quantitation+of+serum+neutralizing+antibodies+to+influenza+A+virus+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).</li>
<li>Miglietta, R., Pastori, C., Venuti, A., Ochsenbauer, C., Lopalco, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+in+monoclonal+antibody+neutralization+of+HIV-1+pseudoviruses+and+infectious+molecular+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Synergy in monoclonal antibody neutralization of HIV-1 pseudoviruses and infectious molecular clones.</a> Journal of Translational Medicine. 12 (1), 346(2014).</li>
<li>Chen, M., Zhang, X. -E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+applications+of+SARS-CoV-2+pseudoviruses%3A+A+mini+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review.</a> International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).</li>
<li>Zipeto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+immunodeficiency+virus+neutralizing+antibodies+using+fusion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes.</a> Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).</li>
<li>WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , https://covid19.who.int (2022).</li>
<li>Zhou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pneumonia+outbreak+associated+with+a+new+coronavirus+of+probable+bat+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin.</a> Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).</li>
<li>Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+vaccination+on+the+COVID-19+pandemic+in+U.S.+states%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1554(2022).</li>
<li>Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+SARS-CoV-2+Co-Infection%3A+From+Population+Study+Evidence+to+In+Vitro+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Life%22%5BJournal%5D)">HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies.</a> Life. 12 (12), 2089(2022).</li>
<li>Watson, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+impact+of+the+first+year+of+COVID-19+vaccination%3A+a+mathematical+modelling+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).</li>
<li>Cantoni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antibody+neutralisation+activity+against+SARS-CoV-2+variants+and+seasonal+human+coronaviruses+NL63%2C+HKU1%2C+and+229E+induced+by+three+different+COVID-19+vaccine+olatforms%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms.</a> Vaccines. 11 (1), 58(2023).</li>
<li>Siracusano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+decay+of+antibody+response+and+VOC+sensitivity+in+na%C3%AFve+and+previously+infected+subjects+at+15+weeks+following+vaccination+with+BNT162b2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Different decay of antibody response and VOC sensitivity in naïve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22(2022).</li>
<li>Ruggiero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+vaccination+elicits+unconventional+IgM+specific+responses+in+na%C3%AFve+and+previously+COVID-19-infected+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22eBioMedicine%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in naïve and previously COVID-19-infected individuals.</a> eBioMedicine. 77, (2022).</li>
<li>Piubelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subjects+who+developed+SARS-CoV-2+specific+IgM+after+vaccination+show+a+longer+humoral+immunity+and+a+lower+frequency+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22eBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection.</a> eBioMedicine. 89, 104471(2023).</li>
<li>Zhang, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+pseudotyped+SARS-CoV-2+variants+of+concern+in+different+human+cell+types+and+inhibitory+effects+of+recombinant+spike+protein+and+entry-related+cellular+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors.</a> Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437(2023).</li>
<li>da Costa, K. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+%28N1-N9%29+and+Influenza+B+%28B%2FVictoria+and+B%2FYamagata%29+neuraminidase+pseudotypes+as+tools+for+pandemic+preparedness+and+improved+influenza+vaccine+design%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design.</a> Vaccines. 10 (9), 1520(2022).</li>
<li>Condor Capcha, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+SARS-CoV-2+spike+pseudotyped+virus+for+viral+entry+and+neutralization+assays%3A+a+1-week+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651(2021).</li>
<li>Diomede, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+inhibition+of+a+pseudotyped+virus+transduction+does+not+translate+to+inhibition+of+SARS-CoV-2+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity.</a> Viruses. 13 (9), 1745(2021).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Embora o uso de um vírus selvagem simule a infecção real, os PVs lentivirais são uma opção mais segura para estudar os mecanismos associados à entrada e infecção viral sem os rígidos requisitos de segurança necessários para trabalhar com vírus patogênicos 4,20,21. Os PVs são compostos por um núcleo viral defeituoso de replicação circundado pela glicoproteína do envelope de superfície de um vírus patogênico, que é o objetivo do e...

Vírus pseudotipados (PVs) são ferramentas moleculares utilizadas em microbiologia para estudar interações vírus-hospedeiro e patógeno-patógeno 1,2,3,4. Os PVs consistem em uma parte interna, o núcleo viral que protege o genoma viral, e uma parte externa, as glicoproteínas do envelope na superfície do vírus que definem o tropismo5. Um pseudovírus é incompetente em replicação na célula-alvo porque não contém toda a informação genética para gerar novas partículas virais. Essa combinação de características peculiares torna os PVs uma alternativa segura a um vírus selvagem. Os vírus selvagens, por outro lado, são altamente patogênicos e não podem ser usados em laboratórios BSL 2 para análise6.
A infectividade dos PVs pode ser monitorada por um gene repórter, geralmente codificando para uma proteína fluorescente (GFP, RFP, YFP) ou uma enzima que produz produtos quimioluminescentes (luciferase). Este está contido em um dos plasmídeos utilizados para a produção de PV e incorporado ao genoma do pseudovírus7.
Vários tipos de núcleos fotovoltaicos existem atualmente, incluindo partículas derivadas de lentivirais baseadas no genoma do HIV-1. A grande vantagem dos PVs baseados no HIV-1 sobre outras plataformas é o seu processo intrínseco de integração no genoma da célula-alvo8. Embora o HIV-1 seja um vírus altamente contagioso e seja o agente causador da AIDS, esses vetores lentivirais são seguros de usar devido às extensas etapas de otimização ao longo dos anos. Condições ótimas de segurança foram alcançadas com a introdução de vetores lentivirais de2ª geração, nos quais os genes virais foram esgotados sem influenciar a capacidade de transdução9. A3ª e4ª gerações contribuíram para o aumento da segurança do manuseio do vetor lentiviral com a divisão posterior do genoma viral em plasmídeos separados10,11. As últimas gerações de PVs são geralmente empregadas para produzir vetores lentivirais para terapia gênica.
Os PVs podem ser usados para estudar interações entre vírus e células hospedeiras, tanto durante a fase de produção quanto na de infecção. Os PVs são especialmente empregados em ensaios de neutralização de pseudovírus (PVNA). Os PVNAs são amplamente validados para avaliar o potencial de neutralização do soro ou plasma visando a glicoproteína viral no envelope do PV12,13. A atividade de neutralização, expressa como a concentração inibitória 50 (IC50), é definida como a diluição do soro/plasma que bloqueia 50% da entrada da partícula viral14. Neste protocolo, descrevemos a configuração de um PVNA para testar a atividade do anticorpo contra a Síndrome Respiratória Aguda Grave - Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) em soros coletados antes e depois de receber uma dose de vacina de reforço.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; filtro m</td><td>SARSTEDT</td><td>83 1826</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 poços</td><td>SARSTEDT</td><td>83 3920</td><td></td></tr><tr><td>placa de 96 poços</td><td>SARSTEDT</td><td>8,33,924</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15</td><td>Merck</td><td>10403892</td><td></td></tr><tr><td>Preto Opaco Microplaca de 96 poços</td><td>Perkin Elmer 60005270</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D6546 - 500ML</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS 1x)</td><td>AUROGENE</td><td>AU-L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>AUROGENE</td><td>AU-S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism versão 7</td><td>graphpad dotmatics</td><td>NA</td><td>No manuscrito, substituímos o nome comercial por 'programa de análise de dados'HEK293T</td></tr> <tr><td>células</td><td>ATCC</td><td>Células CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T/ACE2</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>HEK293T foi transduzido para superexpressar ACE2 com um vetor lentiviral.</td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>AUROGENE</td><td>AU-X0550-100</td><td></td></tr><tr><td>Luminômetro - Victor3</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH35000500</td><td>No manuscrito, substituímos o nome comercial por&nbsp; 'luminômetro'&nbsp;</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td>No manuscrito, substituímos o nome comercial por 'meio de soro reduzido'&nbsp;</td></tr><tr><td>p8.91 plasmídeo de embalagem</td><td>Di Genova et al., 2021</td><td></td><td>Um gentil presente do Prof. Nigel Temperton (ref 16.)</td></tr><tr><td>plasmídeo repórter pCSFLW</td><td>Di Genova et al., 2021</td><td></td><td>Um gentil presente do Prof. Nigel Temperton (ref 16.)</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>AUROGENE</td><td>AU-L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina ramificada (PEI) (25 kDa)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)</td><td>Addgene</td><td>145839</td><td>Este plasmídeo foi usado para gerar HEK293Tcells/ACE2</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 Spike expressando plasmídeo</td><td>Addgene</td><td>pGBW-m4137382</td><td></td></tr><tr><td>steadylite plus Sistema de ensaio de gene repórter</td><td>Perkin Elmer</td><td>6066759</td><td>No manuscrito, substituímos o nome comercial por 'reagente de leitura de luciferase'Tripsina</td></tr> <tr><td>EDTA 1x</td><td>AUROGENE</td><td>AU-L0949-100</td><td></td></tr></tbody></table>

vírus pseudotipados como uma ferramenta molecular para monitorar respostas imunes humorais contra sars-cov-2 via ensaio de neutralização

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Vírus pseudotipados (PVs) são ferramentas moleculares que podem ser usadas para estudar interações vírus-hospedeiro e testar a capacidade neutralizante de amostras de soro, além de seu uso mais conhecido em terapia gênica para a entrega de um gene de interesse. Os PVs são defeituosos de replicação porque o genoma viral é dividido em diferentes plasmídeos que não são incorporados aos PVs. Este sistema seguro e versátil permite o uso de PVs em laboratórios de nível 2 de biossegurança. Aqui, apresentamos uma metodologia geral para produzir PVs lentivirais baseada em três plasmídeos como mencionado aqui: (1) o plasmídeo da espinha dorsal que carrega o gene repórter necessário para monitorar a infecção; (2) o plasmídeo de embalagem que carrega os genes de todas as proteínas estruturais necessárias para gerar os PVs; (3) plasmídeo de expressão de glicoproteínas na superfície do envelope que determina o tropismo viral e medeia a entrada viral na célula hospedeira. Neste trabalho, a Spike de SARS-CoV-2 é a glicoproteína do envelope usada para a produção de lentivírus pseudotipados SARS-CoV-2 não replicativos.
Resumidamente, as células de embalagem (HEK293T) foram co-transfectadas com os três diferentes plasmídeos usando métodos padrão. Após 48 h, o sobrenadante contendo as VVPP foi colhido, filtrado e armazenado a -80 °C. A infectividade dos PVs SARS-CoV-2 foi testada estudando a expressão do gene repórter (luciferase) em uma linhagem celular alvo 48 h após a infecção. Quanto maior o valor das unidades de luminescência relativa (RLUs), maior a taxa de infecção/transdução. Além disso, os PVs infecciosos foram adicionados às amostras de soro diluídas em série para estudar o processo de neutralização da entrada de pseudovírus nas células-alvo, medido como a redução na intensidade da RLU: valores mais baixos correspondentes à alta atividade neutralizante.

Este protocolo descreve a produção de PVs SARS-CoV-2 e uma aplicação a jusante destes PVs para analisar a actividade da neutralização do soro/plasma dos indivíduos que recebem a vacinação anti-COVID-1917. Além disso, este protocolo pode ser aplicado para produzir pseudotipos de cada variante de preocupação SARS-CoV-2 (VOC) para testar a evolução da resposta neutralizante. Apesar desse protocolo facilitar o estudo da resposta imune humoral após a vacinação contra a COVID-19, ele pode ser adaptado p...

Vírus pseudotipados (PVs) são virions defeituosos de replicação que são usados para estudar interações vírus-hospedeiro em condições mais seguras do que manusear vírus autênticos. Apresentado aqui é um protocolo detalhado que mostra como os PVs SARS-CoV-2 podem ser usados para testar a capacidade de neutralização do soro dos pacientes após a vacinação COVID-19.

Vírus pseudotipados como uma ferramenta molecular para monitorar respostas imunes humorais contra SARS-CoV-2 via ensaio de neutralização

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Vírus pseudotipados são ferramentas moleculares que podem ser usadas para estudar interações vírus-hospedeiro e testar a atividade neutralizante de amostras de soro. No trabalho que apresentamos hoje, será apresentada uma metodologia geral para produção de vírus pseudotipados, baseada em plasmídeo livre. Para ensaios de neutralização, vírus do tipo Y são geralmente usados, mas são altamente patogênicos e não podem ser manuseados em laboratórios BSL-2, tornando este sistema puramente aplicável em larga escala.A tecnologia de pseudovírus pode ser uma alternativa mais segura em comparação com vírus vivos para permitir o estudo da interação patógeno com o hospedeiro e testar a atividade neutralizante de anticorpos. Experimentos futuros investigarão o papel de anticorpos específicos na manutenção da imunidade após a vacinação utilizando a tecnologia de pseudovírus.

pseudotyped-viruses-as-molecular-tool-to-monitor-humoral-immune

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo mostra um ensaio de neutralização que mede a eficácia do soro na neutralização do vírus SARS-CoV-2. Envolve vírus pseudotipados, diluição do soro e quantificação baseada em luminescência, revelando o título de neutralização.

Avaliação de anticorpos neutralizantes funcionais contra SARS-CoV-2

O protocolo descrito aqui descreve um método rápido e eficaz para medir anticorpos neutralizantes contra a proteína de pico SARS-CoV-2, avaliando a capacidade de amostras de soro convalescente para inibir a infecção por um vírus de estomatite vesicular rotulado por proteína verde aumentada com pseudotipto de glicoproteína.

Detecção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 usando imagens fluorescentes de alto rendimento da infecção por pseudovírus

Este protocolo descreve a aplicação de um pseudovirus híbrido novo alphavirus-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) como uma plataforma para a quantificação rápida da infecciosidade das variantes SARS-CoV-2 e sua sensibilidade aos anticorpos neutralizantes.

Aplicação do pseudovírus Ha-CoV-2 para quantificação rápida de variantes do SARS-CoV-2 e anticorpos neutralizantes

Este artigo descreve a metodologia para gerar partículas pseudotipadas de SARS-CoV-2 usando um sistema repórter de luciferase e seu uso para identificar inibidores de entrada. Esses protocolos são demonstrados usando dois diferentes inibidores de entrada, uma proteína de fusão humana recombinante ACE2-Fc e o composto de pequenas moléculas arbidol.

Procedimentos para a Identificação de Inibidores de Entrada do SARS-CoV-2 como Potenciais Antivirais Utilizando Pseudovírus Baseados em MLV

Identificação de alvos microbiana da imunidade adaptativa em doenças idiopática pode ser realizado através da utilização do ensaio immunospot enzyme-linked.

Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Quantificação de Th-1 respostas imunes celulares contra antígenos microbianos

Tregs são potentes supressores do sistema imune. Há uma falta de marcadores de superfície única para defini-los, portanto, definições de Tregs são principalmente funcionais. Aqui nós descrevemos um...

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Um Ensaio visual para o Monitor T6SS mediada Competição bacteriana

Descreve-se um ensaio rápido, com base molecular da gripe A e B. O ensaio detecta Influenza cada alvo dentro de 15 min, utilizando amplificação isotérmica com iniciadores específicos de influenza, seguido de detecção do alvo com as sondas farol molecular. O ensaio de Influenza A e B é de fácil utilização e necessário hands-on tempo mínimo para executar.

Rápida Detecção Molecular e diferenciação de Influenza vírus A e B

Este estudo descreve uma   -Imagem baseada ensaio de micro-neutralização para analisar as relações antigênicas entre vírus. O protocolo emprega um digitalizador de mesa e tem quatro passos, incluindo titulação, a quantificação de titulação, neutralização, e quantificação de neutralização. O ensaio funciona bem com pdm09 corrente circulante vírus influenza A (H1N1), A (H3N2), e B vírus.

Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

Este ensaio de matança de opsonophagocytic é usado para comparar a capacidade de células fagocíticas de imunes a responder e matar as bactérias com base em diferentes tratamentos e/ou condições. Classicamente, este ensaio serve como o padrão ouro para avaliar funções efetoras dos anticorpos produzidos contra uma bactéria como opsoninas.

Ensaio de matar Opsonophagocytic para avaliar as respostas imunológicas contra patógenos bacterianos

Aprenda a produzir vírus pseudotipados de SARS-CoV-2 usando sistema de três plasmídeos em células HEK 293T. Este método seguro em nível BSL-2 permite avaliar anticorpos neutralizantes em amostras de soro pós-vacinação.

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Vírus pseudotipados como uma ferramenta molecular para monitorar respostas imunes humorais contra SARS-CoV-2 via ensaio de neutralização

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