Name: Uma técnica otimizada de politransfecção reversa baseada em células-tronco embrionárias de camundongo para rápida exploração de proporções de ácidos nucleicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Aprenda a técnica de politransfecção reversa para células-tronco embrionárias de camundongo em meio 2i e LIF. Este método otimiza a viabilidade celular e a eficiência de transfecção em uma única etapa.

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Os autores gostariam de agradecer as muitas contribuições para a área que não foram citadas neste trabalho devido a limitações de espaço, bem como as agências de fomento que proporcionaram essa oportunidade. Os autores agradecem o financiamento do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) e dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR), que apoiaram este trabalho. K.M. recebeu uma bolsa CGS-M do NSERC e uma bolsa de doutorado Killam da Universidade da Colúmbia Britânica. N.S. recebeu o Michael Smith Health Research BC Scholar Award.

1. Preparação de reagentes para cultura mPSC
<ol><li>Preparar suplemento N2.<ol><li>Em condições não estéreis, preparar as seguintes soluções-mãe (passo 1.1.1.1) num exaustor de segurança química. Adicione o pó sólido de cada produto químico a um tubo cônico de 50 mL pré-pesado. Pesar cada tubo após a adição do pó e adicionar uma quantidade adequada de solvente para atingir as concentrações abaixo. Para um lote de mídia, prepare a quantidade mínima listada. NOTA: Os reagentes a seguir são perigosos e devem ser manuseados de acordo com as diretrizes locais de segurança química. Certifique-se de EPI adequado ao manusear e trabalhe apenas com as formas sólidas em pó desses produtos químicos em uma capela de fumaça química para evitar a inalação.<ol><li>Mínimo de 0,05 mL de selenito de sódio em água a 0,518 mg/mL, 0,5 mL de putrescina em água a 160 mg/mL, 0,165 mL de progesterona em etanol 100% a 0,6 mg/mL (ver Tabela de Materiais).</li>
			<li>Armazene soluções a -20 °C por até 2 anos.</li>
		</ol></li>
		<li>Em uma cabine de biossegurança (BSC), adicionar o seguinte a 58.035 mL de DMEM-F12.<ol><li>0,05 ml de solução de selenito de sódio 0,518 mg/ml, 0,5 ml de solução de putrescina a 160 mg/ml, 0,165 ml de solução de progesterona 0,6 mg/ml.</li>
			<li>Filtrar esterilizar a mistura acima com um filtro de 0,22 μm.</li>
		</ol></li>
		<li>Ainda no BSC, preparar uma solução de 100 mg/mL de apotransferrina.<ol><li>Adicionar 5 ml de DMEM-F12 a 500 mg de apotransferrina (ver Tabela de Materiais). Ressuspenda lentamente e lave o recipiente, evitando bolhas.</li>
			<li>Depois de ressuspender e remover o máximo possível com 5 mL, adicioná-lo à solução de selenito/putrescina/progesterona. Tome mais da solução anterior e lave o frasco de apotransferrina, tirando o máximo possível.</li>
		</ol></li>
		<li>Adicionar 5 ml de fracção V de BSA a 7,5% (ver Tabela de Materiais) à solução.</li>
		<li>Misture e alíquota 6,875 mL por tubo. Guarde alíquotas a -80 °C por até 1 ano.</li>
		<li>Ao usar as alíquotas N2 acima para fazer o meio N2B27, descongele a alíquota desejada e adicione 3,125 mL de uma solução de insulina 4 mg/mL (ver Tabela de Materiais) ao 6,875 N2 para 10 mL de 100x N2.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar meios basais N2B27.<ol><li>Descongele os suplementos de N2 e B27 em uma geladeira de 4 °C por algumas horas ou durante a noite.</li>
		<li>Em um BSC, misturar 484,5 mL de DMEM-F12 e 484,5 mL de meio Neurobasal (ver Tabela de Materiais) em um frasco estéril de 1 L.</li>
		<li>Adicionar 10 mL de B27 e 10 mL de suplemento N2 à mídia.</li>
		<li>Adicionar 1 ml de beta-mercaptoetanol 55 mM (ver Tabela de Materiais). Adicionar 10 mL de 100x glutamax. Misture vigorosamente girando o frasco.</li>
		<li>Aliquota o volume desejado por alíquota (normalmente 100 mL) e armazenar a -80 °C por até 1 ano. Conservar em utilização após descongelamento a 4 °C durante um período máximo de 3 semanas.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar mídia NBiL.<ol><li>Descongelar uma alíquota de 100 mL de meio basal N2B27 de -80 °C na geladeira de 4 °C.</li>
		<li>Em um BSC, adicionar LIF (ver Tabela de Materiais) a uma concentração final de 10 μg/L.</li>
		<li>Adicionar CHIR99021 (3 μM final) e PD0325901 (1 μM final) (ver Tabela de Materiais). Misture bem com uma pipeta sorológica de 50 mL. Conservar a 4 °C até 2 semanas.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar solução de gelatina a 0,2%.<ol><li>Transfira 500 mL de H2O bidestilado para um frasco de vidro de 1 L.</li>
		<li>Meça 1 g de gelatina (ver Tabela de Materiais) e junte-a à água. Misture agitando o frasco até dissolver.</li>
		<li>Autoclave a mistura de gelatina e água a 15 psi, 121 °C por 35 min. Uma vez resfriado, esterilizá-lo com um filtro de 0,22 μm em um BSC. Conservar a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare meios de lavagem.<ol><li>Em um BSC, misturar 160 μL de BSA 7,5% por 10 mL de DMEM-F12.</li>
		<li>Dimensione o acima e prepare em grandes quantidades para facilitar o uso futuro (por exemplo, 8 mL de BSA 7,5% a 500 mL de DMEM-F12). Conservar a 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação de reagentes para politransfecção de mPSC
NOTA: Os seguintes valores são fornecidos para um único poço de uma placa de 24 poços. Os valores podem ser dimensionados de acordo. As sequências de todos os DNA/plasmídeos estão detalhadas no Arquivo Suplementar 1.
<ol><li>Calcular o volume de solução de DNA necessário por tratamento.<ol><li>Preparar 500 ng de DNA por poço/condição.<ol><li>Se transfectar um único plasmídeo com uma solução de DNA de 100 ng/μL, prepare um tubo com 5 μL de DNA.</li>
			<li>Se transfectar dois plasmídeos a 100 ng/μL cada, prepare dois tubos com 2,5 μL em cada, um para cada plasmídeo.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Em um BSC, execute o seguinte: Para cada tratamento de transfecção de 500 ng (ver Tabela de Materiais), alíquota 25 μL de OptiMEM em um tubo de 1,5 mL.<ol><li>Dimensione isso de acordo - para o exemplo acima, prepare dois tubos, cada um com 250 ng de DNA (2,5 μL) e 12,5 μL de OptiMEM.</li>
	</ol></li>
	<li>Adicione o volume de ADN necessário para esse tratamento ao OptiMEM no tubo.</li>
	<li>Para cada tubo com 500 ng de DNA e OptiMEM, crie um tubo correspondente com mais 25 μL de OptiMEM e 1 μL de reagente de transfecção catiônico à base de lipídios.<ol><li>Novamente, esses valores devem ser dimensionados de acordo. Para o exemplo acima, prepare dois tubos, cada um com 12,5 μL de OptiMEM e 0,5 μL de reagente de transfecção. NOTA: Ao escalar valores, use a massa de DNA adicionada, não o volume necessário para essa quantidade de DNA. As reações com reagente de transfecção e DNA podem ser dimensionadas (por exemplo, se 5 poços forem transfectados com o mesmo DNA). Mantenha as proporções de reagentes iguais, mas dimensione de acordo (por exemplo, DNA de 1000 ng: 50 μL OptiMEM: reagente de transfecção de 2 μL: 50 μL OptiMEM).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparação de mPSCs para transfecção
NOTA: Para a transfecção reversa, prepare o recipiente de cultura e passe diretamente pelos mPSCs antes de adicionar os reagentes de transfecção. Para a transfecção direta, passagem e placa as células 12-18 h antes da transfecção para permitir que as células para aderir à placa.
<ol><li>Preparar um vaso de cultura celular revestido com gelatina a 0,2%.<ol><li>Planejar o número de poços necessários para a transfecção (um poço de uma placa de 24 poços por tratamento/grupo).</li>
		<li>Adicionar 200 μL da solução de gelatina a 0,2% a cada um dos poços desejados na placa de 24 poços.</li>
		<li>Agite suavemente a placa para espalhar uniformemente a solução, garantindo que ela cubra todo o fundo do poço.</li>
		<li>Deixe os poços revestirem por um mínimo de 15 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Usando um aspirador a vácuo, remova cuidadosamente qualquer sobra de gelatina dos poços (incline a placa para garantir a remoção de todo o líquido sem raspar a camada de gelatina).</li>
		<li>Adicionar 0,5 mL de meio NBiL (passo 1.3) a cada poço e deixar a placa em incubadora de cultura de tecidos para pré-aquecimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Passagem mPSCs.<ol><li>Alíquota 30 mL de meio de lavagem (passo 1.5) em um tubo cônico de 50 mL.</li>
		<li>Aspirar o meio antigo da placa de cultura de tecidos de mESCs. NOTA: Várias técnicas de aspiração são permitidas. Seja qual for a técnica escolhida, certifique-se de que as células não permaneçam secas por longos períodos (aproximadamente 30 s no máximo).</li>
		<li>Adicione a quantidade necessária de meio de detenção celular disponível comercialmente (1,5 mL para um prato de 10 cm, dimensione de acordo, consulte Tabela de Materiais).</li>
		<li>Aguarde 3-5 minutos antes de pipetar para cima e para baixo 15-20 vezes com uma pipeta P1000 para obter uma suspensão de célula única. Visualize as células sob um microscópio para garantir uma suspensão de célula única.</li>
		<li>Transfira as células do meio de detenção para o tubo de 50 mL contendo o meio de lavagem.</li>
		<li>Centrifugar a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o meio de lavagem, garantindo que nenhum líquido residual permaneça no tubo.</li>
		<li>Ressuspenda o pellet em um pequeno volume de meio de lavagem (~300 μL). Contar a suspensão celular usando um hemocitômetro para obter a densidade celular.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Transfecção reversa de mPSCs
<ol><li>Preparar reagentes de politransfecção de acordo com o passo 2.</li>
	<li>Preparar o vaso de cultura celular e passar mPSCs de acordo com a etapa 3.</li>
	<li>Alíquota 200 μL de meio NBiL para tubos de 1,5 mL, um para cada tratamento.</li>
	<li>Adicionar 26 μL da mistura de reagentes OptiMEM:transfection à mistura DNA:OptiMEM. Misture os reagentes de forma rápida e vigorosa pipetando aproximadamente 10 vezes. Deixe a mistura incubar à temperatura ambiente durante 5 min.</li>
	<li>Com base na densidade celular, transfira o volume necessário de células da suspensão de 300 μL para os tubos NBiL de 200 μL para obter 25.000 células por tubo.</li>
	<li>Após 5 min de incubação da mistura de Lipofectamina 2000 (L2K, reagente de transfecção) e DNA, adicione-a ao tubo de 1,5 mL das células e misture bem por pipetagem. Deixar as células incubarem com o reagente durante 5 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Pipetar o líquido, deixando aproximadamente 50 μL.</li>
	<li>Ressuspender o pellet de células com 100 μL de meio NBiL. Transfira as células para a placa e coloque a placa na incubadora. Mude a mídia 24 h depois com uma nova mídia NBiL.</li>
</ol>5. Transfecção direta de mPSCs
<ol><li>12-18 h antes da transfecção, preparar o vaso de cultura celular e passagem mPSCs de acordo com o passo 3.</li>
	<li>Com base na densidade celular, transfira o volume necessário de células da mistura de 300 μL para semear 25.000 células por poço. Coloque a placa na incubadora.</li>
	<li>1 h antes da transfecção, aspirar o meio de todos os poços e substituí-lo por 0,5 mL de meio NBiL. Coloque a placa na incubadora.</li>
	<li>No momento da transfecção, preparar reagentes de politransfecção mPSC de acordo com o passo 2.</li>
	<li>Adicionar 26 μL da mistura de reagentes OptiMEM:transfection à mistura DNA:OptiMEM. Misture os reagentes de forma rápida e vigorosa pipetando aproximadamente 10 vezes. Deixe a mistura combinada incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
	<li>Adicione a mistura combinada aos poços gota a gota. Coloque a placa na incubadora. Mude a mídia 24 h depois.</li>
</ol>6. Citometria de fluxo
<ol><li>Aspirar o meio da placa transfectada de 24 poços 48 h após a transfecção.</li>
	<li>Adicionar 200 μL de tripsina a cada poço, agitar e incubar durante 30 s a 37 °C. Toque nas laterais da placa e adicione 200 μL de tampão FACS gelado (2% FBS em PBS).</li>
	<li>Abra e rotule uma placa de 96 poços com fundo em V, a partir da A1. Misture o conteúdo de cada poço na placa transfectada para desalojar as células e fazer soluções unicelulares com uma pipeta P200. Transfira 200 μL de cada poço para o poço apropriado na placa de 96 poços.</li>
	<li>Adicionar 15 mL de tampão FACS a um reservatório de reagente de 50 mL. Centrifugar a placa a 300 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante invertendo a placa de 96 poços na pia com um movimento rápido e suave.</li>
	<li>Use uma pipeta multicanal para ressuspender os pellets na placa de 96 poços em 150 μL de tampão FACS do reservatório de reagente. Repita as etapas 6.4-6.5 duas vezes. Coloque a placa de 96 poços em uma caixa cheia de gelo protegida da luz.</li>
	<li>Execute as amostras através de um citômetro de fluxo para obter as distribuições populacionais dos repórteres fluorescentes.<ol><li>Certifique-se de que o citômetro seja apropriado em termos de combinações de laser e filtro para o experimento a ser realizado (por exemplo, não use um repórter infravermelho se não for possível excitar ou detectar no espectro vermelho distante).</li>
		<li>Inclua amostras adicionais para contas de padronização para permitir a conversão MEFL dos dados durante a análise. Garantir que sejam recolhidas células suficientes por amostra para uma análise estatística adequada9.</li>
	</ol></li>
	<li>Converter unidades fluorescentes dos arquivos brutos do citômetro e analisar os dados usando qualquer um dos vários métodos, como pipelines baseados em Python ou MATLAB ou software disponível comercialmente 9,13.</li>
</ol>

Análise comparativa dos métodos de transfecção direta e reversa em mPSCs

<ol><li>Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-aware+synthetic+biology+by+controller+design%3A+Engineering+the+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell.</a> Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).</li>
<li>Fus-Kujawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+methods+and+tools+for+transfection+of+eukaryotic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, (2021).</li>
<li>FAU, K. T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+protocols+for+mouse+embryonic+stem+cell+culturing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing.</a> PLoS One. 8 (12), 81156(2013).</li>
<li>Morgani, S., Nichols, J., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+pluripotency%3A+in+vitro+adaptations+of+a+continuum+of+in+vivo+states%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The many faces of pluripotency: in vitro adaptations of a continuum of in vivo states.</a> BMC Developmental Biology. 17 (1), (2017).</li>
<li>Mulas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+propagation+and+manipulation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for propagation and manipulation of mouse embryonic stem cells.</a> Development. 146 (6), Cambridge, England. 173146(2019).</li>
<li>Tamm, C., Kadekar, S., Pijuan-Galitó, S., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+efficient+transfection+of+mouse+embryonic+stem+cells+using+non-viral+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast and efficient transfection of mouse embryonic stem cells using non-viral reagents.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 584-591 (2016).</li>
<li>Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+types%2C+methods+and+strategies%3A+A+technical+review%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> PeerJ. 9, 11165(2021).</li>
<li>Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bpoly-transfection%26%2334%3B+method+for+rapid%2C+one-pot+characterization+and+optimization+of+genetic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A &#34;poly-transfection&#34; method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems.</a> Nucleic Acids Research. 47 (18), 106(2019).</li>
<li>Jones, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endoribonuclease-based+feedforward+controller+for+decoupling+resource-limited+genetic+modules+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 5690(2020).</li>
<li>Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, C., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+development+of+cell+state+identification+circuits+with+poly-transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid development of cell state identification circuits with poly-transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (192), e64793(2023).</li>
<li>Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+extract+based+optimization+of+biomolecular+circuits+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).</li>
<li>Teague, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoflow%3A+A+python+toolbox+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Cytoflow: A python toolbox for flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Qin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+constitutive+promoters+and+the+doxycycline-inducible+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter.</a> PLoS One. 5 (5), 0010611(2010).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Uma das principais razões para a ampla adoção de protocolos de transfecção é sua reprodutibilidade e acessibilidade; no entanto, esses protocolos requerem otimização em contextos experimentais. Não mencionado acima é o teste padrão exigido ao tentar transfectar uma nova linhagem celular pela primeira vez. Primeiro, a escolha do reagente de transfecção é fundamental, pois os reagentes comercialmente disponíveis não são únicos e variam na eficiência da viabilidade da entrega de NA entre os tipos celulares. Além disso, enco...

A entrega de DNA e RNA em células de mamíferos serve como um pilar central da pesquisa biomédica1. Um método comum para a introdução de ácidos nucléicos (NA) exógenos em células de mamíferos é por transfecção transitória 2,3. Essa técnica baseia-se na mistura de NA com reagentes de transfecção disponíveis comercialmente, capazes de entregá-los nas células receptoras. Normalmente, o NA é liberado via transfecção anterior, onde as células aderidas a uma superfície bidimensional recebem o complexo de transfecção. Enquanto a transfecção direta para as linhagens celulares estabelecidas mais comuns é robusta e os protocolos são bem publicados, tipos celulares de nicho com morfologias não monocamadas não transfectam facilmente, limitando a quantidade de NA que pode ser entregue e o número de células que o recebem.
As células-tronco pluripotentes (PSCs) servem como um modelo atraente para a compreensão do desenvolvimento e como uma ferramenta para a medicina regenerativa, dada sua capacidade de se dividir indefinidamente e produzir qualquer tipo de célula corporal. Para PSCs de camundongos (mPSCs), condições rotineiras de cultivo in vitro com 2 inibidores e LIF (2i/LIF) mantêm uma morfologia de colônia semelhante a uma cúpula, limitando diretamente o número de células expostas a uma transfecção anterior 4,5,6. Para resolver isso, uma transfecção reversa pode ser realizada: células são adicionadas a uma placa contendo meio e reagente de transfecção, em vez de adicionar reagente de transfecção às células aderentes7. Embora isso aumente o número de células expostas ao reagente, também requer que as células sejam passadas e transfectadas simultaneamente.
Indo além de simples transfecções de NA único, os pesquisadores geralmente visam entregar várias construções de NA em uma população de células in vitro. Isso é tipicamente conseguido através de uma co-transfecção, onde os NAs são misturados em uma determinada proporção (1:1, 9:1, etc.) e são então combinados com o reagente de transfecção escolhido8. Isso produz uma mistura de NAs e reagentes que preserva a proporção original de NAs entre si - enquanto as células em tratamento podem receber quantidades diferentes dessa mistura, todas recebem a mesma proporção9. Embora isso seja vantajoso quando a proporção desejada de partes é conhecida, determinar essa proporção antecipadamente pode ser trabalhoso, com cada razão constituindo uma condição diferente. Uma alternativa é realizar uma "politransfecção", em que os AEs individuais são misturados com o reagente de transfecção independentemente uns dos outros9. Ao combinar complexos de transfecção contendo NAs individuais (em vez de combinar NAs antes de criar os complexos), os pesquisadores podem explorar uma ampla gama de estequiometrias de NA em um único experimento de transfecção9. Isso é particularmente valioso nos casos em que se espera que os produtos de vários NAs interajam entre si, como com sistemas de transcrição induzíveis ou sistemas com feedback embutido 1,10,11. No entanto, para fazê-lo de forma eficaz, uma alta eficiência de transfecção é necessária. De fato, à medida que o número de NAs únicos transfectados aumenta, a probabilidade de uma dada célula receber todos os NAs desejados diminui exponencialmente 9,12.
O relato a seguir descreve um protocolo de transfecção reversa para mPSCs usando um reagente de transfecção catiônico baseado em lipídios, no qual as células são expostas à mistura reagente-NA por no máximo 5 min para maximizar a viabilidade e minimizar o tempo fora das condições típicas de cultura. A comparação deste protocolo com a transfecção direta padrão dessas células demonstra uma maior eficiência de transfecção e um aumento no número total de células transfectadas sobreviventes. Combinando esta transfecção reversa com uma politransfecção de três plasmídeos envolvendo repórteres fluorescentes simples, um potencial expandido para rastrear razões de NA com alta eficiência de transfecção é demonstrado.

<table><tbody><tr><td>Accutase&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Apotransferrina&nbsp;</td><td>Suplemento MilliporeSigma</td><td>T1147-500MG</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>Beta-mercaptoetanol</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>21985023</tr><tr><td>BSA fração V (7,5%)</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>SML1046-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>MilliporeSigma</td><td>D6421-24X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Contas de padronização de citometria de fluxo</td><td>Spherotech</td><td>URCP-38-2K</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina&nbsp;</td><td>Suplemento MilliporeSigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>35050061</tr><tr><td>Insulina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12585-0014</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Reagente de transfecção</td></tr><tr><td>Mídia neurobasal</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>OptiMEM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>PZ0162-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>MilliporeSigma</td><td>P8783</td><td>Perigo químico - consulte as diretrizes de segurança locais, certifique-se de que o EPI adequado esteja sendo usado e trabalhe com a forma de pó sólido apenas em uma capela de exaustão química</td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>MilliporeSigma</td><td>P6780</td><td>Perigo químico - consulte as diretrizes de segurança locais, certifique-se de que o EPI adequado esteja sendo usado e trabalhe com a forma de pó sólido apenas em uma capela</td></tr> <tr><td>de exaustão químicaMMIF recombinante&nbsp;</td><td>BioTechne</td><td>8878-LF-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de sódio&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>S5261-25G</td><td>Perigo químico - consulte as diretrizes de segurança locais, certifique-se de que o EPI adequado está sendo usado e trabalhe com a forma de pó sólido apenas em um exaustor</td></tr><tr><td>químico Tripsina-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>25200056</tr></tbody></table>

uma técnica otimizada de politransfecção reversa baseada em células-tronco embrionárias de camundongo para rápida exploração de proporções de ácidos nucleicos

An Optimized Mouse Embryonic Stem Cell Based Reverse Poly-Transfection Technique for Rapid Exploration of Nucleic Acid Ratios

Devido à sua relativa simplicidade e facilidade de uso, a transfecção transitória de linhagens celulares de mamíferos com ácidos nucléicos tornou-se um pilar na pesquisa biomédica. Embora as linhagens celulares mais utilizadas possuam protocolos robustos para transfecção em cultura bidimensional aderente, esses protocolos muitas vezes não se traduzem bem para linhagens menos estudadas ou com morfologias atípicas e difíceis de transfectar. Usando células-tronco pluripotentes de camundongos cultivadas em meios 2i/LIF, um modelo de cultura amplamente utilizado para medicina regenerativa, este método delineia um protocolo de transfecção reversa rápido e otimizado capaz de alcançar maior eficiência de transfecção. Aproveitando este protocolo, uma politransfecção de três plasmídeos é realizada, aproveitando a eficiência maior do que o normal na entrega de plasmídeos para estudar uma gama expandida de estequiometria de plasmídeos. Este protocolo de politransfecção reversa permite um método experimental de um pote, permitindo que os usuários otimizem as proporções de plasmídeos em um único poço, em vez de em várias cotransfecções. Ao facilitar a rápida exploração do efeito da estequiometria do DNA na função global dos circuitos genéticos liberados, este protocolo minimiza o tempo e o custo da transfecção de células-tronco embrionárias.

Tanto a transfecção direta quanto a reversa dependem da interação entre a membrana celular e os complexos reagente-DNA da transfecção de entrada, permitindo a entrega de NA às células receptoras. Onde essas técnicas diferem é o estado da célula após a entrega - enquanto o DNA é tipicamente entregue a monocamadas celulares aderentes na transfecção direta tradicional, a transfecção reversa depende de ter o complexo reagente-DNA encontrando as células enquanto em uma suspensão de célula única. Essa diferença pode ser partic...

O presente protocolo descreve um método de politransfecção reversa de células-tronco embrionárias de camundongos durante o cultivo com meios 2i e LIP. Este método produz maior viabilidade e eficiência do que os protocolos tradicionais de transfecção direta, ao mesmo tempo em que permite a otimização one-pot das proporções plasmidiais.

Uma técnica otimizada de politransfecção reversa baseada em células-tronco embrionárias de camundongo para rápida exploração de proporções de ácidos nucleicos

Due to its relative simplicity and ease of use, transient transfection of mammalian cell lines with nucleic acids has become a mainstay in biomedical ...

Nosso trabalho geralmente se concentra no uso de dispositivos genéticos sintéticos para manipular o destino e o comportamento das células-tronco. Ao controlar os estados celulares, pretendemos avançar no desenvolvimento de terapias celulares de próxima geração. Recentemente, uma compreensão mais profunda da relação entre a dosagem de um gene determinante do destino e a linhagem da célula foi estabelecida.Isso foi facilitado pelo desenvolvimento de controladores genéticos capazes de titular um determinado gene com precisão. Técnicas clássicas de biologia molecular, como transfecção ou transdução lentiviral para simples expressão de genes serão sempre um pilar. No entanto, nosso campo adotou recentemente dispositivos sintéticos que incorporam feedback linear e não-linear a fim de obter saídas mais complexas a partir do DNA liberado.A dosagem gênica tem um papel fundamental na determinação do resultado da expressão gênica. Ao entregar múltiplos genes exógenos, um fator experimental chave é quanto de cada gene dará o resultado ideal ou desejado. Nosso protocolo permite que os pesquisadores digitalizem rapidamente as dosagens em um único tratamento, procurando a proporção desejada de dispositivos de DNA.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Um método de transferência de genes no cérebro do rato em desenvolvimento é descrito usando um único método cirúrgico ea forma especial de eletrodos. Esta técnica exclusiva permite a transfecção de DNA plasmídeo temporal e espacialmente, o que ajudará muitos neurocientistas em estudar o desenvolvimento do cérebro.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

Nós descrevemos um ensaio repórter de fluorescência para rapidamente identificar e caracterizar genes que regulam a manutenção do mouse células-tronco embrionárias e auto-renovação.

Oct4GiP Ensaio Reporter para o Estudo de genes que regulam o mouse Manutenção células-tronco embrionárias e auto-renovação

Controlar a expansão de células estaminais somáticas é um factor principal dificultando o seu estudo e a utilização em terapia. Aqui, descrevemos um sistema para controlar temporalmente neural haste de expansão de células durante o desenvolvimento e na vida adulta, o que pode ser usado para aumentar o número de neurónios gerados no cérebro do rato.

Expansão da embrionárias e adultas células-tronco neurais por<em&gt; In Utero</em&gt; Eletroporação ou injeção estereotáxica Viral

Linhas celulares Repórter oferecer um meio de visualizar, monitorar e isolar as células de interesse de populações heterogêneas. No entanto, utilizando a recombinação homóloga convencional em células estaminais embrionárias humanas-alvo do gene é extremamente ineficiente. Relata-se alvo CNS mesencéfalo específico fator de transcrição PITX3 loco com EGFP usando zinc-finger nuclease reforçada recombinação homóloga.

Zinc-finger nucleases Gene maior focalização em células estaminais embrionárias humanas

O objetivo deste protocolo é para descrever um deficitária e ganhar-de método de função que é aplicável para identificar neogenin como um receptor específico de estágio que leva a trofectoderma e diferenciação massa celular interna de embriões de ratos pré-implantação.

Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos

Proteínas, muitas vezes contêm vários domínios que podem exercer diferentes funções celulares. Gene knock-out (KO) não consideram essa diversidade funcional. Aqui, relatamos uma abordagem de estrutura-função com base na troca de cassete mediada por recombinação (RMCE) em KO células estaminais embrionárias que permite a dissecação molecular de vários domínios funcionais ou variantes de uma proteína.

Estudos de estrutura-função em células estaminais embrionárias Rato Usando recombinase mediada por troca cassete

Aqui, apresentamos um método modificado para criopreservação de embriões unicelulares, bem como um protocolo que acoplar o uso de embriões congelados e eletroporação para a geração eficiente de camundongos geneticamente modificados.

Uso de embriões congelados para produção de ratos geneticamente modificados

Este protocolo descreve o método Capture Hi-C usado para caracterizar a organização 3D de regiões genômicas alvo de tamanho megabaseado em alta resolução, incluindo limites de domínios topologicamente associados (TADs) e interações de cromatina de longo alcance entre elementos regulatórios e outros elementos de sequência de DNA.

Decifrando a organização da cromatina 3D de alta resolução via captura Hi-C

Aqui, descrevemos uma técnica simples destinada à geração eficiente de camundongos geneticamente modificados chamada CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Este método fornece reagentes de edição por eletroporação em embriões a uma eficiência próxima de 100%. Este protocolo é eficaz para mutações pontuais, pequenas inserções genômicas e deleções em embriões de mamíferos.

Edição Eficiente do Genoma de Camundongos por Eletroporação CRISPR de Zigotos

Aqui apresentamos um protocolo para o desenvolvimento de modelos de camundongos geneticamente modificados usando células-tronco embrionárias, especialmente para grandes knock-in de DNA (KI). Este protocolo é ajustado usando a edição do genoma CRISPR / Cas9, resultando em eficiência de KI significativamente melhorada em comparação com o método convencional de direcionamento de DNA linearizado mediado por recombinação homóloga.

Direcionamento de genes altamente eficientes mediados por CRISPR/Cas9 em células-tronco embrionárias para o desenvolvimento de modelos de camundongos manipulados por genes

Circuitos genéticos complexos são demorados para projetar, testar e otimizar. Para facilitar esse processo, células de mamíferos são transfectadas de forma a permitir o teste de múltiplas estequiometrias de componentes do circuito em um único poço. Este protocolo descreve as etapas para o planejamento experimental, transfecção e análise dos dados.

Rápido Desenvolvimento de Circuitos de Identificação do Estado Celular com Poli-Transfecção

Aprenda a técnica de politransfecção reversa para células-tronco embrionárias de camundongo em meio 2i e LIF. Este método otimiza a viabilidade celular e a eficiência de transfecção em uma única etapa.

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Uma técnica otimizada de politransfecção reversa baseada em células-tronco embrionárias de camundongo para rápida exploração de proporções de ácidos nucleicos

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