Name: Isolamento, expansão in vitro e caracterização de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo epididimal de camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T13:05:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Aprenda o isolamento e caracterização de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo epididimal de camundongos Swiss. Este protocolo demonstra potencial terapêutico no controle de inflamação e infecção por Schistosoma mansoni.

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Pesquisa apoiada por bolsa do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (480807/2011-6) e Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11). Este estudo foi financiado em parte pelo PROPP UESC (073.6764.2019.0021079-85). MGAG e URS graças à bolsa concedida pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), respectivamente.

Cultura primária de células-tronco derivadas do tecido adiposo do epidídimo de camundongo

<ol><li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells.</a> J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).</li>
<li>Pittenger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+perspective%3A+cell+biology+to+clinical+progress%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress.</a> npj Regen Med. 4, 22(2019).</li>
<li>Lin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+and+cancer%3A+Clinical+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells and cancer: Clinical challenges and opportunities.</a> BioMed Res Int. 2820853, 1-12 (2019).</li>
<li>Mazini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hopes+and+limits+of+adipose-derived+stem+cells+%28ADSCs%29+and+mesenchymal+stem+cells+%28MSCs%29+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Hopes and limits of adipose-derived stem cells (ADSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) in wound healing.</a> Int J Mol Sci. 21 (4), 1306(2020).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+mechanisms+of+mesenchymal+stem+and+stromal+cells+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases.</a> Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).</li>
<li>Uccelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+tissue-derived+small+extracellular+vesicles+promote+soft+tissue+repair+through+modulating+M1-to-M2+polarization+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Human adipose tissue-derived small extracellular vesicles promote soft tissue repair through modulating M1-to-M2 polarization of macrophages.</a> Stem Cell Res Ther. 14 (1), 67(2023).</li>
<li>Maffioli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+the+secretome+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+primed+by+pro-inflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of the secretome of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells primed by pro-inflammatory cytokines.</a> J. Proteomics. 166, 115-126 (2017).</li>
<li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal-stem-cell-induced+immunoregulation+involves+FAS-ligand-%2FFAS-mediated+T+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis.</a> Cell Stem Cell. 10, 544-555 (2012).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+mesenchymal+stem+cells+in+immunomodulation%3A+pathological+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications.</a> Nat Immunol. 15, 1009-1016 (2014).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+vs.+autologous+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+in+their+medication+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">Allogeneic vs. autologous mesenchymal stem/stromal cells in their medication practice.</a> Cell Biosci. 11, 187(2021).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+and+promises+of+allogeneic+mesenchymal+stem+cells+for+use+as+a+cell-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">The challenges and promises of allogeneic mesenchymal stem cells for use as a cell-based therapy.</a> Stem Cell Res Ther. 6, 234(2015).</li>
<li>Jurado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+mesenchymal+stromal+cells+as+part+of+therapy+for+chronic+graft-versus-host+disease%3A+A+phase+I%2FII+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells as part of therapy for chronic graft-versus-host disease: A phase I/II study.</a> Cytotherapy. 19 (8), 927-936 (2017).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+exosome-educated+macrophages+alleviate+systemic+lupus+erythematosus+by+promoting+efferocytosis+and+recruitment+of+IL-17%2B+regulatory+T+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived exosome-educated macrophages alleviate systemic lupus erythematosus by promoting efferocytosis and recruitment of IL-17+ regulatory T cell.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 484(2022).</li>
<li>Fernández, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+%28AdMSC%29+for+the+treatment+of+secondary-progressive+multiple+sclerosis%3A+A+triple+blinded%2C+placebo+controlled%2C+randomized+phase+I%2FII+safety+and+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived mesenchymal stem cells (AdMSC) for the treatment of secondary-progressive multiple sclerosis: A triple blinded, placebo controlled, randomized phase I/II safety and feasibility study.</a> PLoS One. 13 (5), 0195891(2018).</li>
<li>Abdolmohammadi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-based+therapy+as+a+new+therapeutic+approach+for+acute+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-based therapy as a new therapeutic approach for acute inflammation.</a> Life Sci. 312, 121206(2023).</li>
<li>Hoang, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+therapy+for+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based therapy for human diseases.</a> Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 272(2022).</li>
<li>Lee, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+expression+analysis+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+bone+marrow+and+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue.</a> Cell Physiol Biochem. 14 (4-6), 311-324 (2004).</li>
<li>Strem, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotential+differentiation+of+adipose+tissue+derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Keio+J+Med%22%5BJournal%5D)">Multipotential differentiation of adipose tissue derived stem cells.</a> Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).</li>
<li>Kern, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+mesenchymal+stem+cells+from+bone+marrow%2C+umbilical+cord+blood%2C+or+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue.</a> Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).</li>
<li>Dominici, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Berryman, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+hormone%27s+effect+on+adipose+tissue%3A+Quality+versus+quantity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Growth hormone's effect on adipose tissue: Quality versus quantity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1621(2017).</li>
<li>Shomer, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+rodent+euthanasia+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Review of rodent euthanasia methods.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 59 (3), 242-253 (2020).</li>
<li>Miranda, V. H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+damage+in+schistosomiasis+is+reduced+by+adipose+tissue-derived+stem+cell+therapy+after+praziquantel+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Liver damage in schistosomiasis is reduced by adipose tissue-derived stem cell therapy after praziquantel treatment.</a> PLoS Negl Trop Dis. 14 (8), e0008635(2020).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+primary+bone+marrow+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of primary bone marrow mesenchymal stromal cells.</a> Ann N Y Acad Sci. 1370 (1), 109-118 (2016).</li>
<li>Boregowda, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1416, 205-223 (2016).</li>
<li>Sreejit, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li>
<li>Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Cells. 10 (12), 3433(2021).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

As CTMs podem ser extraídas de diferentes tecidos. Apesar de a medula óssea representar uma fonte comum de CTMs em murinos e humanos25,26, optamos por trabalhar com tecido adiposo neste estudo devido à sua riqueza em CTMs, distribuição no corpo e facilidade de acesso. Como alternativa, as células-tronco derivadas do tecido adiposo podem ser usadas para gerar células imortalizadas semelhantes a MSCs27.
Alguns pontos da extração merecem atenção especial pelo sucesso dos protocolos aqui compartilhados. Primeiramente, destacamos os cuidados com a coleta do tecido que devem ser feitos em condições assépticas. Portanto, certifique-se de que os camundongos estejam devidamente desinfetados com álcool 70% antes de iniciar a cirurgia. Outro ponto importante é não utilizar o mesmo conjunto de pinças e tesouras para pegar o tecido adiposo do epidídimo, evitando assim qualquer fonte de contaminação. 
Uma segunda preocupação é o processamento do tecido. Os fragmentos no tubo cónico devem ser agitados de forma adequada e vigorosa com 10 min de incubação a 37 °C. É muito importante mudar o meio no dia seguinte e depois a cada 2-3 dias. Recomenda-se observar a cultura diariamente, verificando a cor do meio, a forma da célula e qualquer interferência no ambiente da cultura. 
Uma terceira preocupação é em relação ao melhor tempo/passagem para caracterização das CTM. Aqui, recomendamos fazê-lo na terceira passagem das células, mas isso não é obrigatório. Depende do objetivo do estudo. Na terceira passagem, temos cerca de 80% das células caracterizadas como MSCs, o que é suficiente para os objetivos deste estudo, por exemplo. A caracterização fenotípica é realizada por meio da análise da expressão de marcadores hematopoiéticos (CD34 e CD45, por exemplo) e marcadores mesenquimais (CD29, CD73, CD90 e CD105, por exemplo). Além disso, a International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT)21 destaca que as ADSCs devem ter morfologia semelhante a fibroblastos e aderir ao plástico da plataforma de cultura. A morfologia pode ser observada ao microscópio durante a cultura de crescimento. A caracterização funcional é realizada analisando o potencial das ADSCs para se diferenciarem em células osteoblásticas, adipoblásticas e condroblastas. Na caracterização fenotípica, a porcentagem de marcadores mesenquimais e hematopoiéticos pode variar de acordo com a espécie animal e fonte celular, não atendendo totalmente aos números recomendados pelo ISCT. Por exemplo, o ISCT recomenda para CTMs humanas ≥95% de CD105, CD73, CD90 e ≤2% de CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79a ou CD19, antígeno leucocitário humano - Disótipo DR (HLA-DR)21. Além disso, é importante fazer a caracterização funcional e confirmar a multipotência das células que se diferenciam em osteoblastos, condrócitos e linhagens de adipócitos. Pelo menos duas dessas linhagens são recomendadas para provar a multipotência. 
Além desses pontos destacados, alguns ensaios sugeridos aqui podem ser substituídos, por exemplo, Vermelho de Alizarina S em vez de coloração de Von Kossa, Shiff de ácido periódico em vez de Azul de Alcian e reação em cadeia da polimerase (PCR) em vez de citometria de fluxo. 
Dentre os três tipos de tecido adiposo descritos em humanos (branco, marrom e bege), o tecido adiposo branco é o que apresenta a maior fonte deCTM28. Esse tecido pode ser obtido nas regiões subcutânea, abdominal e inguinal, como a gordura acima do epidídimo relatada aqui. A fragmentação física e a digestão enzimática pela colagenase utilizada no protocolo aqui compartilhado derivam a fração vascular estromal (SVF) composta por vários tipos celulares, exceto os adipócitos, que são depletados durante o processamento. 
Em conclusão, as principais vantagens do uso do tecido adiposo como fonte de CTMs incluem sua abundância e facilidade de métodos para isolamento celular, associados ao potencial terapêutico das CTMs como propriedades anti-inflamatórias e regenerativas.

As células-tronco mesenquimais (CTMs) são células adultas multipotenciais que se diferenciam em células como osteoblastos, condroblastos e adipócitos 1,2. Essas células residem em vários órgãos e, por isso, podem ser extraídas de tecidos adultos, como medula óssea, músculo, gordura, folículo piloso, raiz do dente, placenta, derme, pericôndrio, cordão umbilical, pulmão, fígado e baço 3,4.
Os efeitos das CTMs na fisiologia e no sistema imunológico têm sido relatados 5,6. Essas células têm sido promissoras para o tratamento de diversas doenças, tanto na medicina humana quanto veterinária. As CTMs podem controlar a inflamação e promover a angiogênese e a homeostase tecidual por meio de diferentes mecanismos, como contato célula-célula, fatores solúveis e pequenas vesículas extracelulares 7,8,9,10. Além disso, as CTMs são células imunoprivilegiadas capazes de sobreviver em receptores de transplante alogênico imunologicamente incompatíveis, pois essas células apresentam baixa expressão de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e são utilizadas em terapia celular para transplante alogênico 11,12. A baixa imunogenicidade combinada com o potencial regenerativo torna as CTMs candidatas ideais para terapia celular, como doença do enxerto contra o hospedeiro (GvHD)13, lúpus eritematoso sistêmico (LES)14 e esclerose múltipla15, entreoutras16,17.
Apesar de as CTMs residirem em vários tecidos adultos, o tecido adiposo oferece vantagens em relação a outras fontes, como acessibilidade para a captação, com mínima intervenção cirúrgica; grande número de células disponíveis com alta taxa de expansão; e fácil expansão in vitro usando um protocolo de fácil execução, sem a necessidade de equipamentos específicos e materiais de baixo custo 18,19,20. Uma vez extraídas, as células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs) devem ser caracterizadas conforme estabelecido pela International Society for Cellular Therapy (ISCT)21. Assim, as CTMs devem apresentar morfologia semelhante a fibroblastos, aderência à cultura plástica, expressando uma alta porcentagem (≥95%) de marcadores mesenquimais, como endoglina (CD105), ecto-5'-nucleotidase (CD73) e Thy-1 (CD90), e baixa porcentagem (≤2%) de marcadores hematopoiéticos, como antígeno comum leucocitário (CD45), fosfoglicoproteína transmembrana (CD34), glicoproteína de membrana ancorada em glicolipídios (CD14), integrina alfa M (CD11b), cadeia alfa da proteína associada ao complexo receptor de antígeno de células B (CD79α) ou Antígeno de superfície de linfócitos B B4 (CD19) e antígeno leucocitário humano de classe II (HLA-II). Além disso, é necessária uma caracterização funcional, e as células devem ser capazes de se diferenciar em células osteoblásticas, condroblásticas ou adipoblásticas21.
Aqui, mostramos como obter as CTMs do tecido adiposo epididimal usando dissociação mecânica e digestão enzimática para estudos in vitro e a caracterização morfológica preconizada por ISCT.

<table><tbody><tr><td>140 &deg; C Incubadora de CO2 de esterilização por alta temperatura</td><td>RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, China</td><td>C180</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>I7018</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>PHR1748</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>A9186</td><td>BioReagent, adequado para detecção de glicoproteínas. 1% em ácido acético, pH 2,5</td></tr><tr><td>Álcool 70%</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>65350-M</td><td>70% em água</td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>PHR1662</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos anti-camundongo anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)</td><td>BD Biosciences, San Diego, CA, EUA</td><td>555005</td><td>Funções na célula: Adesão e ativação, embriogênese, leucócitos, DC, plaquetas, mastócitos, fibroblastos e células endoteliais</td></tr><tr><td>Anticorpos anti-camundongo anti-CD34 PE (Clone RAM34)</td><td>BD Biosciences, San Diego, CA, EUA</td><td>551387</td><td>Funções na célula: Fator de adesão celular. Células-tronco hematopoiéticas</td></tr><tr><td>Anticorpos anti-camundongo anti-CD45 APC (Clone 30-F11)</td><td>BD Biosciences, San Diego, CA, EUA</td><td>559864</td><td>Funções na célula: Auxilia na ativação de leucócitos</td></tr><tr><td>Anticorpos anti-camundongo anti-CD71 FITC (Clone C2)</td><td>BD Biosciences, San Diego, CA, EUA</td><td>553266</td><td>Funções na célula: Controla a captação de ferro durante a proliferação celular. Proliferação de células, reticulócitos e precursores Anticorpos</td></tr><tr><td>anti-camundongo anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)</td><td>BD Biosciences, San Diego, CA, EUA</td><td>557266</td><td>Funções na célula: Sinalização, adesão. Linfócito T, NK, monócito, HSC, neurônio, fibroblasto</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>PHR1008</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas automáticas</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA</td><td>4700850N</td><td>Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP)</td></tr><tr><td>Kits Béquer</td><td>Não aplicável</td><td></td><td>1 unidade</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células (6 poços)</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>Z707759</td><td>07 unidades estéreis. Placas de cultura de tecidos TPP</td></tr><tr><td>Placas de cultura de células (96 poços. Parte inferior redonda ou em V)</td> <td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>CLS353077</td><td>01 unidade estéril. Wells, 96, superfície tratada com cultura de tecidos (TC), poços transparentes de fundo redondo,</td></tr><tr><td>meio condrogênico</td> estéril <td>Stem Pro Chondrogenesis Differentiation&ndash; Tecnologias de Vida</td><td>A1007101</td><td>TGF-&beta; 2, TGF-&beta; 3, dexametasona, insulina, transferrina, ITS, l-sódio - ascorbato, piruvato de sódio, ascorbato-2-fosfato</td></tr><tr><td>Colagenase tipo II</td><td>Life Technologies, Califórnia, EUA</td><td>17101015 placa de</td><td></td></tr><tr><td>cortiça ou isopor revestida com alumínio</td><td>Não aplicável</td><td></td><td>1 unidade</td></tr><tr><td>de algodão</td><td>Não aplicável</td><td></td><td>50 g</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>Não aplicável</td><td></td><td>03 unidades estéreis</td></tr><tr><td>DPX Mountant para histologia</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia modificada' s meio (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>D5523</td><td>Com 1000 mg/L de glicose e L-glutamina, sem bicarbonato de sódio, pó, adequado para cultura de células</td></tr><tr><td>Eosina B</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>861006</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>47608</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>H3136</td><td></td></tr><tr><td>Agulha Hipodérmica (0,3 mm x 13 mm)</td><td>Não aplicável</td><td></td><td>5 unidades</td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>I0200000</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>563935</td><td>70% em</td></tr><tr><td>solução de cloridrato de cetamina-D4</td> H2O <td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>K-006</td><td>1,0 mg/mL em metanol (como base livre), material de referência certificado, Cerilliant&reg;</td></tr><tr><td>Câmara Neubauer</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>BR718620</td><td>Câmara de contagem de MARCA BLAUBRAND Neubauer padrão. Com clipes,</td></tr><tr><td>pontas de pipeta Nichiryo de régua dupla (0.1&ndash; 10 &mu; L)</td> <td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>Z645540</td><td>Faixa de volume 0,1- 10 &mu; L, alongado, embalagem a granel. Pontas de pipeta Nichiryo estéreis</td></tr><tr><td>(1&ndash; 10 mL)</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>Z717401</td><td>Faixa de volume 1&ndash; 10 mL, universal, embalagem a granel. Ponteiras de</td></tr><tr><td>pipeta Nichiryo estéreis (200 &mu; L)</td> <td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>Z645516</td><td>Volume máximo 200 &mu; L, graduado, ministack. Solução estéril</td></tr><tr><td>de óleo-vermelho O</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>O1391</td><td>0,5% em parafina isopropanol</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>107,151</td><td>46&ndash; 48, em forma de</td></tr><tr><td>bloco Penicilina/Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>P4333</td><td>Solução estabilizada, com 10.000 unidades de penicilina e 10 mg de estreptomicina/mL, 0,1 &mu; m filtrado, BioReagent, adequado para cultura de células</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS).</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>P3813</td><td>Pó, pH 7,4, para preparar soluções de 1 L. Tubos cônicos de polipropileno balanceados e estéreis</td></tr><tr><td>(15 mL)</td><td>Falcon, Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td> Tubos cônicos <td>de polipropileno estéreis</td></tr><tr><td>(50 mL)</td><td>Falcon, Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>2 unidades de</td></tr><tr><td>bisturi estéril (opcional)</td><td>Não aplicável</td><td></td><td>1 unidade</td></tr><tr><td>de nitrato de prata</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>85228</td><td></td></tr><tr><td>Tiossulfato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Pinça cirúrgica (15 cm)</td> <td>Não aplicável</td><td></td><td>3 unidades de</td></tr><tr><td>camundongos Swiss machos estéreis (6&ndash; 8 semanas)</td><td>Bioterium, Santa Cruz State University</td><td>021/22</td><td></td></tr><tr><td>seringa (1 mL)</td><td>Não aplicável</td><td></td><td>1 unidade</td></tr><tr><td>Trypan Blue Dye</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>T8154</td><td>0,4%, líquido, filtrado estéril, adequado para cultura celular</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA (ácido etilenodiaminotetracético)</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>PHR3263</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato sal dissódico hidratado</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA</td><td>G9422</td><td>BioUltra, adequado para cultura de células, adequado para cultura de células vegetais, &ge; 99% (titulação)</td></tr></tbody></table>

isolamento, expansão in vitro e caracterização de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo epididimal de camundongos

Isolation, In Vitro Expansion, and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissue

As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm sido extensivamente estudadas como uma nova abordagem terapêutica, principalmente para interromper a inflamação exacerbada devido ao seu potencial de modular a resposta imune. As CTMs são células imunoprivilegiadas capazes de sobreviver em receptores de transplante alogênico imunologicamente incompatíveis com base na baixa expressão de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e no uso de terapia baseada em células para transplante alogênico. Essas células podem ser isoladas de vários tecidos, sendo os mais comumente utilizados a medula óssea e os tecidos adiposos. Fornecemos um protocolo fácil para isolar, cultivar e caracterizar MSCs do tecido adiposo epididimal de camundongos. O tecido adiposo epididimal é excisado cirurgicamente, fisicamente fragmentado e digerido com solução de colagenase tipo II a 0,15%. Em seguida, células-tronco derivadas do tecido adiposo primário (ADSCs) são cultivadas e expandidas in vitro, e a caracterização fenotípica é realizada por citometria de fluxo. Também fornecemos as etapas para diferenciar as ADSCs em células osteogênicas, adipogênicas e condrogênicas, seguidas pela caracterização funcional de cada linhagem celular. O protocolo fornecido aqui pode ser usado para experimentos in vivo e ex vivo e, como alternativa, as células-tronco derivadas do tecido adiposo podem ser usadas para gerar células imortalizadas semelhantes a MSCs.

As células extraídas do tecido adiposo de acordo com o protocolo aqui apresentado apresentaram morfologia compatível com os critérios mínimos para CTMs propostos pelo ISCT. Uma visão geral do protocolo é mostrada na Figura 1. Fenotipicamente, as ADSCs mostraram aderência à morfologia plástica e semelhante a fibroblastos nos primeiros dias de cultura celular (Figura 2A). Além disso, eles cresceram de forma homogênea e formaram colônias. Além disso, as ADSCs apresentaram baixa expressão de CD34 (2,12%) e CD45 (1,81%), ambos marcadores hematopoiéticos, e alta expressão de CD71 (42,6%), CD29 (74,2%) e CD90 (55,1%), todos marcadores de células mesenquimais (Figura 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65722/65722fig02.jpg"> Figura 2: Caracterização fenotípica de células derivadas do tecido adiposo. (A) Morfologia das ADSCs mudando de redonda para semelhante a fibroblastos nos dias 2, 4 e 8 da cultura; barra de escala = 22,22 μm. (B) Histogramas para marcadores expressos (CD71, CD29 e CD90) ou não (CD34 e CD45) por ASC. Essa figura foi reproduzida com permissão de Miranda et al.24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65722/65722fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Funcionalmente, as ADSCs mostraram multipotência para se diferenciar em osteoblastos, adipoblastos e condroblastos quando cultivadas em meio condicionado para cada linhagem por 14 ou 21 dias (Figura 3). A coloração de Von Kossa revelou nódulos mineralizados na matriz extracelular, característicos do processo de osteogênese (Figura 3). A coloração Óleo-vermelho O evidenciou vacúolos lipídicos no citoplasma das ADSCs, e a coloração Alcian Blue confirmou a presença de glicosaminoglicanos na matriz extracelular (Figura 3). Juntas, características fenotípicas e funcionais confirmaram a população de células extraídas do tecido adiposo epididimal como CTMs.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65722/65722fig03.jpg"> Figura 3: Caracterização funcional de células derivadas do tecido adiposo. Potencial osteogênico, adipogênico e condrogênico de múltiplas linhagens de ADSC após 14 e 21 dias de cultivo. Barra de escala = 50 μm (painel superior), 100 μm (painéis central e inferior). Essa figura foi reproduzida com permissão de Miranda et al.24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65722/65722fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O tecido adiposo é uma excelente fonte de células-tronco mesenquimais. Aqui, trazemos a extração, cultivo e caracterização passo a passo de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs) do tecido adiposo epididimal de camundongos suíços.

Isolamento, expansão in vitro e caracterização de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo epididimal de camundongos

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been extensively studied as a new therapeutic approach, mainly to stop exacerbated inflammation due to their potential ...

Minha pesquisa se concentra em células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo como uma nova abordagem de tratamento associada ou não a outras terapias para melhorar a inflamação de várias doenças. Demonstramos que o uso de células-tronco mesenquimais adiposas em conjunto com o Praziquantel controlou significativamente a reação granulomatosa na infecção por Schistosoma mansoni, destacando os benefícios dessa abordagem de tratamento combinado. Nosso protocolo aborda a lacuna de pesquisa na coleta meticulosa de tecido adiposo epididimal sob condições assépticas, que o processamento físico envolve agitação vigorosa e identifica o momento ideal para a utilização de células-tronco derivadas do tecido adiposo.Nosso protocolo oferece vantagens significativas, notadamente a disponibilidade abundante e a força potencial para o isolamento de células-tronco mesenquimais. Além disso, as células-tronco mesenquimais apresentam propriedades terapêuticas potentes, incluindo capacidades anti-inflamatórias e de regeneração tecidual.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra uma técnica para isolar e cultivar células-tronco derivadas do tecido adiposo do arco periaórtico murino marcadas com fluorescência (ADSCs) do tecido adiposo do arco periaórtico murino. Após o isolamento, os NCADSCs são detectados, classificados usando classificação de células ativadas por fluorescência e, posteriormente, cultivados em uma placa, promovendo a proliferação celular.

Isolando células-tronco derivadas de tecido adiposo do tecido adiposo periaórtico murino

Apresenta-se um protocolo para isolar fragmentos microvasculares derivadas de tecido adiposo que representam unidades de vascularização promissores. Eles podem ser isolados rapidamente, não requerem processamento in vitro e, assim, pode ser utilizado para prevascularization um passo em diferentes campos da engenharia de tecidos.

Isolamento de Murino adiposo derivada de tecido microvascular Fragmentos como Vascularização Unidades para engenharia de tecidos

Este protocolo fornece um método livre de enzimas para isolar as células-tronco mesenquímicas de abdominoplastia e amostras lipoaspirate usando um método explant. A ausência de enzimas duras ou etapas de centrífuga fornece células-tronco clinicamente relevantes que podem ser usadas para estudos in vitro ou transferidas de volta para a clínica.

Um método sem enzimas para isolamento e expansão de células-tronco mesenchymal derivadas do adiposo humano

Este protocolo descreve a abordagem técnica para isolar subpopulações de células estromais adipogênicas e fibroinflamatórias de depósitos de tecido adiposo branco intra-abdominal murino (WAT) por classificação de células ativadas por fluorescência ou separação de esferas imunomagnéticas.

Isolamento de Subpopulações de Células Estromais Adipogênicas e Fibro-Inflamatórias de Depósitos Adiposos Intra-Abdominais Murinos

Apresentamos um método simples para isolar células progenitoras adiposas altamente viáveis de almofadas de gordura epidímica do rato usando a triagem celular ativada por fluorescência.

Preparação de células progenitoras adiposas adiposas de tecidos adiposos epidímicos do rato

Células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (Ad-MSCs) podem ser uma fonte potencial de MSCs que se diferenciam em células produtoras de insulina (IPCs). Neste protocolo, fornecemos passos detalhados para o isolamento e caracterização de Ad-MSCs epidímicas de ratos, seguidos de um protocolo simples e curto para a geração de IPCs a partir dos mesmos Ad-MSCs de ratos.

Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido adiposo de rato para diferenciação em células produtoras de insulina

Este protocolo descreve uma metodologia para isolar e identificar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do tecido adiposo de ratos Sprague Dawley.

Isolamento e Identificação de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Tecido Adiposo de Ratos Sprague Dawley

Endotelial colônia formando células progenitoras (ECFCs) são uma ferramenta promissora para o estudo da homeostase vascular e reparação.

Isolamento e expansão em grande escala de Adulto Humanos endotelial Colony Células Progenitoras Forming

Este protocolo descreve o isolamento ea subsequente expansão de células mesenquimais estromais e as células endoteliais que formam colônias sem o uso de animais soro autólogo para gerar pares para fins de transplante experimental.

Isolamento e animais de Expansão de soro livre de cordão umbilical humano Derivado células mesenquimais estromais (MSCs) e endoteliais Células Progenitoras Colony Forming (ECFCs)

Neste artigo, vamos demonstrar o isolamento de murino residente de pulmão de células-tronco mesenquimais (MSC pulmão), sua expansão, caracterização e análise de propriedades imunomoduladores.

Isolamento &amp; Caracterização da Hoechst Baixa CD45 Negativo Mouse Células-Tronco Mesenquimais de pulmão

Aprenda o isolamento e caracterização de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo epididimal de camundongos Swiss. Este protocolo demonstra potencial terapêutico no controle de inflamação e infecção por Schistosoma mansoni.

Isolamento, expansão in vitro e caracterização de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo epididimal de camundongos

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