Name: Detecção do vírus SARS-CoV-2 por amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T13:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Aprenda a detectar o vírus SARS-CoV-2 usando amplificação isotérmica RT-LAMP em 60 minutos com equipamentos de baixo custo. Este método padronizado permite diagnóstico rápido e acessível em configurações de atenção primária.

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Este trabalho foi financiado pelo Sistema General de Regalías da Colômbia, número de processo BPIN 2020000100092, e Universidad Icesi - Convocatoria Interna, número de processo CA0413119. O MFVT também foi financiado pelos Fundos de Professor Assistente da Universidad de los Andes. As entidades financiadoras não participaram da concepção, execução das atividades, coleta de dados e análise e preparação dos dados do manuscrito. Agradecemos ao Hospital Universitário Fundación Valle del Lili pelo RNA viral das amostras de Sars-CoV-2 e ao Dr. Alvaro Barrera-Ocampo pelos comentários sobre o manuscrito.

As amostras utilizadas foram fornecidas pelo laboratório clínico do Hospital Universitário Fundación Valle del Lili e corresponderam ao RNA purificado de pacientes que testaram positivo para COVID-19 usando a técnica de RT-qPCR. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para a pesquisa, e este estudo foi aprovado pelo comitê de bioética para estudos em seres humanos do Hospital Universitário Fundación Valle del Lili.
1. Projeto e preparação do primer RT-LAMP
NOTA: Os primers LAMP podem ser usados com uma variedade de plataformas, incluindo LAMP da New England BioLabs (NEB), Primer Explorer e análise versátil de ensaio LAMP (LAVA). No entanto, para este protocolo, foi utilizada a ferramenta NEB LAMP. O design do primer pode ser feito usando genomas SARS-CoV-2 obtidos do banco de dados NextStrain10. A Tabela 1 mostra o conjunto de primers utilizado neste protocolo.
<ol><li>Design de primer para LAMP<ol><li>Obtenha sequências do genoma viral.</li>
		<li>Execute alinhamentos de sequência para obter a sequência de consenso.</li>
		<li>Navegue até a plataforma de ferramentas de design de primer NEB LAMP11 e siga as instruções no guia rápido. Esta ferramenta produz os mesmos resultados que o primer explorer V5, mas é muito mais fácil de usar em sua saída. Use os manuais do usuário do primer explorer como um guia para o design do primer.</li>
	</ol></li>
	<li>Avaliação termodinâmica do conjunto de primers<ol><li>Use a ferramenta Primer-Dimer12 para realizar uma análise termodinâmica nos primers obtidos.</li>
		<li>Coloque as sequências de primer na ferramenta. Em seguida, selecione a opção Análise Multiplex e Relatório de Estrutura de Dímero.</li>
		<li>Selecione os conjuntos de primers que tenham ΔG não inferior a -5.</li>
	</ol></li>
	<li>Avaliação da especificidade dos primers projetados<ol><li>Use o banco de dados de coleta de nucleotídeos (nt/nt) no BLAST13 para analisar cada primer.</li>
		<li>Para realizar a primeira análise BLAST, selecione a Base de Dados Refseq_rna e filtre a busca com o grupo de gêneros que pertencem à subfamília Orthocoronavirinae. Eles são Alphacoronavirus (taxid:693996), Gammacoronavirus (taxid:694013) e Deltacoronavirus (taxid:1159901). Além disso, avalie a sequência contra outros vírus que estão co-circulando como subtipo H1N1 (taxid:114727), vírus Influenza A (taxid:11320) e vírus Influenza B (taxid:11520).</li>
		<li>Para realizar a segunda análise BLAST, selecione o Betacoronavirus GenBank e filtre a pesquisa com Coronaviridae (taxid:11118) e SARS (taxid:694009). Esses grupos contêm sequências de todos os genomas identificados do SARS Coronavirus, incluindo genomas encontrados em morcegos, Betacoronavirus (taxid:694002).</li>
		<li>Para este protocolo, certifique-se de que os primers não estejam alinhados com genomas diferentes do genoma alvo, SARS-CoV-2.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de primer<ol><li>Gire os frascos contendo os primers iofilizados com uma microcentrífuga (10.000 x g, 1 min à temperatura ambiente [RT]) para evitar perdas durante a abertura do tubo.</li>
		<li>Reidrate o pó iofilizado em água com 0,1% de dietilpirocarbonato (DEPC) ou água livre de nuclease até uma concentração final de 100 μM (Tabela 2) e dissolva completamente pipetando para cima e para baixo. Em seguida, gire na velocidade máxima (10.000 x g, 1 min em RT) em uma microcentrífuga para coletar todas as soluções de primer no fundo do tubo.</li>
		<li>Prepare a mistura de primer 10x em um gabinete de biossegurança com o primer interno dianteiro (FIP), primer interno reverso (BIP), primer externo dianteiro (F3), primer externo reverso (B3), loop backward (LB) e loop forward (LF), conforme relatado na Tabela 2. Para evitar perdas, pipete ou vórtice suavemente a solução de primer antes de realizar uma centrifugação rápida (10.000 x g, 1 min em RT) com uma microcentrífuga.</li>
		<li>Armazene a mistura de primer 10x a -20 °C para armazenamento de longo prazo; no entanto, prepare-se o suficiente para um máximo de cinco experimentos, independentemente de várias amostras, para evitar muitos ciclos de congelamento e descongelamento. NOTA Se for necessário um volume menor da mistura de primer, ajuste os valores calculando os novos volumes (Tabela 2). Além disso, os conjuntos RdRp e RdRp/Hel não incluem o primer LF porque os primers de alça não são necessários para reações RT-LAMP. Como resultado, substitua o volume do primer LF por água livre de nuclease ou água DEPC a 0,1%.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Reação RT-LAMP
<ol><li>Ligue o gabinete de fluxo laminar de acordo com as instruções do fabricante e aguarde pelo menos 3 minutos para que o fluxo de ar se estabilize.</li>
	<li>Quando o fluxo de ar estiver estável, limpe e higienize as superfícies internas do gabinete usando uma técnica asséptica. Para isso, use os seguintes desinfetantes nesta ordem: 1000 ppm de amônio quaternário (cloreto de benzalcônio), 2% de hipoclorito, 3% de peróxido de hidrogênio e 70% de etanol. NOTA: Neste caso, a técnica asséptica consiste em aplicar o desinfetante e removê-lo com guardanapos de dentro da cabine para o exterior sem passar por cima de superfícies previamente limpas.</li>
	<li>Usando os desinfetantes da etapa 2.2, limpe os materiais que entrarão na cabine na mesma ordem. NOTA: Micropipetas, caixas de pontas de filtro, frascos com tubos de 1.5 mL e 0.6 mL, tubos de PCR de 0.2 mL, racks e um copo de 400 mL devem ser trazidos para o gabinete.</li>
	<li>Traga alguns guardanapos e luvas de nitrilo para a cabine. Depois disso, desligue o gabinete e exponha-o à luz ultravioleta (UV) por 15 min. CUIDADO: Para evitar danos aos tecidos e ao DNA devido à exposição prolongada à radiação, evite a luz ultravioleta até que o tempo definido na etapa 2.4 expire. NOTA Execute a montagem mostrada na Figura 2 antes de iniciar o protocolo e inicie o banho-maria após concluir a etapa 2.4. É crucial encher o recipiente de metal quase até a borda com água potável e ajustar a temperatura da placa de aquecimento do laboratório de ferro para 90 °C, pois isso resultará em uma temperatura de ~66,3 °C no sistema, que é monitorada com o termômetro de mercúrio.</li>
	<li>Após o término do período de irradiação, reinicie o gabinete e siga as recomendações da etapa 1.1.</li>
	<li>Coloque os reagentes (Tabela 3, Tabela 4 e Tabela 5) em um refrigerador cheio de gelo ou em uma pequena geladeira de poliestireno. Coloque o recipiente dentro do gabinete após limpá-lo com etanol 70%.</li>
	<li>Em um tubo de microcentrífuga de 0,6 mL, prepare a mistura LAMP do gene a ser amplificado (RdRp, N-A e RdRp/Hel), adicionando apenas os seguintes componentes: 10x Tampão, MgSO4, dNTPs, 1x mistura de primers e água livre de nuclease ou 0,1% de água DEPC; misture bem pipetando para homogeneizar. CUIDADO: Devido ao manuseio e comportamento inadequados dentro do gabinete, há um alto risco de contaminação do reagente. As seguintes regras devem ser seguidas para mitigar esse problema: (i) usar pontas estéreis e filtrantes; ii) utilizar uma ponta para cada reagente; iii) Deslocar-se lenta e cuidadosamente para evitar perturbar o fluxo laminar; (iv) manter a ordem e usar o menor número de materiais; e (v) usar luvas diferentes para preparar a mistura e adicionar o material genético. NOTA: Mantenha todos os reagentes, especialmente enzimas, no gelo, pois as mudanças de temperatura podem desnaturá-los e alterar a atividade da polimerase.</li>
	<li>Coloque o(s) tubo(s) de 0,6 ml com a tampa fechada num bloco de aquecimento e incube a 95 °C durante 5 min. NOTA: Ligue o bloco de aquecimento para tubos de 1.5-2.0 mL localizados fora do gabinete por pelo menos 30 min antes de iniciar o LAMP preparação da mistura e monitore a temperatura (95 °C) com um termômetro de mercúrio ou álcool.</li>
	<li>Quando a incubação estiver concluída, coloque os tubos em um refrigerador de poliestireno cheio de gelo por 5 min.</li>
	<li>Retorne os tubos ao gabinete de fluxo laminar e conclua a preparação da mistura LAMP adicionando as enzimas DNA polimerase (Bst 3.0), transcriptase reversa e DNA polimerase de alta fidelidade (Tabela 3, Tabela 4 e Tabela 5). No caso de usar a detecção colorimétrica, adicione o corante azul de hidroxinaftol (HNB).</li>
	<li>Depois de adicionar esses reagentes, misture muito bem os reagentes LAMP, pipetando-os para solubilizar as enzimas e o corante.</li>
	<li>Encha cada tubo de PCR com 22,0 μL da mistura, tomando cuidado para não criar bolhas. Em seguida, adicione 3,0 μL de água a 0,1% de DEPC ou água livre de nuclease ao controle negativo ou ao controle de tubo sem modelo (NTC) e reserve o (s) tubo (s) restante (s) para a adição (material genético). NOTA: Mantenha os tubos de PCR em um refrigerador cheio de gelo até que a amostra seja adicionada para evitar a ativação da enzima Bst 3.0 e iniciar a reação prematuramente.</li>
	<li>Remova todos os materiais do gabinete e use etanol 70% para limpar as superfícies. Em seguida, desligue-o seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Em uma área separada, adicione 3 μL da amostra a cada tubo de PCR e homogeneize-o completamente. Use uma micropipeta de 20 μL e pontas de filtro para fazer isso. CUIDADO: A micropipeta usada para adicionar o material genético deve ser usada exclusivamente para esse fim e não pode ser usada para preparar a mistura. Desta forma, evita-se a contaminação dos reagentes. Além disso, mantenha amostras de RNA no gelo o tempo todo para reduzir a possibilidade de degradação do RNA. Use o seguinte equipamento de proteção individual (EPI) para a adição da amostra: avental descartável, boné, máscara N95, leggings, óculos de laboratório e luvas de nitrilo.</li>
	<li>Antes de realizar a reação colorimétrica, tire fotos dos tubos de PCR com uma câmera de alta qualidade. A cor inicial com HNB é violeta.</li>
	<li>Realizar a reação no seguinte sistema ou equipamento: (i) termociclador e (ii) banho-maria.<ol><li>Termociclador: Deposite os tubos no bloco de reação e configure o termoperfil (ver Tabela 6) no equipamento.</li>
		<li>Banho-maria: Deposite os tubos em recipientes circulares e ajuste-os muito bem para evitar que saiam. Em seguida, coloque os recipientes no banho-maria (Figura 2A, B) na temperatura listada na Tabela 6.</li>
	</ol></li>
	<li>No caso do banho-maria, uma vez que os tubos estejam dentro do sistema, inicie o cronômetro por 60 min (Tabela 6).</li>
	<li>Remova os tubos do termociclador ou banho-maria após o tempo de reação e armazene-os a 4 ° C para a corrida eletroforética ou a -20 ° C até o uso.</li>
	<li>Se uma reação colorimétrica foi realizada, tire fotos dos tubos de PCR usando uma câmera de alta qualidade. A cor final com HNB é azul celeste.</li>
</ol>3. Análise de produtos de amplificação em gel de agarose
NOTA: Essas etapas são sugeridas como verificações adicionais para a reação colorimétrica ou controle de desempenho durante a etapa de padronização. Isso ocorre porque a técnica pode apresentar um enorme risco de contaminação para o laboratório que faz esses testes.
<ol><li>Coloque o leito dentro da câmara de eletroforese de forma que as borrachas da borda toquem as paredes, criando um espaço vedado para a adição de agarose (câmara interna) (Figura 3A, B).</li>
	<li>Depois de concluir a etapa 3.1, pesar a quantidade necessária de agarose em um béquer de 500 mL para obter um gel a 2%. Depois disso, adicione o volume necessário de tampão EDTA de trisacetato (TAE) 0,5x e leve ao microondas por 1-2 min. NOTA: A agarose é completamente derretida quando é translúcida e sem grumos quando removida do forno. Se isso não for confirmado, regiões mal gelificadas podem permanecer, fazendo com que a corrida eletroforética e a visualização dos produtos de amplificação sejam alteradas.</li>
	<li>Retirar o copo da estufa e deitar a agarose na câmara interna criada no passo 3.1 (figura 3C). Em seguida, verifique se não há bolhas e, se houver, remova-as usando uma ponta de micropipeta.</li>
	<li>Disponha o pente para formar os poços e deixe a agarose gelificar por cerca de 30 min em temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Após este tempo, adicione 5 mL de tampão TAE 0,5x para facilitar a remoção dos favos e do leito contendo o gel. Em seguida, posicione o gel de forma que os poços fiquem no ânodo (Figura 3D).</li>
	<li>Encha a câmara de eletroforese com tampão TAE 0.5x até a capacidade especificada pelo fabricante, garantindo que os eletrodos estejam em contato com o tampão.</li>
	<li>Adicione 3 μL de marcador de peso molecular ao primeiro poço do gel e adicione 9 μL de NTC e cada amostra aos seguintes poços. Faça-os combinando 7 μL do produto de amplificação com 3 μL de tampão de carga; em seguida, carregue 9 μL dessa mistura nos poços do gel.</li>
	<li>Cubra a câmara de eletroforese com a tampa e conecte os cabos às portas de alimentação no padrão de cores. Defina a fonte de alimentação para os seguintes parâmetros: 100 V e amperagem constante por 120 min.</li>
	<li>Após a conclusão da corrida eletroforética, coloque o gel no recipiente com a solução de coloração (brometo de etídio) e incube por 30 min.</li>
	<li>Após a incubação, remova o gel da solução de coloração e coloque-o em um saco zip-lock. Isso evita a contaminação do equipamento que será usado para visualizar os amplicons.</li>
	<li>Visualize o gel em um transiluminador ou gerador de imagens como o Amersham Imager 600.</li>
</ol>

Usando análise colorimétrica e RT-LAMP para detectar SARS-CoV-2 

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Who+coronavirus+%28COVID-19%29+dashboard+%28no+date%29%22">Who coronavirus (COVID-19) dashboard (no date)</a>. , https://covid19.who.int/ (2023).</li>
<li>Ibrahim, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiologic+surveillance+for+controlling+Covid-19+pandemic%3A+types%2C+challenges+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Epidemiologic surveillance for controlling Covid-19 pandemic: types, challenges and implications.</a> Journal of Infection and Public Health. 13 (11), 1630-1638 (2020).</li>
<li>Rojas-Gallardo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19+in+Latin+America%3A+Contrasting+phylodynamic+inference+with+epidemiological+surveillance.+%28Molecular+epidemiology+of+COVID-19+in+Latin+America%29%5BTitle%5D)+AND+%22medRxiv%22%5BJournal%5D)">COVID-19 in Latin America: Contrasting phylodynamic inference with epidemiological surveillance. (Molecular epidemiology of COVID-19 in Latin America).</a> medRxiv. , (2020).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+rate+of+RT-PCR+detection+of+SARS-CoV-2+infection+in+4880+cases+from+one+hospital+in+Wuhan%2C+China%2C+from+Jan+to+Feb+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Positive rate of RT-PCR detection of SARS-CoV-2 infection in 4880 cases from one hospital in Wuhan, China, from Jan to Feb 2020.</a> Clinica Chimica Acta. 505, 172-175 (2020).</li>
<li>Kevadiya, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostics+for+SARS-CoV-2+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Diagnostics for SARS-CoV-2 infections.</a> Nature Materials. 20 (5), 593-605 (2021).</li>
<li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).</li>
<li>Li, Y., Fan, P., Zhou, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+A+novel+rapid+detection+platform+for+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A novel rapid detection platform for pathogens.</a> Microbial Pathogenesis. 107, 54-61 (2017).</li>
<li>Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+principle%2C+features%2C+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects.</a> Journal of Microbiology. 53 (1), 1-5 (2015).</li>
<li>Augustine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+A+rapid%2C+sensitive%2C+specific%2C+and+cost-effective+point-of-care+test+for+coronaviruses+in+the+context+of+COVID-19+pandemic%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid, sensitive, specific, and cost-effective point-of-care test for coronaviruses in the context of COVID-19 pandemic.</a> Biology (Basel). 9 (8), 182(2020).</li>
<li>Nextstrain. , https://nextstrain.org/ (2023).</li>
<li>Biolabs, N.E. Neb Lamp, NEB LAMP. , https://lamp.neb.com/ (2023).</li>
<li>PrimerDimer. , http://www.primer-dimer.com/ (2023).</li>
<li>National Center for Biotechnology Information. Blast: Basic local alignment search tool (no date). , https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ (2023).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+molecular+detection+of+SARS-CoV-2+%28COVID-19%29+virus+RNA+using+colorimetric+LAMP%5BTitle%5D)+AND+%22medRxiv%22%5BJournal%5D)">Rapid molecular detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) virus RNA using colorimetric LAMP.</a> medRxiv. , (2020).</li>
<li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+method+for+rapid+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Virologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Development of a novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of SARS-CoV-2.</a> Virologica Sinica. 35 (3), 344-347 (2020).</li>
<li>Najafov, A., Hoxhaj, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNajafov%2C+A+%22PCR+Guru%22">PCR Guru</a>. , Elsevier, Academic Press. (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+speed+and+sensitivity+with+guanidine+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride.</a> Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).</li>
<li>Ramírez-Chavarría, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+analysis+of+isothermal+amplification+via+impedance+time-constant-domain+spectroscopy%3A+A+SARS-CoV-2+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosensors%22%5BJournal%5D)">Automatic analysis of isothermal amplification via impedance time-constant-domain spectroscopy: A SARS-CoV-2 case study.</a> Chemosensors. 11 (4), 230(2023).</li>
<li>Haque, M. F. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+RdRp-based+colorimetric+RT-LAMP+assay+for+rapid+and+sensitive+detection+of+SARS-CoV-2+in+clinical+and+sewage+samples+from+Pakistan%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">A novel RdRp-based colorimetric RT-LAMP assay for rapid and sensitive detection of SARS-CoV-2 in clinical and sewage samples from Pakistan.</a> Virus Research. 302, 198484(2021).</li>
<li>Donia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+RT-LAMP+and+microfluidic+technology+for+detection+of+SARS-CoV-2+in+wastewater+as+an+advanced+point-of-care+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Environmental+Virology%22%5BJournal%5D)">Integration of RT-LAMP and microfluidic technology for detection of SARS-CoV-2 in wastewater as an advanced point-of-care platform.</a> Food and Environmental Virology. 14, 364-373 (2022).</li>
</ol>

Natalia Campillo-Pedroza é CEO da empresa BioDx: Diagnóstico y Soluciones Biotecnológicas S.A.S. O restante dos autores declara não haver conflito de interesses.

Embora o RT-LAMP seja considerado uma metodologia complementar para a realização de diagnósticos moleculares, ele também apresenta algumas limitações e etapas críticas que devem ser consideradas quando o protocolo é padronizado e implementado.
A padronização LAMP para a detecção de SARS-CoV-2 avaliou os seguintes parâmetros e componentes no master mix: (a) concentração e temperatura de alinhamento dos primers; b) Concentração das enzimas; c) Concentração de magnésio; d) Tempo de reacção; e) In...

O coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) causa a doença do coronavírus 2019 (COVID-19). A Organização Mundial da Saúde declarou uma emergência de saúde pública de interesse internacional em 30 de janeiro de 2020 e uma pandemia em 11 de março de 2020. A pandemia resultou em mais de 760 milhões de casos e 6,87 milhões de mortes na data em que este artigo foi escrito1.
O impacto desse vírus destacou a necessidade de ferramentas de vigilância melhores, mais precisas, mais rápidas e mais amplamente disponíveis para melhorar a detecção e o controle de doenças infecciosas 2,3. Durante a pandemia, os testes diagnósticos de SARS-CoV-2 foram baseados na detecção de ácido nucleico, anticorpos e proteínas, mas a detecção de ácido nucleico por RT-PCR é o padrão-ouro4. No entanto, a RT-PCR tem algumas limitações; Requer equipamentos especializados, infraestrutura e pessoal treinado em biologia molecular, limitando sua aplicação a laboratórios especializados. Além disso, é demorado (4-6 h), não incluindo o tempo de transporte das amostras para o laboratório, que pode levardias 5. Essas restrições impedem o processamento eficiente da amostra e a obtenção das informações necessárias para o planejamento de contingência e gerenciamento epidemiológico.
A amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa (RT-LAMP) tem várias vantagens sobre o RT-PCR, tornando-se uma estratégia atraente para projetar futuros testes diagnósticos no local de atendimento (POCT), particularmente em ambientes com recursos limitados6. Primeiro, é muito específico porque usa entre quatro e seis primers que reconhecem de seis a oito áreas na sequência alvo, seja DNA ou RNA 7,8. Em segundo lugar, por operar a uma temperatura constante, não requer equipamentos sofisticados, como termocicladores em tempo real, para gerar a amplificação, nem requer pessoal altamente treinado para operá-la. Em terceiro lugar, o tempo de reação é muito curto (~ 60 min) e reagentes não muito especializados são empregados, o que o torna uma ferramenta econômica6. Diante do exposto e da emergência sanitária causada pela pandemia de COVID-19, essa técnica pode ser vista como um método diagnóstico alternativo, rápido, barato e simples de implementar em qualquer laboratório de pesquisa9.
O protocolo de padronização e implementação de um RT-LAMP para detecção de SARS-CoV-2 por métodos colorimétricos usando um termociclador e um banho-maria é descrito neste artigo (Figura 1). Discutem-se os pontos críticos, suas limitações e alternativas para avançá-los.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65662/65662fig01.jpg"> Figura 1: Esquema do protocolo de amplificação do SARS-CoV-2 usando a técnica RT-LAMP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65662/65662fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>SOLIS BIODYNE</td><td>07-12-00050</td><td>Armazenar em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>50x TAE Tampão de Eletroforese</td><td>ThermoScientific</td><td>B49</td><td>Armazene à temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Accuris High Fidelity Polymerase</td><td>ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS</td><td>PR1000-HF-200</td><td>Pode ser usado no caso de a DNA polimerase de alta fidelidade Q5 não poder ser comprada. Para a enzima, fazer alíquotas de volume adequado e conservar a -20 graus; C até o uso.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>PanReacAppliChem</td><td>A8963,0100</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Bst 3.0 DNA Polimerase 8000 UI/mL</td><td>New England BioLabs</td><td>M0374S/M0374L</td><td>Para a enzima, faça alíquotas de um volume apropriado e armazene a -20 &graus; C até o uso.</td></tr><tr><td>Conjunto de solução de desoxinucleotídeo (dNTP)</td><td>New England BioLabs</td><td>N0446S</td><td>Loja a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Dietilpirocarbonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>159220-25G&nbsp;</td><td>Manuseie-o com cuidado sob um armário de extração</td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, pronto para uso</td><td>ThermoScientific</td><td>SM0322</td><td>Armazene a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Hidroxi naftol azul sal dissódico</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-215156B</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Q5 DNA polimerase de alta fidelidade 2000 IU/mL&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0491S / M0491L</td><td>Para a enzima, faça alíquotas de um volume apropriado e armazene a -20 & C até o uso.</td></tr><tr><td>WarmStart RTx Transcriptase Reversa 15000 UI/mL</td><td>New England BioLabs</td><td>M0380S/M0380L</td><td>Para a enzima, faça alíquotas de um volume apropriado e armazene a -20 &graus; C até o uso.</td></tr></tbody></table>

detecção do vírus sars-cov-2 por amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa

Detecting SARS-CoV-2 Virus by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification

O vírus coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) afetou drasticamente a saúde humana. Continua a ser uma ameaça para a sociedade moderna porque muitas pessoas morrem como resultado de uma infecção. A doença é diagnosticada por meio de testes sorológicos e moleculares, como a reação em cadeia da polimerase em tempo real padrão-ouro (RT-PCR). Este último tem várias desvantagens porque requer infraestrutura especializada, equipamentos caros e pessoal treinado. Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo as etapas necessárias para detectar o vírus SARS-CoV-2 usando amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa (RT-LAMP) em amostras humanas. O protocolo inclui instruções para projetar primers in silico, preparar reagentes, amplificação e visualização. Uma vez padronizado, esse método pode ser facilmente implementado e adaptado a qualquer laboratório ou ponto de atendimento em 60 minutos a baixo custo e usando equipamentos baratos. É adaptável à detecção de diferentes patógenos. Assim, pode potencialmente ser usado no campo e nos centros de saúde para realizar vigilância epidemiológica oportuna.

A implementação do protocolo começa com o desenho do conjunto de primers para cada gene alvo seguindo o protocolo descrito acima. Em junho de 2020, 5.000 genomas de SARS-CoV-2 foram obtidos do banco de dados NextStrain, com 10% de representatividade dos genomas colombianos. Essas sequências foram alinhadas para obter a sequência de consenso que foi usada no processo de design do primer. A Tabela 1 mostra o conjunto de primers escolhido para os primers RdRp/Hel e RdRp. O conjunto de primers para amplifica...

Aqui, fornecemos um protocolo completo para padronizar e implementar o método de detecção do vírus SARS-CoV-2 em amostras humanas por amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa (RT-LAMP). Este método, feito em 60 min, pode ser adaptado a qualquer laboratório ou ponto de atendimento a baixo custo e usando equipamentos baratos.

Detecção do vírus SARS-CoV-2 por amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus has dramatically impacted human health. It continues to be a threat to modern ...

Nossa pesquisa visa padronizar o LAMP como um teste pré-diagnóstico, adequado para ambientes de campo ou de atenção primária que carecem de infraestrutura laboratorial avançada. Buscamos promover o uso de tampões de produção local e corantes alternativos, reduzindo a dependência de kits comerciais importados. Atualmente, o CRISPR-Cas é um sistema eficiente empregado no desenvolvimento de métodos diagnósticos rápidos, específicos e sensíveis para patógenos.Agora, este sistema tem uma ampla gama de suplementos para detectar alvos de RNA ou DNA em diferentes amostras de interesse. Os desafios experimentais atuais envolvem a prevenção da amplificação não-alvo resultante da contaminação do amplicon e da célula primária, especialmente com primers longos propensos à formação de dímeros. Além disso, pretendemos determinar as condições ideais de reação para obter uma mudança de cor visualmente distinguível no corante.Uma vez padronizado e totalmente validado, esse método pode ser facilmente implementado e adaptado a qualquer laboratório ou ponto de atendimento em 60 minutos, a baixo custo e usando equipamentos baratos, para detectar quase todos os patógenos. Assim, pode potencialmente ser u

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Biologia

Apresentamos um ensaio RT-LAMP para a detecção de TiLV em peixes de tilápia usando instrumentos simples durante um período relativamente curto de tempo em comparação com as técnicas convencionais de RT-PCR. Este protocolo pode ajudar a controlar a propagação epidêmica do TiLVD, especialmente nos países em desenvolvimento.

Ensaio de amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa (RT-LAMP) para a detecção específica e rápida do vírus do lago tilápia

Este trabalho resume as etapas no desenvolvimento de ensaios diferentes para a detecção de SARS-CoV-2 usando um sistema ddPCR de duas cores. As etapas são elaboradas e notas foram incluídas sobre como melhorar os ensaios e o desempenho do experimento. Estes ensaios podem ser usados para aplicações SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Protocolos digitais de PCR digital de gotícula de transcrição reversa em duas etapas para detecção e quantificação de SARS-CoV-2

Um projeto de ciência cidadã foi projetado para recrutar residentes de San Diego para coletar amostras ambientais para sars-cov-2. Uma plataforma multilíngue baseada na Web foi criada para envio de dados usando uma interface de dispositivo móvel fácil de usar. Um sistema de gerenciamento de informações laboratorial facilitou a coleta de milhares de amostras geograficamente diversas com rastreamento de resultados em tempo real.

Limpando o Ambiente Urbano - Um Pipeline para Amostragem e Detecção de SARS-CoV-2 de Reservatórios Ambientais

O protocolo descreve um método de diagnóstico SARS-CoV-2 que utiliza a automação de código aberto para realizar testes moleculares RT-qPCR de amostras de saliva. Essa abordagem escalável pode ser aplicada à vigilância clínica em saúde pública, bem como ao aumento da capacidade de laboratórios universitários menores.

Eficiente SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizando robôs de pipetação de código aberto

Apresentamos dois kits internos de RT-qPCR de uma etapa baseados em sonda para vírus respiratórios comuns. O primeiro ensaio é para SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 e H3N2) e Influenza B. O segundo é para SARS-Cov-2 (N) e MERS (UpE e ORF1a). Estes ensaios podem ser implementados com sucesso em qualquer laboratório especializado.

Desenvolvimento de ensaios RT-qPCR multiplex em tempo real para a detecção de SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV

Um protocolo geral para o uso da calorimetria de titulação isotérmica para monitorar a termodinâmica obrigatório para os sistemas biológicos com moderada afinidade de ligação é apresentado.

Calorimetria isotérmica de titulação para medição de Macromoléculas-Ligand Affinity

Complexos proteína de catalisar as funções celulares importantes. Caracterização estrutural e funcional detalhada de muitos complexos essenciais exige a produção recombinante. MultiBac é um sistema de células de baculovirus / insecto particularmente adaptado para a expressão de proteínas eucarióticas e seus complexos. MultiBac foi implementado como uma plataforma de acesso aberto, e procedimentos operacionais padrão desenvolvidos para maximizar a sua utilidade.

A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL

Nós descrevemos a preparação de bibliotecas de DNA com código de barras e posterior captura exon baseada em hibridização para a detecção de mutações associadas ao câncer de chave em amostras de tumor clínicos por sequenciamento paralelo em massa "próxima geração". Alvejado seqüenciamento exon oferece os benefícios de alto rendimento, baixo custo, e cobertura seqüência de profundidade, proporcionando assim alta sensibilidade para detecção de mutações de baixa frequência.

Detectando somáticas Genéticos Alterações em amostras de tumor por Exon Captura e Seqüenciamento Massively Parallel

A natureza das interações entre células tronco e progenitoras hematopoéticas (hspCs) e nichos de medula óssea é pouco compreendido. Modificações de hardware personalizado e um protocolo de aquisição multi-passo permite o uso de dois fótons e microscopia confocal a imagem ex vivo hspCs rotulados hospedados dentro de áreas da medula óssea, as interações de rastreamento e movimento.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

A atividade adrenal pode ser avaliada na espécie equina pela análise das fezes para metabólitos de corticosterona. O método oferece uma opção não invasiva para avaliar padrões de longo prazo em cavalos domésticos e soltos. Este protocolo descreve o imunoensaio enzimático envolvido e a validação bioquímica associada.

Fecal Análise de glicocorticóides: Non-invasive Monitoring Adrenal em eqüídeos

Aprenda a detectar o vírus SARS-CoV-2 usando amplificação isotérmica RT-LAMP em 60 minutos com equipamentos de baixo custo. Este método padronizado permite diagnóstico rápido e acessível em configurações de atenção primária.

Detecção do vírus SARS-CoV-2 por amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa

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