Name: Desenvolvimento e caracterização de hidrogéis de matriz extracelular pulmonar decelularizada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Aprenda a desenvolver hidrogéis de matriz extracelular pulmonar decelularizada usando tecido bovino. Este método otimizado permite criar modelos organotípicos com propriedades mecânicas estáveis para engenharia de tecidos pulmonares.

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Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa Científica e Tecnológica da Turquia (TÜBİTAK) (Grant No. 118C238). Toda a responsabilidade da publicação/artigo é do proprietário da publicação. O apoio financeiro recebido da TÜBİTAK não significa que o conteúdo da publicação seja aprovado em sentido científico pela TÜBİTAK. Os autores agradecem o uso dos serviços e instalações do Centro de Pesquisa em Medicina Translacional da Universidade de Koç (KUTTAM). A Figura 1 e a Figura 2a foram criadas usando Biorender.com.

Pulmões nativos frescos de doadores bovinos jovens (1-2 anos de idade) foram obtidos de um abatedouro local e transportados em um recipiente plástico selado sobre gelo para o laboratório. O sacrifício dos animais é realizado para consumo geral de carne (pulmões descartados como resíduos) e não tem relação ou é devido ao estudo. Confirmamos que o matadouro cumpre as leis e regulamentos nacionais de sacrifício de animais. Além disso, confirmamos que utilizamos apenas resíduos e que o projeto de pesquisa não teve efeito sobre o número de animais sacrificados.
1. Colheita de órgãos e preparação de tecidos
<ol><li>Conservar os tecidos pulmonares bovinos recém-obtidos a -80 °C até à experiência.</li>
	<li>No dia do experimento, aguarde o descongelamento dos tecidos pulmonares congelados à temperatura ambiente.</li>
	<li>Dissecar os tecidos com bisturis estéreis e tesouras para remover a traqueia e as vias aéreas cartilaginosas e picar em pequenos pedaços (5 mm3).</li>
	<li>Lavar bem com água ultrapura contendo penicilina/estreptomicina a 2% (P/S) pelo menos 3x.</li>
</ol>2. Descelularização dos tecidos
NOTA: Tecidos pulmonares bovinos nativos foram decelularizados usando dois protocolos distintos.
<ol><li>Método de congelamento-descongelamento<ol><li>Preparar amostras de tecido de acordo com o passo 1. Imergir os tecidos picados em solução de iodo a 2% em água destilada estéril (dH2O) por 1 min. Realizar duas lavagens consecutivas em dH2O estéril.</li>
		<li>Transfira pedaços de tecido picados para um tubo de 50 mL até o nível de 15 mL e implemente cinco ciclos manuais de congelamento-descongelamento usando um recipiente portátil de nitrogênio líquido. Encha os tubos até o topo com dH2O estéril e congele os tubos por 2 min em nitrogênio líquido. Após 2 min, transfira-os imediatamente para banho-maria a 37 °C por 10 min. Isso constitui 1 ciclo de congelamento-descongelamento.</li>
		<li>Incubar as amostras com 30 ml de solução de DNase (10 U/ml) em tampão MgCl2 10 mM (pH 7,5) durante 1 h a 37 °C sob agitação constante a 100 rpm.</li>
		<li>Continue com uma lavagem extensa com dH2O estéril por 3 dias sob agitação constante a 100 rpm, com reposição da solução a cada 24 h.</li>
		<li>Realizar liofilização e criomoagem da seguinte forma20: Congelar as amostras de dECM úmidas a -80 °C por 24 h. Transfira as amostras congeladas para um liofilizador e opere em modo de secagem sob vácuo por 3 a 4 dias até secar completamente. Após a conclusão da liofilização, realizar a moagem das amostras em forma de pó fino usando um aparelho de moagem e gelo seco. NOTA: Este estado de pó fino é considerado necessário devido às suas propriedades de solubilidade melhoradas durante as fases subsequentes do processo de digestão.</li>
	</ol></li>
	<li>Método Triton-X-100<ol><li>Preparar amostras de tecido de acordo com o passo 1. Tratar os tecidos pulmonares com Triton-X-100 a 1% durante 3 dias sob rotação suave a 4 °C. Solução de troca a cada 24 h.</li>
		<li>Incubar as amostras com solução de DNase (10U/mL) em tampão MgCl2 10 mM (pH 7,5) por 1 h a 37 °C sob agitação constante.</li>
		<li>Continue com uma lavagem extensa com dH2O estéril por 3 dias sob rotação suave, com reposição da solução a cada 24 h.</li>
		<li>Realizar liofilização seguida de criomoagem conforme descrito no passo 2.1.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Digestão de pepsina
<ol><li>Digest amostras de dECM em pó na concentração de 15 mg/mL (p/v) em solução de pepsina (1 mg/mL de pepsina em HCl 0,01 M, pH 2). Realizar o processo de digestão da amostra à temperatura ambiente sob agitação constante durante 48 h e manter o pH da solução frequentemente para uma digestão eficaz.</li>
	<li>Transfira os digestores para um tubo e centrifuja a 5000 x g por 10 min.</li>
	<li>Coletar o sobrenadante e neutralizá-los e tamponá-los às condições fisiológicas (pH 7, 1x tampão fosfato salino (PBS)) através da adição de NaOH 5M e PBS 10x. OBS: Sugere-se o uso de soluções alcalinas concentradas para ajuste do pH do digesto ácido, pois esta abordagem evita a expansão volêmica indesejada que poderia impactar negativamente a gelificação nas etapas subsequentes.</li>
	<li>Conservar os digestores pré-gel a -20 °C para estudos adicionais.</li>
</ol>4. Coloração histológica
<ol><li>Fixar uma pequena porção (5 mm3) de amostra de tecido decelularizado em 1 ml de solução de formaldeído a 3,7% a 4 °C durante a noite.</li>
	<li>Incubar os tecidos em tubos contendo 1 ml de solução de sacarose a 30% em PBS durante 12 h a 4 °C sobre uma rocha estável.</li>
	<li>Para incorporar tecidos no composto de temperatura de corte ideal (OCT), despeje 1 mL de OCT em um criomold, coloque o tecido no meio do criomolde e, em seguida, despeje 2 mL de OCT sobre o tecido.</li>
	<li>Coloque criomoldes contendo tecidos sobre gelo seco e congele rapidamente usando nitrogênio líquido. As amostras ficam prontas quando a OCT fica toda branca, o que geralmente leva 3 min. Conservar os tecidos embebidos em OCT a -20 °C até à utilização.</li>
	<li>Obter secções de 10 μm no criostato a -25 °C numa lâmina de vidro revestida com poli-L-lisina e transferir a lâmina para a temperatura ambiente para permitir que a secção de tecido derreta na lâmina. Conservar as lâminas a -20 °C até à utilização.</li>
	<li>Para confirmar a ausência de núcleos após a descelularização, realizar a coloração de Hematoxilina e Eosina (H&E) conforme descrito a seguir.<ol><li>Incubar lâminas à temperatura ambiente durante 10 min. Imergir as lâminas em PBS e corá-las com 50 mL de solução de hematoxilina pronta para uso em um frasco de coloração por 3 min, seguido de uma lavagem de 3 min com água da torneira.</li>
		<li>Imergir as lâminas em etanol 95% e corar com 50 mL de solução alcoólica de Eosina a 0,5% em um frasco corante por 45 s.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar coloração vermelho Sirius para mostrar a retenção do conteúdo de colágeno após a descelularização.<ol><li>Hidratar as lâminas com PBS e imergir em 50 mL de Sirius red 0,1% em solução aquosa saturada de ácido pícrico em um frasco corante por 1 h.</li>
		<li>Enxaguar as lâminas em solução de ácido acético a 0,5% por 5 s e desidratar todas as lâminas mergulhando-as sequencialmente em etanol 70%, 95% e 100% por 1 min cada.</li>
	</ol></li>
	<li>Para analisar o conteúdo de sGAG em amostras de tecido, realize a coloração Alcian blue conforme descrito abaixo.<ol><li>Imergir as lâminas em 50 mL de azul de Alcian a 1% em solução de ácido acético a 3% (pH 2,5) em um frasco de coloração por 30 min. Lave as lâminas com água corrente da torneira por 2 min.</li>
		<li>Desidrate todas as lâminas mergulhando-as em etanol 70%, 95% e 100% sequencialmente por 1 min cada.</li>
	</ol></li>
	<li>Adicionar 0,1 mL de meio de montagem sobre as amostras e visualizar usando microscopia de luz usando aumento de 10x.</li>
</ol>5. Caracterização mecânica
<ol><li>Implementar medidas de reologia oscilatória usando um reômetro com geometria de placa paralela.</li>
	<li>Deite 250 μL de solução de pré-gel mantida em gelo sobre uma placa inferior pré-resfriada (4 °C) para evitar a gelificação rápida.</li>
	<li>Abaixe a placa paralela de 20 mm até que a solução pré-gel forme um disco com uma largura de intervalo de 1 mm entre as duas placas.</li>
	<li>Inicie a medição imediatamente. Meça os módulos de armazenamento e perda ao longo do tempo com uma frequência fixa e deformação enquanto aquece a placa inferior a 37 °C por 30 minutos para observar a cinética de gelificação. Use uma frequência fixa de 0,5 Hz e 0,1% de tensão.</li>
	<li>Execute um teste de recuperação de fluência depois que o valor do módulo de armazenamento parar de aumentar e atingir um platô.</li>
	<li>Aplicar tensão de cisalhamento de 1 Pa no hidrogel por 15 min, medir a deformação, descarregar a amostra da tensão e registrar a mudança no valor da deformação por 15 min.</li>
	<li>Desenhe um gráfico tensão versus tempo para mostrar o comportamento de relaxamento do estresse. Repita as medições para três digestores dECM diferentes como réplicas.</li>
</ol>

Estudo Comparativo de Técnicas de Descelularização para Hidrogéis de MEC de Pulmão Bovino

<ol><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+micropattern+arrays+fabricated+by+lung-derived+dECM+hydrogels+for+chemotherapeutic+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Ordered micropattern arrays fabricated by lung-derived dECM hydrogels for chemotherapeutic drug screening.</a> Mater Today Bio. 15, 100274(2022).</li>
<li>Ulldemolins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+extracellular+matrix+hydrogels-derived+vesicles+contribute+to+epithelial+lung+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Lung extracellular matrix hydrogels-derived vesicles contribute to epithelial lung repair.</a> Polymers. 14 (22), 4907(2022).</li>
<li>Biehl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+standardized+multi-tissue+decellularization+protocol+for+the+derivation+of+extracellular+matrix+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Towards a standardized multi-tissue decellularization protocol for the derivation of extracellular matrix materials.</a> Biomater Sci. 11 (2), 641-654 (2023).</li>
<li>Pak, J., Lee, J. H., Park, K. S., Jeong, B. C., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+cartilage+in+human+knee+osteoarthritis+with+autologous+adipose+tissue-derived+stem+cells+and+autologous+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biores+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Regeneration of cartilage in human knee osteoarthritis with autologous adipose tissue-derived stem cells and autologous extracellular matrix.</a> Biores Open Access. 5 (1), 192-200 (2016).</li>
<li>Spang, M. T., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22In+vivo+applications+and+development.Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogel therapies.</a> In vivo applications and development.Acta Biomater. 68, 1-14 (2018).</li>
<li>Schwartz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomaterial+screening+approach+reveals+microenvironmental+mechanisms+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">A biomaterial screening approach reveals microenvironmental mechanisms of drug resistance.</a> Integr Biol. 9 (12), 912-924 (2017).</li>
<li>Monteiro, M. V., Gaspar, V. M., Ferreira, L. P., Mano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+3D+in+vitro+tumor+models+for+screening+cell+aggregation+mediated+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Hydrogel 3D in vitro tumor models for screening cell aggregation mediated drug response.</a> Biomater Sci. 8 (7), 1855-1864 (2020).</li>
<li>Nakamura, R., Nakamura, F., Fukunaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+composition+of+the+extracellular+matrix+accumulated+by+mesenchymal+stem+cells+during+in+vitro+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Sci+J%22%5BJournal%5D)">Changes in the composition of the extracellular matrix accumulated by mesenchymal stem cells during in vitro expansion.</a> Anim Sci J. 85 (6), 706-713 (2014).</li>
<li>Bual, R. P., Ijima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+extracellular+matrix+component+promotes+maintenance+of+liver-specific+functions+and+larger+aggregates+formation+of+primary+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Intact extracellular matrix component promotes maintenance of liver-specific functions and larger aggregates formation of primary rat hepatocytes.</a> Regen Ther. 11, 258-268 (2019).</li>
<li>Jhala, D., Vasita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+extracellular+matrix+mimicking+strategies+for+an+artificial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Poly+Rev%22%5BJournal%5D)">A review on extracellular matrix mimicking strategies for an artificial stem cell niche.</a> Poly Rev. 55 (4), 561-595 (2015).</li>
<li>Jeong, W., Kim, M. K., Kang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+detergent+type+on+the+performance+of+liver+decellularized+extracellular+matrix-based+bio-inks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Effect of detergent type on the performance of liver decellularized extracellular matrix-based bio-inks.</a> J Tissue Eng. 12, 2041731421997091(2021).</li>
<li>Lee, S. J., Lee, J. H., Park, J., Kim, W. D., Park, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+3D+printing+scaffold+with+porcine+skin+decellularized+bio-ink+for+soft+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 3D printing scaffold with porcine skin decellularized bio-ink for soft tissue engineering.</a> Materials. 13 (16), 3522(2020).</li>
<li>Won, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+dermal+substitute+using+decellularized+dermis+extracellular+matrix+derived+bio-ink%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Cells+Nanomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A potential dermal substitute using decellularized dermis extracellular matrix derived bio-ink.</a> Artif Cells Nanomed Biotechnol. 47 (1), 644-649 (2019).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+decellularized+extracellular+matrix+hydrogel+microspheres+fabricated+using+a+temperature-controlling+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Bioactive decellularized extracellular matrix hydrogel microspheres fabricated using a temperature-controlling microfluidic system.</a> ACS Biomater Sci Eng. 8 (4), 1644-1655 (2022).</li>
<li>Kaushik, N., Kim, S., Suh, Y., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinvasive+extracellular+matrix+remodeling+for+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Proinvasive extracellular matrix remodeling for tumor progression.</a> Arch Pharm Res. 42 (1), 40-47 (2019).</li>
<li>Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+a+dynamic+niche+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression.</a> J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).</li>
<li>Poltavets, V., Kochetkova, M., Pitson, S. M., Samuel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+extracellular+matrix+and+its+molecular+and+cellular+regulators+in+cancer+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">The role of the extracellular matrix and its molecular and cellular regulators in cancer cell plasticity.</a> Front Oncol. 8, 431(2018).</li>
<li>Takeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+drug+screening+system+using+three-dimensional+cardiac+tissues+containing+multiple+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Development of a drug screening system using three-dimensional cardiac tissues containing multiple cell types.</a> Sci Rep. 11 (1), 5654(2021).</li>
<li>Jensen, A. R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific%2C+fibroblast-derived+matrix+as+a+tool+for+studying+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Organ-specific, fibroblast-derived matrix as a tool for studying breast cancer metastasis.</a> Cancers (Basel). 13 (13), 3331(2021).</li>
<li>Kuşoğlu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+decellularization+methods+in+bovine+lung+tissue+reveals+distinct+biochemical+composition%2C+stiffness%2C+and+viscoelasticity+in+reconstituted+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Bio+Mater%22%5BJournal%5D)">Different decellularization methods in bovine lung tissue reveals distinct biochemical composition, stiffness, and viscoelasticity in reconstituted hydrogels.</a> ACS Appl Bio Mater. 6 (2), 793-805 (2023).</li>
<li>Fernández-Pérez, J., Ahearne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+decellularization+methods+on+extracellular+matrix+derived+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels.</a> Sci Rep. 9 (1), 14933(2019).</li>
<li>Park, S., Kim, T. H., Kim, S. H., You, S., Jung, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+vascularized+lung+cancer-on-a-chip+with+lung+extracellular+matrix+hydrogels+for+in+vitro+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional vascularized lung cancer-on-a-chip with lung extracellular matrix hydrogels for in vitro screening.</a> Cancers (Basel). 13 (16), 3930(2021).</li>
<li>Uriarte, J. J., Uhl, F. E., Rolandsson Enes, S. E., Pouliot, R. A., Weiss, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+bioengineering%3A+advances+and+challenges+in+lung+decellularization+and+recellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Lung bioengineering: advances and challenges in lung decellularization and recellularization.</a> Curr Opin Organ Transplant. 23 (6), 673-678 (2018).</li>
<li>Roth, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+freeze-thaw+cycles+for+decellularization+of+tendon+tissue+-+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Automated freeze-thaw cycles for decellularization of tendon tissue - a pilot study.</a> BMC Biotechnol. 17 (1), 13(2017).</li>
<li>Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+DNA+in+biologic+scaffold+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification of DNA in biologic scaffold materials.</a> J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Cox, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+matrix+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The matrix in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).</li>
<li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+forces+direct+stem+cell+behaviour+in+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 728-742 (2017).</li>
<li>Chaudhuri, O., Cooper-White, J., Janmey, P. A., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+extracellular+matrix+viscoelasticity+on+cellular+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour.</a> Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).</li>
<li>Chaudhuri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+with+tunable+stress+relaxation+regulate+stem+cell+fate+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity.</a> Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).</li>
</ol>

Todos os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Os hidrogéis derivados de órgãos tornaram-se modelos promissores que recapitulam a MEC tecidual nativa e mimetizam a função celular organotípica. Embora a MEC pulmonar decelularizada tenha sido frequentemente usada em engenharia de tecidos, uma caracterização completa da composição do biomaterial e das propriedades mecânicas beneficiará uma melhor compreensão de como as interações célula-MEC podem ser moduladas para modelar processos biológicos durante a homeostase ou doença. Particularmente, a avaliação e o controle das...

As condições convencionais de cultivo de monocamadas não oferecem uma representação fiel dos microambientes de tecidos nativos e carecem da capacidade de fornecer um arcabouço tridimensional (3D) com ligantes instrutivos que possibilitem interações célula-matriz e célula-célula1. A composição da matriz extracelular (MEC) e as propriedades mecânicas são altamente tecido-específicas, tempo-dependentes e sofrem alterações em condições patológicas. Portanto, há necessidade de modelos teciduais 3D biomiméticos que permitam a sintonia de tais características, a modulação do comportamento celular e o alcance da funcionalidade tecidual desejada. Biomateriais nativos derivados da MEC chamam muita atenção na engenharia tecidual com a capacidade de usar diretamente a MEC tecido-específica 1,2,3,4,5. Os portadores baseados em MEC têm sido usados em muitas aplicações, desde a regeneração tecidual até o desenvolvimento de modelos de doenças. São utilizados como arcabouços de biomateriais injetáveis ou implantáveis 4,5, em aplicações de triagem de fármacos 6,7, no desenvolvimento de materiais indutores de crescimento celular 8,9,10, como biotintas 11,12,13, em microfluídica14 e em modelos de tecidos cancerígenos 15,16,17,18,19.
A descelularização de tecidos e órgãos é uma abordagem popular para gerar arcabouços que mimetizam a MEC tecido-específica. A reconstituição de tecidos e órgãos decelularizados em hidrogéis permite a incorporação de células em modelos de tecidos 3D biomiméticos20. As técnicas de descelularização concentram-se principalmente na eliminação de componentes celulares, mantendo a composição da MEC. Métodos físicos como ciclos de congelamento-descongelamento ou processos químicos como o tratamento com Triton-X-100 são comumente aplicados para descelularizar tecidos. Além disso, o tratamento com DNase é preferido para remover o DNA residual para minimizar as respostas imunológicas na inclusão celular. É fundamental obter a máxima remoção celular e o mínimo comprometimento da MEC para otimizar os procedimentos de descelularização21. Além desses aspectos, a caracterização das propriedades bioquímicas e mecânicas dos scaffolds reconstituídos, incluindo viscoelasticidade e rigidez, é crucial para o aprimoramento de modelos teciduais 3D projetados derivados de matrizes nativas20.
A MEC órgão-específica na engenharia do tecido pulmonar permite mimetizar o microambiente pulmonar para modelar processos de desenvolvimento, homeostáticos ou patológicos in vitro e testar terapêuticas em um ambiente fisiomimético 20,22,23. Estudos prévios demonstraram a decelularização do tecido pulmonar de várias espécies, como ratos, suínos e humanos, mas esses métodos ainda não foram adaptados para espécies menos utilizadas, como os bovinos. Uma melhor compreensão dos parâmetros do processo de descelularização e como eles afetam os arcabouços resultantes da MEC reconstituída em relação à composição bioquímica e propriedades mecânicas permitirá uma melhor sintonia desses aspectos e abrirá caminho para modelos teciduais mais confiáveis em saúde e doença. Neste estudo, a decelularização pulmonar bovina com dois métodos distintos, ciclos de congelamento-descongelamento e tratamento com Triton-X-100, é explicitamente descrita e seguida por análises bioquímicas e mecânicas de hidrogéis de MEC pulmonar decelularizada (dECM). Os resultados revelam que ambos os métodos produzem efetiva descelularização e retenção dos ligantes da MEC. Notavelmente, a escolha do método altera significativamente a rigidez e viscoelasticidade resultantes dos hidrogéis reconstituídos. Hidrogéis derivados da dECM bovina demonstram notáveis analogias bioquímicas com a matriz extracelular do pulmão humano e exibem características confiáveis de gelificação térmica20. Como descrito anteriormente, ambos os métodos são adequados para a cultura 3D de células de câncer de pulmão, células epiteliais brônquicas saudáveis e organoides pulmonares derivados do paciente20.

<table><tbody><tr><td>Etanol absoluto</td><td>ISOLAB</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>ISOLAB</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Solução de azul de alciano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8438</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease I de pâncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Discovery HR-2 reômetro</td><td>TA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem Entellan</td><td>Merck</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>Eosin solução</td><td>Bright-slide</td><td>2.BS01-105-1000</td><td></td></tr><tr>Ciências de <td>Microscopia Eletrônica</td><td>de Formaldeído</td><td>50-980-485</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Iodo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3002</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Solução de coloração de hematoxilina de Mayer</td><td>Merck</td><td>2.BS01-103-1000</td><td></td></tr><tr><td>Composto OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / estreptomicina</td><td>Biowest</td><td>L0018-100</td><td></td></tr><tr><td>Pepsina da mucosa gástrica suína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>Ácido pícrico</td><td>Polysciences</td><td>88-89-1</td><td></td></tr><tr><td>Sirius Red</td><td>Polysciences</td><td>09400-25</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Merck</td><td>112298</td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento e caracterização de hidrogéis de matriz extracelular pulmonar decelularizada

Development and Characterization of Decellularized Lung Extracellular Matrix Hydrogels

O uso de hidrogéis derivados da matriz extracelular (MEC) na engenharia de tecidos tem se tornado cada vez mais popular, pois podem mimetizar o ambiente natural das células in vitro. No entanto, manter o conteúdo bioquímico nativo da MEC, alcançar estabilidade mecânica e compreender o impacto do processo de decelularização nas propriedades mecânicas dos hidrogéis da MEC são um desafio. Neste trabalho, foi descrito um pipeline para a descelularização do tecido pulmonar bovino utilizando dois protocolos diferentes, caracterização a jusante da eficácia da descelularização, fabricação de hidrogéis de MEC pulmonar decelularizada reconstituídos e avaliação de suas propriedades mecânicas e citocompatibilidade. A descelularização do pulmão bovino foi realizada por método físico (ciclos de congelamento-descongelamento) ou químico (à base de detergente). A coloração de hematoxilina e eosina foi realizada para validar a decelularização e retenção dos principais componentes da MEC. Para a avaliação do conteúdo residual de colágeno e glicosaminoglicano sulfatado (sGAG) nas amostras decelularizadas, foram empregadas as técnicas de coloração Sirius red e Alcian blue, respectivamente. As propriedades mecânicas dos hidrogéis de MEC pulmonar decelularizado foram caracterizadas por reologia oscilatória. Os resultados sugerem que hidrogéis de pulmão bovino decelularizados podem fornecer uma alternativa organotípica<span style="font-size: 11pt; font-family: Calibri, sans-serif; color: black; background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;"> confiável aos produtos comerciais de MEC por reter a maioria dos componentes nativos da MEC. Além disso, esses achados revelam que o método de descelularização de escolha afeta significativamente a cinética de gelificação, bem como a rigidez e as propriedades viscoelásticas dos hidrogéis resultantes.

Descelularização A descelularização do tecido pulmonar bovino para produzir hidrogéis de dECM que recapitulariam o microambiente pulmonar nativo foi obtida por métodos físicos (congelamento-descongelamento) e químicos (Triton-X-100). Após dissecção, pedaços de tecido foram lavados em antibióticos contendo dH2O para remover patógenos que podem afetar posteriormente a esterilidade dos hidrogéis de dECM. Um total de cinco ciclos alternados entre nitrogênio líquido a 37 °C em banho-maria foi ap...

O protocolo elucida duas metodologias distintas de decelularização aplicadas a tecidos pulmonares bovinos nativos, fornecendo um relato abrangente de suas respectivas caracterizações.

Desenvolvimento e caracterização de hidrogéis de matriz extracelular pulmonar decelularizada

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural ...

development-characterization-decellularized-lung-extracellular-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nós desenvolvemos uma matriz extracelular e de pulmão decelularizado biorreator romance biomimético que pode ser usado para gerar tecido pulmonar funcional. Por semeadura de células na matriz e cultura no biorreator, geramos tecido que demonstra a troca gasosa eficaz quando transplantadas in vivo por curtos períodos de tempo.

Procedimento para a Engenharia de pulmão

Este vídeo descreve uma técnica de derivação de hidrogéis de matriz extracelular por descelularização de bolsas de gordura mamárias murinas após irradiação ex vivo para estudos in vitro. Este hidrogel ajuda a imitar o ambiente do tecido mamário in vivo após o tratamento com radiação para estudar o comportamento das células tumorais.

Descelularização de almofadas de gordura mamária: derivando hidrogéis de matriz extracelular de almofadas de gordura mamária

Este protocolo eficiente dirige rato estaminais embrionárias endoderme definitivo de células-derivadas para amadurecer as células epiteliais das vias respiratórias. Esta técnica utiliza a diferenciação 3-dimensionais andaimes pulmonares descelularizados para dirigir especificação das linhagens celulares de pulmão, em, uma configuração de cultura isento de soro definido.

Geração de células de camundongo Airway epiteliais derivados de ESC Usando descelularizado Lung Scaffolds

Este é um método para criar uma estrutura de suporte de cultura de células 3-dimensional a partir da matriz extracelular pulmonar. pulmão intacto é transformado em hidrogéis que podem suportar o crescimento das células em três dimensões.

Sintonizável hidrogéis a partir de Pulmonar Matriz Extracelular para Cultura Celular 3D

A matriz extracelular específico do tecido (ECM) é um mediador chave da função das células. Este artigo descreve métodos para a síntese de espumas e microtransportadores que são estáveis em cultura sem a necessidade de reticulação química para aplicações em 3D avançada em modelos de cultura celular in vitro ou como bioscaffolds pró-regenerativos derivado de ECM puros.

Fabricação de espumas de Matriz Extracelular derivados e Microcarregadores como cultura celular de tecidos específicos e plataformas de entrega

Este protocolo descreve a decellularization completa do miocárdio humano preservando seus componentes de matriz extracelular. Transformação dos resultados da matriz extracelular na produção de micropartículas e um hidrogel de auto-montagem de tilacoides.

Processamento do tecido cardíaco humano em direção a matriz extracelular auto montagem hidrogel para In Vitro e In Vivo de aplicações

Aqui nós apresentamos um protocolo para fabricar um rim córtex extracelulares matriz-derivado hidrogel para manter a composição de estruturais e bioquímicos de matriz extracelular (ECM) do rim nativo. O processo de fabricação e suas aplicações são descritas. Finalmente, uma perspectiva sobre como usar este hidrogel para apoiar a bioengenharia e a regeneração celular e tecido de rim-específicas é discutida.

Fabricando um rim córtex Extracellular Matrix-derivado hidrogel

Este protocolo apresenta um método para a decelularização e a formação subseqüente do hidrogel de almofadas gordas mamária murino que seguem a irradiação ex vivo.

Estudando efeitos de radiação tecidual normais usando Hydrogels de matriz extracelular

Este protocolo descreve um método para gerar tecidos pulmonares projetíveis, de pequena escala, repovoando fatias pulmonares descelularizadas cortadas com células epiteliais tipo 2 alveolares, fibroblastos e células endoteliais.

Tecidos pulmonares projetados preparados a partir de fatias pulmonares descelularizadas

Este trabalho apresenta um novo método para a síntese de hidrogéis de matriz extracelular de cartilagem decelularizada (DC-ECM). Os hidrogéis DC-ECM têm excelente biocompatibilidade e fornecem um microambiente superior para o crescimento celular. Portanto, podem ser arcabouços celulares ideais e sistemas de liberação biológica.

Síntese de Hidrogéis de Matriz Extracelular de Cartilagem Descelularizada

Apresenta-se um protocolo para o isolamento de tecido pulmonar decelularizado regional. Este protocolo fornece uma ferramenta poderosa para o estudo de complexidades na matriz extracelular e interações célula-matriz.

Dissecção e Isolamento de Tecido Pulmonar Descelularizado Regional-Específico

Aprenda a desenvolver hidrogéis de matriz extracelular pulmonar decelularizada usando tecido bovino. Este método otimizado permite criar modelos organotípicos com propriedades mecânicas estáveis para engenharia de tecidos pulmonares.

Desenvolvimento e caracterização de hidrogéis de matriz extracelular pulmonar decelularizada

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