Name: Preparação de Núcleos Cerebrais e de Medula Óssea de Alta Qualidade para Ensaios Multioma de Núcleos Únicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprenda a preparar núcleos cerebrais e de medula óssea de alta pureza para ensaios multioma de núcleos únicos. Este protocolo otimizado melhora a recuperação celular e a qualidade dos dados de sequenciamento.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ana Jeemin Choi foi apoiada por uma bolsa do Programa de Doutorado Internacional Pasteur - Universidade de Paris (PPU).

Preparação de amostras de alta qualidade para análise genômica multioma 10X

<ol><li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scNMT-seq+enables+joint+profiling+of+chromatin+accessibility+DNA+methylation+and+transcription+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 781(2018).</li>
<li>Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomics%3A+technologies+and+data+analysis+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods.</a> Experimental & Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).</li>
<li>Cerrizuela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scNMT+protocol+for+multiomics+profiling+of+single+cells+from+mouse+brain+and+pancreatic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-throughput scNMT protocol for multiomics profiling of single cells from mouse brain and pancreatic organoids.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101555(2022).</li>
<li>Dimitriu, M. A., Lazar-Contes, I., Roszkowski, M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomics+techniques%3A+From+conception+to+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomics techniques: From conception to applications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854317(2022).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+profiling+of+chromatin+accessibility+and+gene+expression+in+thousands+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Joint profiling of chromatin accessibility and gene expression in thousands of single cells.</a> Science (New York, N.Y.). 361 (6409), 1380-1385 (2018).</li>
<li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+Isolation+from+Fresh+Frozen+Brain+Tumors+for+Single-Nucleus+RNA-seq+and+ATAC-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61542(2020).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+transcriptomics+reveals+functional+compartmentalization+in+syncytial+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus transcriptomics reveals functional compartmentalization in syncytial skeletal muscle cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 6375(2020).</li>
<li>Santos, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+sequencing+of+single+nuclei+from+murine+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100694(2021).</li>
<li>Safabakhsh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+nuclei+from+frozen+human+heart+tissue+for+single-nucleus+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing.</a> Current Protocols. 2 (7), e480(2022).</li>
<li>Lau, S. -F., Cao, H., Fu, A. K. Y., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+transcriptome+analysis+reveals+dysregulation+of+angiogenic+endothelial+cells+and+neuroprotective+glia+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus transcriptome analysis reveals dysregulation of angiogenic endothelial cells and neuroprotective glia in Alzheimer's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (41), 25800-25809 (2020).</li>
<li>Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+brain+cell+transcriptomes+and+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes.</a> Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).</li>
<li>Morabito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+chromatin+accessibility+and+transcriptomic+characterization+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus chromatin accessibility and transcriptomic characterization of Alzheimer's disease.</a> Nature Genetics. 53 (8), 1143-1155 (2021).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+transcriptomics+reveals+genes+associated+with+the+vulnerability+of+middle+temporal+gyrus+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved transcriptomics reveals genes associated with the vulnerability of middle temporal gyrus in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 188(2022).</li>
<li>Paul, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+heterogeneity+and+lineage+commitment+in+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional heterogeneity and lineage commitment in myeloid progenitors.</a> Cell. 163 (7), 1663-1677 (2015).</li>
<li>Kaufmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCG+educates+hematopoietic+stem+cells+to+generate+protective+innate+immunity+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BCG educates hematopoietic stem cells to generate protective innate immunity against tuberculosis.</a> Cell. 172 (1-2), 176-190.e19 (2018).</li>
<li>Christ, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+diet+triggers+NLRP3-dependent+innate+immune+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Western diet triggers NLRP3-dependent innate immune reprogramming.</a> Cell. 172 (1-2), 162-175.e14 (2018).</li>
<li>Moorlag, S. J. C. F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Glucan+Induces+protective+trained+immunity+against+mycobacterium+tuberculosis+infection%3A+A+key+role+for+IL-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">β-Glucan Induces protective trained immunity against mycobacterium tuberculosis infection: A key role for IL-1.</a> Cell Reports. 31 (7), 107634(2020).</li>
<li>de Laval, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBP%CE%B2-dependent+epigenetic+memory+induces+trained+immunity+in+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">C/EBPβ-dependent epigenetic memory induces trained immunity in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 26 (5), 657-674.e8 (2020).</li>
<li>Renthal, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+mosaic+Rett+syndrome+brain+tissue+by+single-nucleus+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of human mosaic Rett syndrome brain tissue by single-nucleus RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 21 (12), 1670-1679 (2018).</li>
<li>Yang, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+brain+vascular+atlas+reveals+diverse+mediators+of+Alzheimer%27s+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A human brain vascular atlas reveals diverse mediators of Alzheimer's risk.</a> Nature. 603 (7903), 885-892 (2022).</li>
<li>Lee, D. R., Zhang, Y., Rhodes, C. T., Petros, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+single-cell+and+single-nuclei+suspensions+from+embryonic+and+adult+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of single-cell and single-nuclei suspensions from embryonic and adult mouse brains.</a> STAR Protocols. 4 (1), 101944(2022).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li>
<li>Ranzoni, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+single-cell+RNA-seq+and+ATAC-seq+analysis+of+human+developmental+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative single-cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of human developmental hematopoiesis.</a> Cell Stem Cell. 28 (3), 472-487.e7 (2021).</li>
<li>10X Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide, Document Number CG000338 Rev F. , At
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide</a> (2022).</li>
<li>Meyerhoff,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941(2021).</li>
<li>10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C). , At
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing</a> (2022).</li>
<li>Haag, S., Murthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+monocyte+and+macrophage+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Murine monocyte and macrophage culture.</a> Bio-Protocol. 11 (6), e3928(2021).</li>
<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lönnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).</li>
<li>Jiang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Quality control of single-cell RNA-seq.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 1935, 1-9 (2019).</li>
<li>Regan, C., Preall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+for+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Practical considerations for single-cell genomics.</a> Current Protocols. 2 (8), e498(2022).</li>
<li>10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell ATAC Sequencing (CG000169 - Rev E). , At 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-atac/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-atac-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-atac/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-atac-sequencing</a> (2022).</li>
<li>10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation from Complex Tissues for Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Sequencing. (CG000375 - Rev C). , At
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing</a> (2022).</li>
<li>10X Genomics 10X Genomics - Chromium Nuclei Isolation Kit (CG000505 - Rev A). , At
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/chromium-nuclei-isolation-kit-sample-prep-user-guide">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/chromium-nuclei-isolation-kit-sample-prep-user-guide</a> (2022).</li>
<li>Shomroni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-cell+RNA-sequencing+approach+and+its+applicability+connecting+genotype+to+phenotype+in+ageing+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel single-cell RNA-sequencing approach and its applicability connecting genotype to phenotype in ageing disease.</a> Scientific Reports. 12 (1), 4091(2022).</li>
<li>Ocañas, S. R., Pham, K. D., Blankenship, H. E., Machalinski, A. H., Chucair-Elliott, A. J., Freeman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+ex+vivo+confounds+of+cell-isolation+techniques+on+transcriptomic+and+translatomic+profiles+of+purified+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia.</a> eNeuro. 9 (2), (2022).</li>
<li>Gérard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+activity-based+screening+and+sequencing+of+antibodies+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell activity-based screening and sequencing of antibodies using droplet microfluidics.</a> Nature Biotechnology. 38 (6), 715-721 (2020).</li>
<li>Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+applications+for+single-cell+and+spatial+multi-omics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics.</a> Nature Reviews. Genetics. 24, 494-515 (2023).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A preparação de suspensão de células ou núcleos de alta qualidade é de importância crucial para o sucesso de análises multiômicas de RNA-Seq de célula única ou de núcleo único 29,30,31. Aqui, descrevemos protocolos de preparo de amostras e isolamento de núcleos para ensaios de multioma de dois tipos de tecido: cérebro e medula óssea.
O protocolo cerebral descrito neste trabalho permite a recuperação de núcleos de alta qualidade a partir de tecido cerebral fresco-congelado. Inclui as seguintes etapas: ruptura do tecido congelado, isolamento dos núcleos, purificação dos núcleos e controle de qualidade do material preparado. O tecido cerebral é composto por diversos tipos celulares, e o procedimento de dissociação tecidual e isolamento de núcleos deve preservar as proporções das populações celulares presentes no tecido inicial. Aqui, a composição do tampão de lise e o tempo de incubação foram otimizados para permitir a lise completa e suave de todas as populações celulares que compõem o tecido.
O protocolo de HSPCs de medula óssea é um pouco diferente, pois requer uma etapa adicional no início do experimento para isolar a população celular de interesse de uma suspensão celular heterogênea. Após a coleta do tecido fresco, as hemácias são lisadas e a amostra é enriquecida para o subconjunto celular de interesse. As células-alvo são lisadas, os núcleos são isolados e a qualidade do material preparado é controlada.
A 10X Genomics fornece vários protocolos validados para isolamento de núcleos em diversos tecidos 32,33. A empresa também comercializa um kit de isolamento de núcleos com uma tubulação simples para isolar núcleos de tecidos validados34. No entanto, esses protocolos necessitam de otimização adicional para adequar as particularidades de determinadas amostras. Um exemplo são as amostras que exigem trabalhar com baixa entrada de células. Para essas amostras, as etapas mais desafiadoras são as centrifugações que precisam ser suficientemente rigorosas para limpar a amostra e suaves o suficiente para evitar a perda de células/núcleos. Com o protocolo aqui descrito, adaptamos o 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX Sequencing (CG000365 - Rev C)27 para encontrar um equilíbrio fino entre esses dois requisitos. Como demonstrado no exemplo da preparação de núcleos a partir de HSPCs triados, melhoramos a recuperação de núcleos sem impacto na qualidade da amostra.
Um desafio adicional é a etapa de lise das células purificadas para isolamento dos núcleos. Condições de lise mais severas e tempos de incubação mais longos podem danificar os núcleos e, assim, afetar a qualidade dos dados de sequenciamento. A Figura 5 mostra imagens representativas de núcleos de amostras de medula óssea em diferentes tempos de incubação com tampão de lise e ilustra como o estado dos núcleos pode ser diferente dependendo da lise celular. No exemplo dos HSPCs, identificamos a lise de 3 min como a condição que resulta na maior proporção de núcleos intactos com aparência saudável e a menor proporção de núcleos danificados. Os tempos de incubação da lise devem ser otimizados para cada novo tipo de amostra.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig05.jpg"> Figura 5: Controle de qualidade dos núcleos por microscopia. São mostradas imagens representativas de campo brilhante de núcleos isolados da medula óssea de camundongos com (A) núcleos intactos e (B) danificados. Barra de escala 5 μm. As imagens foram obtidas com microscópio invertido, utilizando-se objetiva ELWD NA, 0,60 e zoom digital de 1,5x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Ambos os protocolos detalhados neste trabalho baseiam-se na purificação de células-alvo ou núcleos por instrumentos FACS de alto rendimento. Esta etapa é de importância crucial para protocolos de preparação de células únicas/núcleos onde subconjuntos raros de células devem ser isolados de suspensões heterogêneas. Nestes, como no exemplo mostrado aqui para a classificação de HSPCs, um painel de citometria de fluxo de alta dimensão pode ser necessário para permitir o "gating" na população celular de interesse. A classificação é extremamente rápida e precisa, levando a mais de 95% de pureza dos subconjuntos de células classificadas. Essa abordagem expõe a suspensão celular a uma pressão de até 70 psi e, portanto, pode ser limitante para a triagem de células frágeis (por exemplo, células dendríticas, neutrófilos), uma vez que pode causar a ruptura de sua membrana celular. Nesses casos, soluções alternativas devem ser selecionadas para purificação celular, incluindo classificação magnética, aplicação de instrumentos de nova geração (por exemplo, CellenOne, Cellenion; MACSQuant Tyto, Miltenyi)35,36, ou sistemas baseados em gotículas (por exemplo, ODIN, Sensific)37. No entanto, a lenta velocidade de classificação dessas tecnologias, com a triagem celular que dura horas em vez de minutos, é um forte fator limitante para a aplicação dessas abordagens na preparação de células viáveis para o Multiome e outras aplicações unicelulares baseadas na análise de grandes números de células.
Para a purificação de núcleos isolados do tecido, o FACS é o método de escolha devido ao seu rendimento e à pureza do material isolado. Os núcleos não são sensíveis à pressão, e os isolados de tecido filtrado podem ser facilmente purificados através do classificador celular. Se o laboratório não estiver equipado com um instrumento FACS, existem outras alternativas, um pouco menos eficientes, mas suficientemente boas. Exemplos incluem ultracentrifugação ou o uso de pequenos equipamentos como o MARS (Applied Cell) que separa partículas com base em sua diferença de tamanho, usando ondas acústicas; Lavadora laminar CURIOX que utiliza propriedades hidrofóbicas de suspensões de células/núcleos; ou LEVITAS bio que se baseia em propriedades físicas das células (levitação) para separá-las dos detritos.
Aqui, descrevemos protocolos para obtenção de um alto número de núcleos e a melhor pureza para o protocolo Multiome a jusante. A classificação FACS e as etapas repetidas de centrifugação resultam em uma perda substancial do material inicial. Por esta razão, no protocolo de preparação de núcleos do cérebro que descrevemos aqui requer material de partida suficientemente abundante para resultar na coleta de pelo menos 500.000 núcleos após a triagem FACS. Protocolos alternativos devem ser aplicados se esse critério não puder ser correspondido. Ao trabalhar com populações celulares raras ou pequenos cortes de tecido, a quantidade disponível de material inicial pode ser um fator limitante. Para resolver essa questão, é possível melhorar a recuperação de núcleos (a) reduzindo o volume de lise, (b) reduzindo o volume de lavagem, (c) usando uma única lavagem com tempo de centrifugação prolongado para tentar melhorar a recuperação, conforme indicado nos protocolos de Genômica 10X para isolamento de núcleos de baixa entrada celular. Para análise multiômica de material de baixo conteúdo, vale a pena considerar aplicações baseadas em placas, como scNMT, SNARE-seq e Paired-seq38 , que exigem muito menos amostras de entrada.
Em resumo, descrevemos dois protocolos robustos para a preparação de núcleos do cérebro e da medula óssea HSPCs para análise do Multiome a jusante. Esses protocolos são aplicáveis em qualquer projeto científico que exija suspensões de núcleo único de alta qualidade desses dois tipos de tecido, independentemente da questão científica colocada. Nosso grupo vem aplicando o protocolo de isolamento de núcleos cerebrais em estudos do desenvolvimento cerebral após a inativação de vários genes-alvo e em estudos de resposta imune no contexto de doenças neurológicas. Estamos utilizando o protocolo de isolamento de núcleos da medula óssea para decifrar a participação de várias subpopulações hematopoéticas no estabelecimento do sistema imune.

Por muitos anos, as técnicas unicelulares têm sido o padrão-ouro para a análise de processos biológicos. Inicialmente, restringiram-se à fenotipagem unicelular por meio de microscopia, citometria de fluxo e ensaios similares. Um avanço na análise de célula única veio com o desenvolvimento de abordagens para perfil molecular de célula única, em particular o sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-Seq) que permitiu caracterizar todo o transcriptoma de células individuais. Altamente poderoso, scRNA-Seq gera informações sobre o status transcricional de uma célula em uma condição e ponto de tempo específicos. No entanto, não fornece visibilidade sobre a regulação gênica que impulsiona a transcrição, ou sobre as modificações moleculares que ocorrem ao longo do tempo. Para superar essa limitação, muitos esforços têm sido investidos no desenvolvimento de ensaios multiômicos unicelulares que possibilitem a análise de múltiplos fatores e processos de uma mesma célula1,2,3,4. A primeira medida bem-sucedida de duas modalidades dentro de células individuais veio através da ligação de padrões de expressão de proteínas de superfície multiplex com o transcriptoma completo de células individuais na abordagem CITE-Seq5. Evoluções mais recentes combinam a expressão gênica com a acessibilidade da cromatina (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing, ATAC-Seq), capturando simultaneamente modalidades transcriptômicas e epigenômicas nas mesmas células (por exemplo, sci-CAR)6. As primeiras soluções comerciais que permitiram associar a transcriptômica ao fenótipo celular ou a alterações epigenéticas de uma mesma célula vieram da 10X Genomics.
Os experimentos para perfil molecular de célula única contêm as seguintes etapas: (1) dissociação tecidual ou preparação de suspensões de célula única; (2) purificação e/ou isolamento de núcleos celulares; (3) particionamento e código de barras; (4) construção de bibliotecas e controle de qualidade; (5) sequenciamento de próxima geração; (6) análise dos dados. Enquanto os passos (3)-(6) podem variar significativamente dependendo da tecnologia empregada, os passos iniciais são geralmente comuns a todos eles. A qualidade da suspensão de células/núcleos preparada determinará o resultado global do experimento. Dependendo do tipo de tecido, a obtenção de suspensões unicelulares/núcleos de alta qualidade pode ser um desafio. As particularidades de alguns tecidos, como coração, músculo, cérebro, pulmão, intestino, entre outros, requerem métodos de ruptura tecidual e isolamento de núcleos adaptados a cada tipo de amostra, a fim de garantir a produção de núcleos de alta qualidade para análise molecular7,8,9,10. Os métodos de ruptura tecidual e os protocolos de dissociação podem ser mecânicos, enzimáticos (por exemplo, uma mistura de colagenases e DNase) ou uma combinação dos dois, e podem ser realizados manualmente ou por instrumentos (por exemplo, Qiagen DSC-400, gentleMACS).
As técnicas unicelulares tornaram-se uma ferramenta de escolha para a pesquisa biomédica. Em neurobiologia, a diversidade celular no cérebro e a complexidade de suas funções requerem análises de alta resolução e alto rendimento para visualização de populações celulares raras e para avaliação de sua heterogeneidade 11,12,13,14. Ligar a identidade celular e os mecanismos de regulação gênica de células individuais fornece insights sobre o desenvolvimento e a fisiologia do cérebro. Outro exemplo são os estudos de resposta imune no contexto de doenças infecciosas, autoimunes ou oncológicas, que dependem fortemente de análises unicelulares. A heterogeneidade dos subgrupos de células imunes e a complexidade de sua atividade e interações com outros tipos celulares requerem resolução de célula única para decifrar os mecanismos subjacentes à resposta imune. As células imunes se originam da medula óssea, onde os progenitores hematopoiéticos são compostos por células que gradualmente se diferenciam e adquirem e perdem marcadores de superfície celular ao longo de um processo gradual antes de sair da medula óssea para a periferia. A análise unicelular permite a caracterização minuciosa dos estágios de desenvolvimento celular. Pode ser realizada através da fenotipagem unicelular, convencionalmente realizada por citometria de fluxo multiparâmetro. No entanto, foi demonstrado que assinaturas transcriptômicas de célula única revelam uma identificação mais precisa dos subtipos de células progenitoras, uma vez que essas células estão distribuídas em agrupamentos que caem umas nas outras e, portanto, podem ser erroneamente identificadas quando se usa uma abordagem de marcador de superfície celular grossa15. Um número crescente de estudos revela as modificações epigenéticas que as células-tronco hematopoéticas e as células progenitoras (HSPCs) podem adquirir a partir da exposição a vários agentes, levando a um impacto significativo na responsividade do sistema imune em longo prazo 16,17,18,19. As novas tecnologias multi-ômicas permitem estudar esses processos com resolução de célula única.
Vários protocolos de isolamento celular e nuclear têm sido descritos para amostras de cérebro11,20,21,22 e medulaóssea23,24. Para minimizar o viés devido à variabilidade experimental, é necessário validar protocolos otimizados de preparação de núcleos únicos para sequenciamento epigenômico e transcriptômico de célula única, garantindo assim a reprodutibilidade de ensaios multiômicos de célula única.
Aqui, dois protocolos robustos para a preparação de núcleos a partir de (1) tecido cerebral fresco congelado e (2) HSPCs de medula óssea fresca para análise de multioma de célula única a jusante são descritos (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática dos protocolos de isolamento de núcleos de tecidos cerebrais e medulares frescos congelados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>18 G x 1 &frac12; (1,2 mm x 38 mm) Agulhas Agani</td><td>Terumo</td><td>AN*1838S1</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Tubo FACS de fundo redondo de 5 mL com tampa de filtro de célula 35 &micro; m</td><td>falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD pharmagen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD117 (c-Kit)</td><td>BioLegend</td><td>105812</td><td>Clone: 2B8</td></tr><tr><td>APC/Cyanine 7 anti-mouse CD16/32 (Fc&gamma; R)</td> <td>BioLegend</td><td>101328</td><td>Clone: 93</td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td>não aplicável</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software v8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td>não aplicável</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino Albumina&nbsp; solução estoque 10%</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de coloração celular</td><td>Biolegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>CFI Suprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6</td><td>Nikon&nbsp;</td>câmara CMOS <td>não aplicável</td><td></td></tr><tr><td>Prime 95B 25 mm</td><td>Photometrix</td><td>não aplicável</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado Countess II FL</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess cell counting chamber slide</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass 24 mm x 24 mm 0,13-0,17 mm</td><td>Marca</td><td>BR470819</td><td></td></tr><tr><td>Digitonine 5%</td><td>Invitrogen</td>Bisturis Descartáveis <td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Swann-Morton&nbsp;</td><td>0508</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x)</td><td>Gibco</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>microscópio invertido de epifluorescência Nikon Ti2 -E</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>tubos Eppendorf</td> Safe-Lock não aplicáveis <td></td></tr><tr><td>0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30123603</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>VWR</td><td>83801.290</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse CD34</td><td>Invitrogen</td><td>11-0341-85</td><td>Clone: RAM34</td></tr><tr><td>Fórceps para dissecção</td><td>FST</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal inativado por calor (FBS)</td><td>Gibco</td><td>11533387</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador Dounce 2 mL</td><td>Bellco glass</td><td>1984-10002</td><td>Pilão " A&rdquo; Grande Folga: .0030-.0050&Prime; e pilão " B&rdquo; Pequena Folga: .0005-.0025&Prime;</td></tr><tr><td>Kit de coloração de células mortas aquáticas fixáveis VIVAS/MORTAS</td><td>Invitrogen</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloreto de magnésio 1</td><td>M Microcentrífuga Sigma aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Montagem média Fluoromount-G&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 substituto</td><td>Sigma aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>ThermoFischer</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Núcleo tampão 20x&nbsp;</td>Kit de isolamento de núcleos <td>Genomics 2000153/2000207</td><td></td> <td>10X</td></tr><tr><td>EZ prep</td><td>Sigma</td><td>Aldrich NUC-101</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads contas de compensação</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-41</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de linhagem anti-rato Pacific Blue (incluindo anti-rato CD3, Ly-6G/Ly-6C, CD11b, CD45R/B220, TER-119)</td><td>BioLegend</td><td>133310</td><td>Clones (na mesma ordem dos anticorpos listados): 17A2, RB6-8C5, M1/70, RA3-6B2, Ter-119</td></tr><tr><td>Tiras de tubo de PCR 0,2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>951010022</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td><td>BioLegend</td><td>122507</td><td>Clone: E13-161.7</td></tr><tr><td>Placa de Petri 100 mm x 20 mm OPTILUX</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Ply-L-lisina 0,01% filtrado estéril adequado para cultura de células</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio impressas 8 poços 6 mm numeradas</td><td>Epredia</td><td>ER-301B-CE24</td><td></td></tr><tr><td>Tubos LoBind de proteína 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108116</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Rnase recombinante 5000 U</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura para dissecção</td><td>FST</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloreto de sódio 5 M</td><td>Sigma aldrich</td><td>59222C</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de seringa, PES, 0,2 &micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>15206869</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte transparente&nbsp;</td><td>qualquer</td> solução <td>de</td> cloridrato de Trizma não aplicável <td></td></tr><tr><td>pH 7.4</td><td>Sigma aldrich</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 0.4%</td><td>gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biorad&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1662404 Água Destilada UltraPure Dnase/Rnase Free</td><td>Invitrogen</td><td>10977-035</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de núcleos cerebrais e de medula Óssea de alta qualidade para ensaios multioma de núcleos Únicos

High-Quality Brain and Bone Marrow Nuclei Preparation for Single Nuclei Multiome Assays

A análise de célula única tornou-se a abordagem de escolha para desvendar a complexidade dos processos biológicos que requerem a avaliação da variabilidade das respostas celulares individuais ao tratamento ou infecção com resolução de célula única. 
Muitas técnicas para perfil molecular de célula única foram desenvolvidas nos últimos 10 anos, e várias tecnologias dedicadas foram comercializadas. O perfil de célula única baseado em gotículas da 10X Genomics é uma tecnologia amplamente difundida que oferece reagentes prontos para uso para perfis de célula única transcriptômicos e multi-ômicos. A tecnologia inclui fluxos de trabalho para sequenciamento de RNA de célula única e núcleo único (scRNA-Seq e snRNA-Seq, respectivamente), scATAC-Seq, perfil imunológico de célula única (sequenciamento BCR/TCR) e multioma. Este último combina informações transcricionais (scRNA-Seq) e epigenéticas (scATAC-Seq) provenientes da mesma célula. 
A qualidade (viabilidade, integridade, pureza) de suspensões unicelulares ou de núcleo único isoladas de tecidos e analisadas por qualquer uma dessas abordagens é crítica para a geração de dados de alta qualidade. Portanto, os protocolos de preparo das amostras devem ser adaptados às particularidades de cada tecido biológico e garantir a geração de suspensões celulares e nucleares de alta qualidade.
Este artigo descreve dois protocolos para preparar amostras de cérebro e medula óssea para o pipeline 10X Genomics do multioma a jusante. Os protocolos são realizados passo a passo e abrangem dissociação tecidual, triagem celular, isolamento de núcleos e controle de qualidade da suspensão de núcleos preparada que é usada como material de partida para particionamento celular e código de barras, preparação de biblioteca e sequenciamento. Esses protocolos padronizados produzem bibliotecas de núcleos de alta qualidade e dados robustos e confiáveis.

Os dois protocolos descritos acima detalham o isolamento de núcleos a partir de dois tipos diferentes de tecido. As diferenças e semelhanças entre os dois protocolos estão esquematicamente representadas na Figura 1.
Purificação de núcleos de cérebro de camundongos No protocolo aqui descrito, propomos um método suave para a preparação de núcleos a partir de amostras cerebrais. Inicia-se com uma dissociação mecânica do tecido cerebral em um tampão de lise, seguida por etapas de lavagem e filtragem do filtro que removem o tecido restante da suspensão. A remoção subsequente de detritos, células não lisadas e pequenas partículas é conseguida pelo FACS para garantir que apenas núcleos purificados sejam carregados para o protocolo Multiome a jusante. A Figura 2 mostra o perfil dos núcleos antes e após a triagem. Após a filtragem e antes da triagem dos núcleos, a amostra contém uma alta quantidade de debris, com mais de 99% dos "singletes" positivos para coloração nuclear (7-AAD), indicando lise celular ótima (Figura 2A). Os núcleos são classificados com base no portão positivo de 7-AAD. Uma fração de material triado é adquirida para verificar a pureza dos núcleos preparados. A Figura 2B mostra o perfil dos núcleos cerebrais após a triagem. A triagem dos núcleos permitiu um aumento na pureza dos núcleos dos 36% iniciais (Figura 2A) para quase 100% (Figura 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig02.jpg"> Figura 2: Estratégia de agrupamento para classificação de núcleos e teste de pureza após a triagem. Os núcleos foram corados com 7-AAD e adquiridos pelo classificador celular. (A) Os núcleos são primeiramente fechados com base em seu tamanho e granularidade (FSC-A e SSC-A, respectivamente). Partículas individuais são então selecionadas com base em suas propriedades FSC-A/FSC-H e coloração 7-AAD. (B) Após a triagem celular, uma fração dos núcleos do tubo de coleta é testada quanto à pureza usando a mesma estratégia de fechamento que em A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Purificação de progenitores de células-tronco hematopoéticas (HSPCs) de medula óssea de camundongos Após o isolamento da medula óssea, até 2 x 105 HSPCs são classificados por FACS, de acordo com a estratégia de gating mostrada na Figura 3A. A eficácia da triagem e a pureza da amostra são avaliadas (Figura 3B).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig03v2.jpg"> Figura 3: Estratégia de gating para triagem de HSPCs de medula óssea. (A) Uma estratégia representativa de agrupamento FACS para a triagem de células-tronco hematopoéticas LKS+ viáveis e progenitores mieloides CD34+ para isolamento de núcleos. (B) Parcelas FACS representativas utilizadas para a verificação da pureza da população celular classificada. São mostradas as proporções de diferentes subconjuntos celulares em relação à população parental. *As duas populações classificadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig03largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O protocolo "Low Cell Input Nuclei Isolation" permite o isolamento de núcleos de amostras com um máximo de 10 a5 células. Inclui um baixo número de etapas de centrifugação, minimizando assim a perda de células/núcleos. Ajustamos o volume de tampões de lise e lavagem proporcionalmente à entrada celular e aumentamos o tempo de centrifugação para máxima recuperação dos núcleos. Realizamos um experimento piloto para avaliar a quantidade de núcleos recuperados por contagem e sua qualidade por citometria de fluxo e microscopia. A Figura 4 mostra a amostra de HSPCs após lise celular. Esse protocolo gerou núcleos de alta qualidade, como observado na Figura 5A, sem detritos que pudessem impactar o protocolo de multioma a jusante.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig04.jpg"> Figura 4: Classificação do teste de pureza dos núcleos isolados de HSPC da medula óssea. Os núcleos foram corados com 7-AAD e adquiridos pelo classificador celular. Os núcleos foram primeiramente fechados com base em seu tamanho e granularidade (FSC-A e SSC-A, respectivamente) para avaliar a pureza da amostra. A proporção de núcleos é indicada em relação à população parental. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Número do tubo</td>
			<td>Nome do tubo</td>
			<td>Entidade manchada</td>
			<td>Quantidade de entidade manchada</td>
			<td>Anticorpo/corante (μL)</td>
			<td>Buffer de coleta (μL)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>Sem manchas</td>
			<td>Células</td>
			<td>5,00,000</td>
			<td>N/A</td>
			<td rowspan="7">200</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>LIVE/DEAD Mancha Aqua Dead Cell</td>
			<td>Células</td>
			<td>5,00,000</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>APC/Cyanine 7 anti-camundongo CD16/32 (FcγR)</td>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>Coquetel de linhagem anti-rato azul do Pacífico</td>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>APC anti-mouse CD117 (c-Kit)</td>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td>FITC anti-mouse CD34</td>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Controles de coloração única para ajustes de compensação no citômetro de fluxo. São indicados os controles de coloração única necessários, o número de células ou contas a serem coradas e as quantidades de anticorpos.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Master Mix</td>
			<td>Reagente</td>
			<td>Diluição final</td>
			<td>Anticorpo/corante (μL)</td>
			<td>Tipo de buffer</td>
			<td>Tampão (μL)</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Mistura 1</td>
			<td>APC/Cyanine 7 anti-camundongo CD16/32 (FcγR)</td>
			<td>1/500</td>
			<td>1.2</td>
			<td rowspan="2">DPBS</td>
			<td rowspan="2">300</td>
		</tr><tr><td>LIVE/DEAD Mancha Aqua Dead Cell</td>
			<td>1/250</td>
			<td>2.4</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Mistura 2</td>
			<td>Coquetel de linhagem anti-rato azul do Pacífico</td>
			<td>1/20</td>
			<td>30</td>
			<td rowspan="4">Buffer FACS</td>
			<td rowspan="4">300</td>
		</tr><tr><td>PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>APC anti-mouse CD117 (c-Kit)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>FITC anti-mouse CD34</td>
			<td>1/50</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Volume total de coloração</td>
			<td>600</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Composição da mistura de coloração para HSPCs de medula óssea. São mostrados os volumes de reagentes necessários para a coloração de uma amostra contendo 40 milhões de células. Para colorir um número maior de amostras, multiplique o volume indicado pelo número necessário de amostras e adicione metade de um volume de amostra extra para garantir um volume suficiente da mistura principal.
Figura suplementar 1: Protocolo de isolamento de células da medula óssea. (A) Abra o peritônio. Linhas pontilhadas brancas indicam a linha a ser cortada. (B) Depois de descascar a pele da pata traseira, forre a tesoura ao longo da coluna vertebral na articulação do quadril para cortar a perna sem cortar o fêmur. (C) A aparência da perna separada do corpo antes da remoção do músculo. (D) O aparecimento da perna após a remoção do músculo. (E) O procedimento para separar o fêmur na articulação do joelho, depois na articulação do quadril, tomando cuidado para não abrir o fêmur. As setas curvas brancas mostram o movimento necessário. (F) Procedimento para abrir a parte distal do fêmur (ou seja, a parte previamente presa à tíbia na articulação do joelho) segurando firmemente a cartilagem e a epífise distal com tesoura e virando-a para trás para expor a medula óssea. (G) Quatro saliências, indicadas por setas pretas, devem ser visíveis na extremidade exposta da fise. (H) A aparência de um fêmur com a extremidade aberta voltada para baixo no tubo preparado de 0,5 mL colocado dentro de um tubo de 1,5 mL contendo 150 μL de tampão FACS. (I) O aparecimento das células da medula óssea peletizadas e do fêmur agora branco após rápida centrifugação a 12.000 x g. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/Moraes-Cabe%20et%20al_Supplementary%20Figure1.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

O sucesso da transcriptômica de célula única/núcleo único e multi-ômica depende em grande parte da qualidade das células/núcleos. Portanto, o isolamento de células/núcleos do tecido e sua purificação devem ser altamente padronizados. Este protocolo descreve a preparação de núcleos do cérebro e da medula óssea para o ensaio de multioma de núcleo único a jusante.

Preparação de Núcleos Cerebrais e de Medula Óssea de Alta Qualidade para Ensaios Multioma de Núcleos Únicos

Single-cell analysis has become the approach of choice for unraveling the complexity of biological processes that require assessing the variability of ...

A Unidade de Tecnologia de Citometria e Biomarcadores apoia projetos biomédicos por meio de tecnologias de ponta e pipelines para fenotipagem celular e perfil molecular com resolução de célula única. Neste contexto, usamos diferentes ferramentas para análise multiômica de célula única para obter insights sobre a expressão gênica e regulação gênica em saúde e doença. A citometria de fluxo identifica e origina células individuais com base em características únicas.Os avanços recentes incluem classificadores espectrais baseados em imagem de alto rendimento, e essas tecnologias oferecem flexibilidade no design do painel, permitem o uso simultâneo de corantes semelhantes e o gerenciamento de autofluorescência. Um grande desafio experimental ao usar tecnologias de ponta de célula única é trabalhar com populações de células particularmente frágeis ou raras. Cada tipo de tecido ou célula precisa passar por uma otimização de protocolo ajustada para obter células altamente viáveis suficientes que se traduzam em dados de sequenciamento de alta qualidade.Nosso protocolo modificado de preparação de núcleos únicos melhora a recuperação dos núcleos e minimiza o estresse sobre os núcleos. Ele é especificamente otimizado para tecidos cerebrais e da medula óssea e cobre todas as etapas desde a dissociação da amostra até a purificação dos núcleos.

high-quality-brain-bone-marrow-nuclei-preparation-for-single-nuclei

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A heterogeneidade intra-tumoral é uma característica inerente aos tumores, incluindo gliomas. Desenvolvemos um protocolo simples e eficiente que utiliza uma combinação de buffers e centrífugas gradientes para isolar núcleos únicos de tecidos glioma congelados frescos para estudos de sequenciamento de núcleo único RNA e ATAC.

Isolamento de núcleos de tumores cerebrais congelados frescos para RNA-seq de núcleo único e ATAC-seq

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar núcleos de tecidos hepáticos arquivados congelados por flash para RNA-seq, ATAC-seq de núcleo único e multiômica articular (RNA-seq e ATAC-seq).

Isolamento de núcleos de tecido hepático congelado por flash para multiômica unicelular

O estudo descreve um protocolo simples, rápido e parcialmente automatizado para isolar núcleos de alta qualidade de tecidos congelados de mamíferos para sequenciamento de RNA de núcleo único a jusante.

Um Protocolo Simples, Rápido e Parcialmente Automatizado para o Isolamento de Núcleos Únicos de Tecidos Congelados de Mamíferos para Sequenciamento de Núcleo Único

O protocolo fornece uma abordagem confiável e otimizada para o isolamento de núcleos de espécimes tumorais sólidos para sequenciamento de multioma usando a plataforma 10x Genomics, incluindo recomendações para condições de dissociação tecidual, criopreservação de suspensões unicelulares e avaliação de núcleos isolados.

Isolamento Otimizado de Núcleos de Espécimes Sólidos Documentais e Congelados para Sequenciamento Multioma

A heterogeneidade celular de tecido cerebral representa uma limitação significativa para o estudo de marcas epigenéticas na cromatina porque a maioria dos ensaios falta de resolução única célula. Neurônios são normalmente misturados com glia e outras células não-neuronais. Nós fornecemos um protocolo para extrair e coletar núcleos neuronal do cérebro humano.

Isolamento Núcleos neuronais de Tecidos Humanos Postmortem Cérebro

Este procedimento descreve como estabelecer culturas primárias de células hematopoiéticas da medula óssea de camundongos e é seguido por transfecção usando o Gene Pulser sistema de eletroporação MXCell.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

Este artigo descreve um protocolo usado para estudar o homing das células hematopoiéticas para seus nichos na medula óssea.

Homing das células hematopoiéticas da medula óssea

Nós descrevemos um processo que utiliza laser de captura de microdissecção para isolar e extrair RNA de uma população de células homogêneas, neurônios piramidais, na camada III do giro temporal superior em cérebros post-mortem humano. Nós posteriormente linearmente amplificar (T7-based) mRNA, e hibridizar a amostra para o ser humano Affymetrix X3P microarray.

Obtenção de RNA de alta qualidade a partir de populações de células no tecido humano único post-mortem do cérebro

Tecidos de Drosophila contêm muitas vezes uma mistura heterogénea de tipos celulares. Para examinar a expressão de genes em tipos específicos de células a partir de um tecido em particular, os núcleos podem ser geneticamente marcado e, subsequentemente, isolado usando uma abordagem baseada em afinidade. Isolado núcleos pode ser utilizado para aplicações a jusante, tais como a análise de expressão génica e imunoprecipitação da cromatina.

Isolamento à base de Afinidade de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos para Análise de Expressão Gênica

Os osteoclastos são as células de reabsorção óssea principais no corpo. Uma capacidade de isolar os osteoclastos em grandes números resultou em avanços significativos na compreensão da biologia dos osteoclastos. Neste protocolo, nós descrevemos um método para o isolamento, cultivo e quantificar a actividade dos osteoclastos in vitro.

Osteoclastos Derivação do mouse Medula Óssea

Aprenda a preparar núcleos cerebrais e de medula óssea de alta pureza para ensaios multioma de núcleos únicos. Este protocolo otimizado melhora a recuperação celular e a qualidade dos dados de sequenciamento.

Preparação de Núcleos Cerebrais e de Medula Óssea de Alta Qualidade para Ensaios Multioma de Núcleos Únicos

Explorar mais vídeos