Name: Identificação do Tipo de Fibra do Músculo Esquelético Humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprenda a técnica MyDoBID para isolar fibras musculares de amostras liofilizadas de músculo esquelético humano e classificá-las por isoformas de cadeia pesada de miosina. Este método permite analisar diferenças de expressão proteica específicas de cada tipo de fibra.

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Os anticorpos contra MHC I (A4.840) e MHCIIa (A4.74) utilizados neste estudo foram desenvolvidos pelo Dr. H. M. Blau e o anticorpo contra MHCIIx (6H1) foi desenvolvido pelo Dr. C. A. Lucas e obtido do Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), graças aos auspícios do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano e mantido pela Universidade de Iowa, Departamento de Ciências Biológicas (Iowa City, IA). Agradecemos a Victoria L. Wyckelsma por fornecer as amostras de músculo humano para este estudo. A maioria das imagens da Figura 1 provinha de BioRender.com.
Financiamento: Este estudo não recebeu financiamento externo.

MyDoBID - Uma nova técnica para identificar tipos de fibras musculares de forma eficiente

<ol><li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), e35273(2012).</li>
<li>Wyckelsma, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+specific+differences+in+the+protein+abundances+of+GAPDH+and+Na%28%2B%29%2CK%28%2B%29-ATPase+in+skeletal+muscle+from+aged+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals.</a> Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).</li>
<li>Morales-Scholz, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+type-specific+autophagy+responses+following+an+overnight+fast+and+mixed+meal+ingestion+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).</li>
<li>Tripp, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+fibre+type-dependent+nature+of+calcium-handling+protein+responses+to+sprint+interval+exercise+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle.</a> The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).</li>
<li>Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+cell-specific+differences+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256(2022).</li>
<li>Murphy, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+skeletal+muscle+calpain-3+by+eccentric+exercise+in+humans+does+not+result+in+its+translocation+to+the+nucleus+or+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol.</a> Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).</li>
<li>Murphy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+technique+to+measure+proteins+in+single+segments+of+human+skeletal+muscle+fibers%3A+fiber-type+dependence+of+AMPK-alpha1+and+-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1.</a> Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).</li>
<li>Christiansen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+reliable+and+sample-sparing+method+to+identify+fibre+types+of+single+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6473(2019).</li>
<li>Skelly, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+fiber+type-specific+responses+to+sprint+interval+and+moderate-intensity+continuous+exercise%3A+acute+and+training-induced+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes.</a> Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).</li>
<li>Bergstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+electrolytes+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Clinical+and+Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Muscle electrolytes in man.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. (SUPPL. 68), 1-110 (1962).</li>
<li>Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suction+applied+to+a+muscle+biopsy+maximizes+sample+size%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%26+Science+in+Sports+%26+Exercise%22%5BJournal%5D)">Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size.</a> Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).</li>
<li>Wyckelsma, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+skeletal+muscle+mitochondrial+content+in+older+adults%3A+relationship+between+mitochondria%2C+fibre+type+and+high-intensity+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training.</a> The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).</li>
<li>Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+type+populations+and+Ca2%2B-activation+properties+of+single+fibers+in+soleus+muscles+from+SHR+and+WKY+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).</li>
<li>Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+considerations+for+protein+analyses+using+antibody+based+techniques%3A+down-sizing+Western+blotting+up-sizes+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes.</a> The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).</li>
<li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).</li>
<li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Coleção de fibras Com base em vários anos de experiência, a maioria dos pesquisadores pode dominar essa técnica; no entanto, a prática leva a uma coleta de fibra mais rápida e eficiente para análises a jusante. Para poder isolar 30 segmentos de fibra única de qualidade para pooling, recomenda-se que sejam coletados 50 segmentos de fibra por amostra. Estudar o vídeo de coleta de fibras cuidadosamente e depois de realizar duas sessões de prática (~50 fibras por sessão) é recomendado para alcançar um pad...

O músculo esquelético é um tecido heterogêneo, com propriedades metabólicas e contráteis celulares distintas que dependem se a célula (fibra) é de contração lenta (tipo I) ou contração rápida (tipo II). O tipo de fibra pode ser identificado examinando-se as isoformas da cadeia pesada da miosina (MHC), que diferem entre si de várias maneiras, incluindo tempo de contração, velocidade de encurtamento e resistência à fadiga1. As principais isoformas de MHC incluem tipo I, tipo IIa, tipo IIb e tipo IIx e seus perfis metabólicos são oxidativos (tipo I e IIa) ou glicolíticos (IIx, IIb)1. A proporção desses tipos de fibras varia no tipo muscular e entre as espécies. O tipo IIb é amplamente encontrado no músculo de roedores. A musculatura humana não contém fibras do tipo IIb e é constituída predominantemente pelas isoformas MHC do tipo I e IIa, com pequena proporção de fibras IIx2. Os perfis de expressão proteica variam entre os diferentes tipos de fibras e podem ser alterados com o envelhecimento3, exercício 4,5 e doença 6.
A medição das respostas celulares em diferentes tipos de fibras musculares esqueléticas é frequentemente negligenciada ou não é possível devido ao exame de homogeneizados musculares (uma mistura de todos os tipos de fibras). O western blot de fibra única permite a investigação de múltiplas proteínas em fibras musculares individuais7. Esta metodologia foi previamente utilizada para produzir características novas e informativas de monofibra que não foram possíveis de obter usando preparações homogeneizadas. No entanto, existem algumas limitações da metodologia original de western blot de fibra única, incluindo a natureza demorada, a incapacidade de gerar réplicas de amostra e o uso de reagentes de quimioluminescência aprimorada (ECL) caros e sensíveis. Se o tecido fresco está sendo usado, este método é ainda mais limitado devido às restrições de tempo da necessidade de isolar fibras individuais dentro de um período de tempo limitado (ou seja, 1-2 h). Felizmente, essa restrição é atenuada pelo isolamento de segmentos monofibrosos do tecido liofilizado8. No entanto, a coleta de fibras de amostras liofilizadas é limitada pelo tamanho e qualidade do tecido biopsiado.
A identificação do tipo de fibra usando o método dot blotting9 foi significativamente elaborada e expandida neste protocolo abrangente. Previamente, foi demonstrado que apenas ~2-10 mg de tecido muscular de peso úmido é adequado para liofilização e análise de proteína de isoforma MHC de fibra única9. Christensen et al.9 utilizaram 30% de um segmento de fibra de ~1 mm para detectar a isoforma MHC presente por dot blotting, o que foi confirmado por western blotting. Este trabalho mostrou que, ao substituir o western blotting pelo dot blotting, os custos totais foram reduzidos em ~40 vezes (para 50 segmentos de fibra). As fibras foram então "agrupadas" em amostras do tipo I e tipo II, o que permitiu a replicação experimental9. No entanto, uma limitação foi que apenas duas amostras específicas do tipo de fibra foram obtidas: tipo I (MHCI positivo) e tipo II (MHCII positivo), com amostras do tipo II contendo uma mistura de MHCIIa e MHCIIx 6,10. Notavelmente, o protocolo atual demonstra como as fibras do tipo IIx puras podem ser identificadas e fornece um fluxo de trabalho altamente detalhado (resumido na Figura 1), incluindo estratégias de solução de problemas para problemas comuns de protocolo.

<table><tbody><tr><td>1x tampão desnaturante</td><td>Faça de acordo com a receita</td><td>Os constituintes podem ser obtidos da Sigma-Aldrich ou de outras empresas distribuidoras de produtos químicos</td><td>&nbsp; 1x tampão desnaturante é feito diluindo 3x tampão desnaturante 1 em 3 v/v com 1X Tris-HCl (pH 6,8). Armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>3x tampão desnaturante</td><td>Faça de acordo com a receita</td><td>Os constituintes podem ser obtidos da Sigma-Aldrich ou de outros distribuidores químicos</td><td>3x tampão desnaturante contém: 0,125M Tris-HCI, 10% glicerol, 4% SDS, 4 M ureia, 10% 2-mercaptoetanol e 0,001% azul de bromofenol, pH 6,8.&nbsp; Armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>95% Etanol</td><td>N/A</td><td>100% etanol pode ser obtido de qualquer empresa</td><td>Diluído a 95% com H2O ultrapuro.</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal de coelho com actina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; A2066</td><td>Diluir 1 em 1.000 com tampão BSA.</td></tr><tr><td>Balanças analíticas</td><td>Mettler Toledo</td><td>Número do modelo: MSZ042101</td><td></td></tr><tr><td>Intensificador de anticorpos</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>32110</td> O <td>nome do produto é Miser Antibody Extender Solution NC.</td></tr><tr><td>Copo (100 mL)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada</td><td>Eppendorf</td><td>5452</td><td>Nome do modelo: Mini Spin.</td></tr><tr><td>Tampão de bloqueio: 5% de leite desnatado em tampão de lavagem.</td><td>Loja de Diploma</td><td>comprou</td><td></td></tr><tr><td>buffer BSA: 1% BSA/PBST, 0,02% NaN3</td><td>BSA: Sigma-Aldrich&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; PBS: Laboratórios Bio-Rad. NaN3 : Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>BSA: A6003-25G&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10x PBS: 1610780&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; NaN3: S2002</td><td>Albumina sérica bovina (BSA), solução salina tamponada com fosfato (PBS) e azida sódica (NaN3). Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Alavanca de abertura do&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>4560000</td><td>Usado para abrir os de gel pré-moldados.</td></tr><tr><td>Chemidoc MP Imager&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>Número do modelo: Capuz universal III</td><td>Qualquer sistema de imagem com recursos de imagem em gel sem manchas.</td></tr><tr><td>Criterion blotter</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1704070</td><td>Inclui bolsa de gelo, bandeja de transferência, rolo, 2 porta-, papel de filtro, almofadas de espuma e tampa com cabos.</td></tr><tr><td>Criterion Cell (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1656001</td><td></td></tr><tr><td>ECL (quimioluminescência aprimorada)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1705062</td><td>Nome do produto: Clarity Max Western ECL Substrate.</td></tr><tr><td>Tampão de eletroforese 1x Tris Glycine SDS (TGS)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610772</td><td>Diluir 10x TGS 1 em 10 com H2O. ultrapuro</td></tr><tr><td>Papel de filtro, 0,34 mm de espessura</td><td>Whatmann</td><td>3030917</td><td>Tamanho a granel 3 MM, embalagem de 100 folhas, 315 x 335 mm.</td></tr><tr><td>Pinça de dissecação de tecidos finos</td><td>Dumont</td><td>F6521-1EA</td><td>Joalheiro' s fórceps nº 5.</td></tr><tr><td>Bandeja/tampa de plástico plana&nbsp; &nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Grande o suficiente para colocar a membrana. Certifique-se de que a superfície esteja completamente plana.</td></tr><tr><td>Sistema de liofilização</td><td>Labconco</td><td>7750030</td><td>Freezone 4,5 L com estágio de amostra em câmara de vidro.</td></tr><tr><td>Freezer -80 oC&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Qualquer freezer com temperatura constante de -80 &graus; C é adequado.</td></tr><tr><td>Os liberadores de gel</td><td>1653320</td><td>Bio-Rad</td><td>Deslize sob a membrana para reunir ou mover a membrana.</td></tr><tr><td>Lápis de grafite cinza</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Software de laboratório de imagem&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>N/A</td><td>Figures refere-se à versão 5.2.1 do software, mas outras versões podem ser usadas.</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Bio-Rad</td><td>Laboratories 1660521</td><td>Qualquer incubadora que possa ser configurada para 37 &deg; C seria suficiente.</td></tr><tr><td>Lâmpada</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético com pulga</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rolo de membrana&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1651279</td><td>Pode ser comprado no pacote de transferência. No entanto, se este produto não estiver disponível, qualquer tubo cilíndrico de superfície lisa longo o suficiente para rolar sobre a membrana seria suficiente.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (0,6 mL)</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG HRP secundário</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31430</td><td>Cabra anti-Mouse IgG (H + L), RRID AB_228341. Diluir em 1 em 20.000 no tampão de bloqueio.</td></tr><tr><td>Mouse IgM HRP secundário</td><td>Abcam</td><td>ab97230</td><td>Goat Anti-Mouse IgM mu cadeia. Utilizar na mesma diluição que a IgG de ratinho.</td></tr><tr><td>Anticorpo primário de Cadeia Pesada de Miosina I (MHCI)</td><td>DSHB</td><td>A4.840&nbsp;</td><td>Intervalo de diluição: 1 em 200 a 1 em 500 em tampão BSA.</td></tr><tr><td>Anticorpo primário de Cadeia Pesada de Miosina IIa (MHCIIa)</td><td>DSHB</td><td>A4.74&nbsp;</td><td>Intervalo de diluição: 1 em 200 a 1 em 500 em tampão BSA.</td></tr><tr><td>Anticorpo primário de cadeia pesada de miosina IIx (MHCIIx)</td><td>DSHB</td><td>6H1</td><td>Faixa de diluição: 1 em 200 a 1 em 500 em tampão BSA.</td></tr><tr><td>Membrana de Nitrocelulose 0.45 &micro; m&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1620115</td><td>para Western blotting.</td></tr><tr><td>Tampa da placa de Petri</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pinças de plástico</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Power Pack&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>164-5050</td><td>Nome do produto: Fonte de alimentação básica.</td></tr><tr><td>Escada de proteína</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td>PageRuler Escada de proteína prestada, 10 a 180 kDa.</td></tr><tr><td>Membrana PVDF 0.2 &micro; m</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit HRP secundário</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31460</td><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Diluição igual à dos anticorpos secundários de ratinho.</td></tr><tr><td>Régua</td><td>N/A</td> N<td>/A</td> Tesoura N/A N/A <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Stereomicroscope Motic SMZ-168 do estereomicroscópio N/A N/A Thermo Fisher Scientific 21059 Nome do produto: Restaure o tampão de descascamento ocidental do borrão.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecido (sem fiapos)</td><td>Kimberly-Clark professional</td><td>34120</td><td>Nome do produto: Kimwipe.</td></tr><tr><td>Tampão de transferência (1x tampão Tris Glycine (TG), 20% de metanol)</td> <td>TG: Bio-Rad Laboratories&nbsp; &nbsp; Metanol: Merck</td><td>TG buffer: 1610771&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Metanol: 1,06018</td><td>diluir 10x tampão TG com H2O ultrapuro a 1x. Adicionar 100% de metanol a uma concentração final de 20% de metanol. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Bandeja de transferência</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1704089</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Gel pré-moldado de ativação UV</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>5678085</td><td>Tipo de gel: 4&ndash; 15% Criterion TGX Gel de Proteína Sem Corantes, 26 poços, 15 &micro;L.</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Wash buffer (1x TBST)</td><td>10x TBS: Astral Scientific&nbsp; Tween 20: Sigma</td><td>&nbsp; Receita de BIOA0027-4L</td><td>1x TBST: 10x solução salina tamponada com Tris (TBS) é diluída até 1x com H2O ultrapuro, Tween 20 é adicionado a uma concentração final de 0,1%. Armazene o buffer a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Recipientes de lavagem</td><td>Sistema</td><td>Store comprado</td><td>Qualquer recipiente tupperware, que se adapte às dimensões aproximadas da membrana seria suficiente.</td></tr></tbody></table>

identificação do tipo de fibra do músculo esquelético humano

Fiber Type Identification of Human Skeletal Muscle

A técnica aqui descrita pode ser usada para identificar isoformas específicas da cadeia pesada de miosina (MHC) em segmentos de fibras musculares individuais usando dot blotting, doravante referido como detecção de cadeia pesada de Myosin por Do t Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). Este protocolo descreve o processo de liofilização do músculo esquelético humano e o isolamento de segmentos de fibras musculares únicas. Usando MyDoBID, as fibras do tipo I e II são classificadas com anticorpos MHCI- e IIa-específicos, respectivamente. As fibras classificadas são então combinadas em amostras específicas do tipo de fibra para cada biópsia.
A proteína total em cada amostra é determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE) e tecnologia de gel ativado por UV. O tipo de fibra das amostras é validado usando western blotting. A importância de realizar a normalização da carga proteica para melhorar a detecção de proteínas-alvo em vários western blots também é descrita. Os benefícios da consolidação de fibras classificadas em amostras específicas do tipo de fibra em comparação com as blots ocidentais de fibra única incluem versatilidade da amostra, maior rendimento da amostra, menor investimento de tempo e medidas de economia de custos, tudo isso enquanto retém informações valiosas específicas do tipo de fibra que são frequentemente negligenciadas usando amostras musculares homogeneizadas. O objetivo do protocolo é obter a identificação precisa e eficiente de fibras tipo I e tipo II isoladas de amostras de músculo esquelético humano liofilizado.
Essas fibras individuais são posteriormente combinadas para criar amostras específicas do tipo I e do tipo II de fibras. Além disso, o protocolo é estendido para incluir a identificação de fibras do tipo IIx, usando Actina como marcador para fibras negativas para MHCI e MHCIIa, que são confirmadas como fibras IIx por western blotting. Cada amostra específica do tipo de fibra é então usada para quantificar a expressão de várias proteínas-alvo usando técnicas de western blotting.

Identificação de fibras musculares MHCI, MHCIIa e MHCIIx individuais usando dot blotting Uma característica do MyDoBID é a categorização da variação da intensidade de sinal MHC e Actina em uma dada fibra (Figura 4A). O tipo de fibra foi identificado pela presença ou ausência das isoformas MHCI e IIa (Figura 4B). Seis fibras não apresentaram detecção de MHC ou actina, indicando que não houve coleta de fibras. Os resultados desse dot blot espec...

Este protocolo demonstra o isolamento de fibra única do músculo esquelético humano liofilizado e a classificação do tipo de fibra de acordo com a isoforma da cadeia pesada da miosina (MHC) usando a técnica de dot blotting. Amostras de fibras MHC I e II identificadas podem então ser analisadas para diferenças específicas do tipo de fibra na expressão de proteínas usando western blotting.

Identificação do Tipo de Fibra do Músculo Esquelético Humano

The technique described here can be used to identify specific myosin heavy chain (MHC) isoforms in segments of individual muscle fibers using dot ...

Nossa pesquisa gira em torno do músculo esquelético, que é composto por células com propriedades metabólicas e contráteis distintas, caracterizadas como fibras de contração lenta ou rápida. Investigamos os fatores que contribuem para essas diferenças e exploramos suas implicações no contexto do envelhecimento, exercício e várias doenças. A mensuração das respostas celulares em diferentes fibras musculares esqueléticas é frequentemente negligenciada, ou não é possível devido ao exame de homogeneizados musculares.A técnica MyDoBID nos permite analisar repetidamente diferenças de proteínas do tipo de fibra que antes eram impossíveis de medir. Este protocolo identifica com precisão e eficiência as fibras musculares tipo um e tipo dois a partir de amostras de músculo esquelético humano liofilizadas. Este método recentemente revisado fornece uma abordagem direta para os pesquisadores investigarem as diferenças de proteínas no músculo esquelético no nível celular.Notavelmente, facilita a identificação de fibras X tipo dois, e estas têm sido historicamente difíceis de distinguir. A técnica permite que os pesquisadores lancem luz sobre todos os tipos de fibras, incluindo a elusiva fibra de

fiber-type-identification-of-human-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Neste vídeo, demonstramos a preparação de amostras de tecido muscular esquelético humano e sua coloração para microscopia eletrônica de transmissão para visualizar e quantificar a distribuição de glicogênio subcelular.

Microscopia eletrônica de transmissão para quantificar a distribuição de glicogênio em músculos esqueléticos humanos

Aqui, apresentam-se um protocolo para a fibra muscular rápida análises, o que permite melhor qualidade de coloração, e assim aquisição automática e quantificação de populações de fibras utilizando o software ImageJ livremente disponíveis.

Um Protocolo Automatizado Rápido para Muscle Fiber Análise População em músculo secções transversais Usando Cadeia miosina pesada Imunohistoquímica

Coloração imuno-histoquímica de isoformas de cadeia pesada de miosina emergiu como o discriminador de estado-da-arte do tipo de fibra muscular esquelético (ou seja, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Aqui, apresentamos um protocolo de coloração juntamente com um algoritmo semi-automático de romance que facilita a rápida avaliação da morfologia do tipo de fibra e fibra.

Semi automatizados de análise da morfologia do músculo esquelético de rato e composição de fibra-tipo

Este relatório técnico descreve uma variação da técnica modificada de Bergström para a biópsia do musculus tibialis anterior que limita o dano da fibra.

Coleta de Biópsias Musculares Esqueléticas do Compartimento Superior do Musculus Tibialis Anterior para Avaliação Mecânica

A capacidade de detectar com precisão componentes de junção neuromuscular é crucial na avaliação de modificações em sua arquitetura devido a processos patológicos ou de desenvolvimento. Aqui apresentamos uma descrição completa de um método simples para obter imagens de alta qualidade de junções neuromusculares de montagem inteira que podem ser usadas para realizar medições quantitativas.

Dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de monte inteiro

Evidências crescentes indicam que a infiltração excessiva de lipídios dentro do músculo esquelético resulta em lipotoxicidade e diabetes. Aqui, apresentamos um protocolo completo, incluindo processamento de tecidos, coloração com Bodipy, aquisição de imagens e análise, para quantificar o tamanho, densidade e distribuição subcelular de gotículas lipídicas de forma específica do tipo fibra.

Tipo de fibra e análise subcelular-específica do conteúdo de gotícula lipídica no músculo esquelético

Descrevemos um protocolo para obtenção de fibras enzimaticamente dissociadas de diferentes comprimentos e tipos de seis músculos de camundongos adultos: três deles já descritos (flexor curto dos dedos, extensor longo dos dedos, sóleo) e três deles dissociados com sucesso pela primeira vez (extensor longo do hálux, fibular longo, fibular dos dígitos).

Fibras musculares esqueléticas curtas, intermediárias e longas intactas obtidas por dissociação enzimática de seis músculos dos membros posteriores de camundongos: além do flexor curto dos dedos

Esse protocolo descreve o isolamento de fibras musculares únicas intactas do sóleo oxidativo e o estabelecimento de culturas de mioblast altamente purificadas derivadas dessas fibras. O procedimento otimizado gera de forma confiável aproximadamente 300–500 miofibras intactas por camundongo, permitindo análises moleculares e celulares posteriores.

Ensaio de Isolamento de Fibra Única para Avaliação do Comportamento da Miofibra Oxidativa

Um protocolo para sintetizar peptóides com funcionalidade catiônica mista na mesma sequência é apresentado (monômeros do tipo lisina e arginina). Testes subsequentes desses compostos contra Leishmania mexicana, os protozoários parasitas causadores da leishmaniose cutânea, também são descritos.

Um método eficiente para a Síntese de Peptóides com Monómeros Mixed tipo de lisina / arginina-tipo e avaliação da sua actividade anti-leishmaniose

Propomos um protocolo para identificar ácidos graxos sem a necessidade de purificá-los. Combina informações sobre os tempos de retenção com os espectros de massa de três tipos de derivados de ácidos gordos: ésteres metílicos de ácidos gordos (FAME), derivados de 4,4-dimetiloxazolina (DMOX) e ésteres 3-piridilcarbinílicos (picolinil).

Identificação de ácidos graxos no<em&gt; Bacillus cereus</em

Aprenda a técnica MyDoBID para isolar fibras musculares de amostras liofilizadas de músculo esquelético humano e classificá-las por isoformas de cadeia pesada de miosina. Este método permite analisar diferenças de expressão proteica específicas de cada tipo de fibra.

Identificação do Tipo de Fibra do Músculo Esquelético Humano

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