Name: Isolamento e Cultura de Células Ciliadas Cocleares Primárias de Camundongos Neonatais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Aprenda o isolamento e cultura de células ciliadas cocleares primárias de camundongos neonatais. Este método utiliza digestão enzimática e imunofluorescência para estudar a biologia celular do sistema auditivo.

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Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (NFSC 82101224 à YG)

Todos os experimentos com animais foram aprovados (nº 2021-847) pelo Comitê de Uso e Cuidado de Animais da Universidade Xi'an Jiaotong.
1. Esterilização e preparo do material
<ol><li>Esterilizar as ferramentas de dissecção usando desinfecção a vapor de alta temperatura e alta pressão e secá-las em uma incubadora de 50 °C durante a noite.</li>
	<li>Preparar 100 mL do meio de cultura contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) e 10 mg/mL de penicilina/estreptomicina (adicionar 10 mL de SFB e 10 μL de solução estoque de penicilina a 90 mL de meio de águia modificado (EMEM) de Dulbecco e armazenar a 4 °C.</li>
</ol>2. Dissecção e remoção do osso temporal para coleta de epitélios auditivos
<ol><li>Eutanásia de um total de 10 camundongos recém-nascidos (com idade entre P3 e P5) por decapitação em gelo. Use uma metodologia alternativa, eticamente aprovada, se necessário.</li>
	<li>Manter a cabeça posicionada, abrir o couro cabeludo ao longo da sutura sagital com tesoura microoperatória e separar e fixar o couro cabeludo bilateralmente com os dedos, como mostra a Figura 1A.</li>
	<li>Remova o cérebro usando um pequeno elevador periosteal e bissetriz o crânio basal. Corte o crânio com uma tesoura e vire para frente para abrir o crânio; Use a ponta da tesoura para raspar o cérebro e expor a base do crânio.</li>
	<li>Observar os ossos temporais bilaterais na base do crânio (Figura 1C). Use tesoura para cortar a base do crânio ao longo da linha média, raspar a pele e remover qualquer osso desnecessário (Figura 1D,D').</li>
	<li>Reter e transferir os ossos temporais para placas de Petri estéreis de 35 mm contendo solução salina balanceada de Hank fresca (HBSS) (Figura 1E).</li>
	<li>Utilizar duas pinças de pontas #5 para remover a bula e o tecido circundante da porção petrosa do osso temporal (Figura 1E). OBS: Nesta fase, o labirinto ósseo no osso temporal dos camundongos não estaria completamente calcificado e seria facilmente dissecado com pinças.</li>
	<li>Segure a pinça com uma mão para fixar a parte semicircular do osso temporal e enfie o pé inferior da pinça no nicho da janela redonda com a outra mão para separar o osso lateral da cóclea do vestíbulo da escala. Remover cuidadosamente a porção petrosa do osso temporal sem tocar o epitélio OC. Em seguida, separar e remover cuidadosamente o labirinto ósseo da cóclea da extremidade basal para a extremidade apical (Figura 1F).</li>
	<li>Microisolar cuidadosamente o órgão do epitélio sensorial de Corti do modíolo usando pinça de pontas #5 (Figura 1G).</li>
	<li>Segurar o ligamento espiral, separá-lo cuidadosamente da estria vascular com pinças microoperadoras e transferir o epitélio auditivo limpo para uma placa de cultura estéril de 3 mm contendo HBSS usando uma pipeta de 200 μL (Figura 1H).</li>
	<li>Coletar 20 espécimes de cada animal e transferi-los rapidamente para uma placa de Petri estéril de 100 mm contendo HBSS para a próxima etapa de preparação (Figura 1).</li>
</ol>3. Desagregado enzimático para obtenção de células ciliadas auditivas
<ol><li>Transferir o epitélio auditivo para 10 mL de DMEM fresco contendo tripsina a 0,25% e incubar a 37 °C por 12 min.</li>
	<li>Usando uma ponta de pipeta de 200 μL, separe suavemente as células ciliadas da lâmina basal e outras células sob um microscópio cirúrgico.</li>
	<li>Adicionar mais 10 mL de meio de cultura para inibir a desagregação.</li>
	<li>Filtrar as células em suspensão no meio de cultura através de um filtro de 70 μm, recolher o filtrado num tubo limpo de 50 ml e centrifugar a 300 × g durante 5 minutos.</li>
	<li>Ressuspender as células ciliadas em pelo menos 5 mL de meio de cultura, pipetando-as suavemente para cima e para baixo usando uma ponta de pipeta de 1.000 μL. Evite introduzir bolhas.</li>
	<li>Coloque uma tampa no fundo de uma placa de seis poços com antecedência. Contar as células e cultivá-las a uma densidade de 10a 6 células/mL em placas de seis poços.</li>
	<li>Cultivar as células aderentes em 2 mL de DMEM (contendo 10% de SFB, 100 unidades/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina) a 37 °C e 5% de CO2. Mude o meio cultural todos os dias. OBS: Deve-se mencionar que a utilização deste protocolo não resulta na obtenção de células ciliadas puras. Com base neste método primário de cultura celular, recomendamos o uso de células d2 ou d3 para estudos posteriores, pois as células ciliadas podem constituir aproximadamente 70% das células em cultura e estar em bom estado.</li>
</ol>4. Coloração por imunofluorescência
<ol><li>Colher as células cultivadas de d1 a d6 (um poço por dia). Aspirar o meio de cultura e enxaguar as células 2x com solução salina tamponada com fosfato (PBS).</li>
	<li>Fixar as células com paraformaldeído a 4% por 15 min à temperatura ambiente (TR).</li>
	<li>Retire o fixador e enxágue as células por 3 x 3 min com PBS.</li>
	<li>Permeabilizar as células com PBS contendo Triton X-100 a 0,2% por 10 min no TR.</li>
	<li>Incubar as células permeabilizadas com uma solução de bloqueio composta por SFB a 10% em PBS por 20 min no TR.</li>
	<li>Manchar as células com anticorpo monoclonal antimiosina (diluído a 1:200 em PBS) a 4 °C durante a noite.</li>
	<li>Lavar as células 3x com PBS estéril e incubá-las com anticorpo secundário (Alexa Fluor 594 cabra anti-coelho MYO7A, diluído 1:500 em PBS) e faloidina marcada com fluoresceína (Alexa Fluor 488, para identificar a estrutura celular) por 2 h no RT.</li>
	<li>Enxaguar as células 3x com PBS para remover os anticorpos secundários.</li>
	<li>Adicione 1-2 gotas de meio de montagem com DAPI nas lâminas, monte as lamínulas e coloque-as sob um microscópio confocal de varredura a laser para capturar fotos das células.</li>
</ol>5. Análise estatística
<ol><li>Realizar análise de variância (ANOVA) two-way seguida de testes post hoc de Tukey para analisar as mudanças nos valores de cinza de miosina-VIIa e faloidina ao longo do tempo. Use o método de marcação de letras para marcar diferenças estatísticas.</li>
	<li>Realizar ANOVAs unidirecionais adicionais seguidas de testes post-hoc de Tukey para comparar a razão de células positivas para faloidina entre amostras de células do dia 1 ao dia 6 e a razão de células positivas para miosina VII nos mesmos dias.</li>
</ol>

Cultivo in vitro eficiente de células ciliadas cocleares de camundongos

<ol><li>Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+structural+development+of+mammalian+Basilar+Membrane+provides+anatomical+basis+for+the+maturation+of+tonotopic+maps+and+frequency+tuning%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning.</a> Sci Rep. 11 (1), 7581(2021).</li>
<li>Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+hair+cells%3A+The+sound-sensing+machines%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Cochlear hair cells: The sound-sensing machines.</a> FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).</li>
<li>Joo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Contribution+of+Ototoxic+Medications+to+Hearing+Loss+Among+Older+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).</li>
<li>Nieman, C. L., Oh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Hearing Loss.</a> Ann Intern Med. 173 (11), ITC81-ITC96 (2020).</li>
<li>Mao, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-Induced+Hearing+Loss%3A+Updates+on+Molecular+Targets+and+Potential+Interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions.</a> Neural Plast. 2021, 4784385(2021).</li>
<li>Morioka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+vulnerability+after+noise+exposure+in+a+mouse+model+of+reactive+oxygen+species+overproduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction.</a> J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cytological+profiling+of+biological+aging+of+mouse+cochlear+inner+and+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells.</a> Cell Rep. 39 (2), 110665(2022).</li>
<li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+Culture+of+Neonatal+Murine+Inner+Ear+Explants%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants.</a> Front Cell Neurosci. 13, 170(2019).</li>
<li>Ding, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin+ototoxicity+in+rat+cochlear+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures.</a> Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).</li>
<li>Abitbol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+ototoxicity+in+organotypic+cochlear+cultures+occurs+independent+of+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 342(2020).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-VIIa+is+expressed+in+multiple+isoforms+and+essential+for+tensioning+the+hair+cell+mechanotransduction+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex.</a> Nat Commun. 11 (1), 2066(2020).</li>
<li>Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+auditory+HEI-OC1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Working with auditory HEI-OC1 cells.</a> J Vis Exp. (115), (2016).</li>
<li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> J Vis Exp. (107), (2016).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mouse+cochlear+progenitors+that+develop+hair+and+supporting+cells+in+the+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti.</a> Nat Commun. 8, 15046(2017).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).</li>
<li>Ruel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+SLC17A8+encoding+vesicular+glutamate+transporter-3%2C+VGLUT3%2C+underlies+nonsyndromic+deafness+DFNA25+and+inner+hair+cell+dysfunction+in+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice.</a> Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).</li>
<li>Seal, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorineural+deafness+and+seizures+in+mice+lacking+vesicular+glutamate+transporter+3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3.</a> Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).</li>
<li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+distinct+Atoh1+enhancers+cooperate+for+sound+receptor+hair+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119(2022).</li>
<li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Em comparação com a linhagem celular HEI-OC1, culturas primárias de células ciliadas replicaram com mais precisão o estado fisiológico das células in vivo. Portanto, o método de cultura primária auditiva estabelecido pelo isolamento de células vivas dos órgãos cocleares e sua cultura imediata parece ser uma ferramenta valiosa para uma extensa pesquisa sobre sistemas auditivos. Certas técnicas são cruciais para uma cultura de sucesso. Primeiro, minimizar a duração da separação do órgão de Corti do osso temporal aumenta a ...

As células ciliadas da cóclea desempenham papéis importantes na detecção do som e na transmissão do sinal para o nervo auditivo. As células ciliadas são células mecanicistas que funcionam como receptores sensoriais primários e convertem vibrações sonoras em sinais elétricos em vertebrados. O epitélio sensorial da orelha interna de mamíferos é composto por uma única fileira de células ciliadas internas e três fileiras de células ciliadas externas. Em diferentes áreas da membrana básica, as células ciliadas percebem sons em diferentes frequências (entre 20 e 2.000 Hz)1. A função das células ciliadas externas é um processo de amplificação mecânica ativa que ajuda a ajustar o ouvido interno dos mamíferos, conferindo alta sensibilidade ao som. As células ciliadas internas são responsáveis pela detecção de sons. Após a despolarização gradual, a informação acústica é transmitida ao cérebro através das fibras do nervoauditivo2.
A perda auditiva pode ser causada por defeitos genéticos, envelhecimento, trauma sonoro ou uso excessivo de drogas ototóxicas, que constituem um grande problema de saúde em todo omundo3,4. A perda auditiva resulta, principalmente, de danos irreversíveis às células ciliadas5. Em relação à perda auditiva induzida por ruído, embora os pesquisadores tenham chegado a um consenso sobre vários detalhes de sua etiologia, falta uma compreensão abrangente dos inúmeros mecanismos subjacentes. As células ciliadas externas são particularmente vulneráveis à superexposição acústica6. As células ciliadas mecanossensíveis da cóclea estão envolvidas na perda auditiva relacionada à idade; no entanto, os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à degeneração das células ciliadas permanecem desconhecidos. Diversas alterações nos processos moleculares levam ao envelhecimento das células ciliadas, estresse oxidativo, resposta a danos ao DNA, autofagia e desregulação da expressão e transcrição de genes relacionados à especialização das células ciliadas7.
Como a orelha interna está envolta no osso temporal, profundamente no osso mais duro do corpo, ela é experimentalmente inacessível, representando um desafio para as investigações sobre os mecanismos de reparação e regeneração das células ciliadas. Assim, o estabelecimento de culturas in vitro para investigação da função das células ciliadas tornou-se um método ideal para pesquisas sobre os mecanismos de regeneração e lesão da orelha interna. Os procedimentos de preparo das culturas organotípicas da cóclea foram descritos em estudos anteriores 8,9,10. Pesquisadores em todo o mundo têm empregado várias técnicas de microdissecção coclear e preparação de superfície. Apesar dos desafios persistentes, vários sistemas primários de cultura de células ciliadas foram estabelecidos com sucesso in vitro. As culturas de órgãos cocleares contêm vários tipos de células, incluindo células ciliadas, células de Deiters, células de Hensen, células pilares e fibras do nervo auditivo. Uma compreensão profunda das mudanças nas células ciliadas em nível celular e molecular após a lesão permitirá o desenvolvimento de ferramentas de pesquisa mais poderosas. Este estudo teve como objetivo demonstrar os passos para isolar órgãos cocleares de camundongos neonatais e desprender enzimaticamente as células ciliadas abundantes para estudos in vitro. A natureza das células cultivadas foi confirmada pela coloração de imunofluorescência.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura de células BioLite de 100 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130182</td><td>usando para cultura</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células Nunc de 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150318</td><td>usando para cultura</td></tr><tr><td>palato de 6 poços</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>310109005</td><td>usando para cultura</td></tr><tr><td>70 &micro; filtros de células m</td><td>BD Company</td><td>352350</td><td>usando para filtro</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Faloidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>coloração imunofluorescente</td></tr><tr><td>Anti-coelho IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>A11008</td><td>coloração imunofluorescente</td></tr><tr><td>dia 3-5 neonatal murino&nbsp;</td><td></td><td></td><td>fornecido pela Universidade Xi'an Jiaotong</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>usando para cultura</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td>usando para cultura</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Dumont</td><td>5 #</td> <td>usando para dissecção</td></tr><tr><td>Leica microscópio de anatomia</td><td>Alemanha</td><td>S9i</td><td>usando para dissecção</td></tr><tr><td>Penicilina / estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>usando para cultura</td></tr><tr><td>Coelho plyclonal para Miosina VIIa</td><td>Abcam empresa</td><td>ab92996</td><td>coloração imunofluorescente</td></tr><tr><td>Scissor</td><td>Belevor</td><td>10cm/04.0524.10</td><td>usando para dissecção</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>9036-19-5</td><td>imunofluorescência que</td></tr><tr><td>colore a tripsina</td><td>Thermo Fisher 25200072</td><td></td><td>científica usando-se para a cultura</td></tr></tbody></table>

isolamento e cultura de células ciliadas cocleares primárias de camundongos neonatais

Isolation and Culture of Primary Cochlear Hair Cells from Neonatal Mice

As células ciliadas da cóclea são os receptores sensoriais do sistema auditivo. Essas células estão localizadas no órgão de Corti, órgão sensorial responsável pela audição, dentro do labirinto ósseo da orelha interna. As células ciliadas da cóclea consistem em dois tipos anatomicamente e funcionalmente distintos: células ciliadas externas e internas. Danos a qualquer um deles resultam em perda auditiva. Notavelmente, como as células ciliadas internas não podem se regenerar, e os danos a elas são permanentes. Assim, o cultivo in vitro de células ciliadas primárias é indispensável para investigar os efeitos protetores ou regenerativos das células ciliadas da cóclea. Este estudo teve como objetivo descobrir um método para isolar e cultivar células ciliadas de camundongos. 
Após a remoção manual da parede lateral da cóclea, o epitélio auditivo foi meticulosamente dissecado do modíolo coclear ao microscópio, incubado em uma mistura composta de tripsina-EDTA a 0,25% por 10 min a 37 °C e suavemente suspenso em meio de cultura com ponta de pipeta de 200 μL. A suspensão celular foi passada através de um filtro de células, o filtrado foi centrifugado e as células foram cultivadas em placas de 24 poços. As células ciliadas foram identificadas com base em sua capacidade de expressar um complexo mecanotransdutor, a miosina-VIIa, que está envolvido em tensões motoras, e via marcação seletiva de F-actina usando faloidina. As células atingiram >90% de confluência após 4 dias em cultura. Este método pode melhorar nossa compreensão das características biológicas de células ciliadas cultivadas in vitro e demonstrar a eficiência das culturas de células ciliadas cocleares, estabelecendo uma base metodológica sólida para futuras pesquisas auditivas.

Seguindo este protocolo, as células isoladas foram semeadas. Sementes de células ciliadas primárias da cóclea foram consideradas bem-sucedidas se as células não flutuassem no meio de cultura e se espalhassem em 24 h. Determinamos o número de células ciliadas após aderirem e se espalharem em agregados planos no fundo da placa. Após 1 dia, as células ciliadas vivas foram firmemente aderidas ao fundo da placa de cultura e as células não aderentes foram removidas por enxágüe com PBS. Tipicamente, o número de células dobrou a...

Neste trabalho, apresentamos um protocolo detalhado para isolamento e cultivo de células ciliadas primárias da cóclea de camundongos. Inicialmente, o órgão de Corti foi dissecado de cócleas murinas neonatais (idade 3-5 dias) sob um microscópio. Posteriormente, as células foram digeridas enzimaticamente em uma suspensão unicelular e identificadas por imunofluorescência após vários dias em cultura.

Isolamento e Cultura de Células Ciliadas Cocleares Primárias de Camundongos Neonatais

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for ...

A orelha interna está envolta no osso temporal, profundamente no osso mais duro do corpo, representando um desafio para as investigações. O cultivo de células ciliadas primárias é indispensável para a investigação das células ciliadas da cóclea. Este estudo teve como objetivo descobrir um método para isolar e cultivar células ciliadas de camundongos.Demonstramos os passos para isolar os órgãos cocleares de seus camundongos naturais e destacar assimetricamente as células ciliadas abundantes para estudos in vitro. A natureza das células cultivadas foi confirmada pela coloração de imunofluorescência. Existem três métodos primários de cultura estabelecidos pelo isolamento de células vivas dos órgãos cocleares, e imediatamente treiná-los, par para ser uma ferramenta valiosa para a pesquisa extensiva, são todos os três sistemas.Este método pode melhorar nossa compreensão das características biológicas de células ciliadas cultivadas in vivo e demonstrar a eficiência das culturas de células ciliadas cocleares, estabelecendo uma base metodológica sólida para futuras pesquisas auditivas.

isolation-culture-primary-cochlear-hair-cells-from-neonatal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este procedimento descreve um método para o isolamento e cultura do órgão murino de Corti com ou sem o limbo espiral e neurônios do gânglio espiral. Nós também demonstrar um método para a expressão de um gene exógeno repórter no órgão de Corti explante por eletroporação.

Cultura primária e Eletroporação Plasmid do Órgão de Corti murino.

A citometria de fluxo é uma ferramenta poderosa que permite o isolamento e o estudo de populações celulares específicas. Este protocolo descreve os passos para o isolamento de células que expressam LacZ a partir de tecidos cocleares de camundongos transgênicos neonatos. Células cocleares dissociadas foram marcadas usando substratos conjugados com fluoróforo da β-galactosidase antes da separação por citometria de fluxo.

Isolando-LacZ expressar Células de tecidos de camundongos Inner Ear usando Citometria de Fluxo

Apresentamos um método que descreve o isolamento e a cultura de explantes cocleares da orelha interna embrionária de camundongos.  Também demonstramos um método para transferência de genes em explantes cocleares por meio de eletroporação de onda quadrada. A cultura de explantes in vitro, juntamente com a técnica de transferência de genes, permite que os pesquisadores estudem os efeitos da alteração da expressão gênica durante o desenvolvimento.

Cultura da embrionárias mouse cocleares explantes e Gene Transferência de Eletroporação

Os cílios primários influenciam várias vias de sinalização. A cóclea de mamíferos é ideal para examinar a sinalização da polaridade das células planares (PCP). A disfunção dos cílios afeta o crescimento coclear, a padronização celular e a orientação das células ciliadas, as leituras de PCP. Nosso objetivo é analisar a sinalização de PCP na cóclea de camundongo por meio de análise fenotípica, imuno-histoquímica e microscopia eletrônica de varredura.

Avaliação da Planar-Cell-Polaridade fenótipos em Ciliopathy rato mutante cóclea

Nós apresentamos um método para isolar o órgão de Corti adulto como três voltas intactas cocleares (Apex, médio e base). Nós também demonstrar um procedimento para a imunocoloração com anticorpos marcados por fluorescência. Em conjunto estas técnicas permitem o estudo de células ciliadas, células de suporte, e outros tipos de células encontradas na cóclea.

Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

O objetivo deste protocolo é demonstrar a preparação, cultura, tratamento e imunocoloração de explantes cocleares murinos neonatais. A técnica pode ser utilizada como ferramenta de seleção in vitro na pesquisa auditiva.

Técnica Explosiva Cochlear Murina Neonatal como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ferramenta de seleção na pesquisa auditiva

Este estudo apresenta uma técnica para o isolamento de neurônios de ratos neonatais WT. Requer a dissecção cuidadosa da medula espinhal do rato neonatal, seguida da separação de neurônios do tecido da medula espinhal através da clivagem mecânica e enzimática.

Isolamento e cultura de neurônios da medula espinhal de ratos neonatais

Os queratinócitos epidérmicos formam uma barreira funcional da pele e são posicionados na linha de frente da defesa do hospedeiro contra insultos ambientais externos. Aqui descrevemos métodos para isolamento e cultura primária de queratinócitos epidérmicos de pele de rato neonatal e adulta e indução de diferenciação terminal e resposta inflamatória desencadeada por UVB de queratinócitos.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

Este artigo apresenta um método de preparação da superfície coclear modificado que requer decaltificação e uso de um adesivo de células e tecidos para aderir aos pedaços de epélia coclear a 10 mm de cobertura redonda para imunohistoquímica em córquia de camundongo adulto.

Preparação da superfície coclear no mouse adulto

O protocolo atual atualiza protocolos anteriores e incorpora abordagens relativamente simples para a cultura de explantes cocleares de alta qualidade. Isso fornece aquisição de dados confiável e imagens de alta resolução em células vivas e fixas. Este protocolo apoia a tendência contínua de estudar as células da orelha interna.

Explantes Cocleares Neonatais Totais como Modelo In vitro

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento, purificação e cultivo de células marginais primárias da stria vascular do camundongo, e para estabelecer modelos in vitro de estresse oxidativo e senescência celular para estudar distúrbios da parede lateral coclear.

Isolamento e Cultura de Células Marginais Primárias da Stria Vascularis de Camundongos Neonatais

Aprenda o isolamento e cultura de células ciliadas cocleares primárias de camundongos neonatais. Este método utiliza digestão enzimática e imunofluorescência para estudar a biologia celular do sistema auditivo.

Isolamento e Cultura de Células Ciliadas Cocleares Primárias de Camundongos Neonatais

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