Name: Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprenda a visualizar redes de microtúbulos em junções neuromusculares e células musculares de larvas de Drosophila melanogaster usando microscopia confocal. Este método avança pesquisas em neurodesenvolvimento e doenças neurológicas.

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Agradecemos ao Dr. Ying Xiong pelas discussões e comentários sobre o manuscrito. Este trabalho é apoiado por uma bolsa da National Science Foundation of China (NSFC) para C. M. (31500839).

1. Dissecção de larvas
OBS: A solução dissecante salina hemolinf-símile (HL3.1)18 e a solução fixadora paraformaldeído (PFA) a 4%19,20 são utilizadas à temperatura ambiente, pois os microtúbulos se despolimerizam quando a temperatura é muito baixa.
<ol><li>Escolha uma larva errante de3º ínstar com pinças longas e rombas. Lave-o com HL3.1 e coloque-o na placa de dissecção sob o estereomicroscópio. NOTA: Larva errante de3º ínstar é identificada por espiráculo anterior ramificado e rasteja ao redor do tubo a aproximadamente 96 h (25 °C)21.</li>
	<li>Posicione a larva com o lado dorsal ou ventral para cima. Identificar o lado dorsal pelas duas traqueias longas e o ventral pelas cintas denticulares abdominais.<ol><li>Dependendo do tecido a ser observado, opte pela dissecção dorsal ou ventral. Isso permitirá uma visão mais precisa e detalhada da área específica de interesse. Para observação do NMJ e das células musculares, abrir as regiões dorsal e ventral da larva, respectivamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixe os ganchos da boca e a cauda. Ajuste os pinos para manter a larva em um estado prolongado. Adicione uma gota de HL3.1 à larva para evitar que seque. NOTA: Ca2+ - HL livre 3.1 pode ser usado para minimizar a contração dos músculos durante a dissecção.</li>
	<li>Use a tesoura dissecante para fazer um pequeno corte transversal próximo à extremidade posterior, mas não corte a extremidade posterior. Em seguida, corte ao longo da linha média ventral em direção à extremidade anterior.</li>
	<li>Insira quatro pinos de insetos nos quatro cantos da larva. Reajuste os pinos do inseto de forma que a larva seja esticada ao máximo em todas as direções.</li>
	<li>Use a pinça para remover órgãos internos, sem danificar os músculos.</li>
</ol>2. Fixação
<ol><li>Adicionar 100 μL de PFA (4%) para imergir as carcaças por 40 min enquanto as carcaças ainda estão fixadas na placa dissecante. CUIDADO: Medidas de proteção eficazes são tomadas para evitar o contato direto com a pele ou inalação, pois o PFA é um perigo.</li>
	<li>Desmonte os pinos e transfira a amostra para um tubo de microcentrífuga de 2 mL. Enxaguar o PFA com 1x solução salina tamponada com fosfato contendo Triton X-100 a 0,2% (0,2% PBST) para encher 2 mL de tubo de microcentrífuga por 10 min no agitador descolorante a 15 rpm. Repita o processo de lavagem 5x.</li>
</ol>3. Imunocitoquímica
<ol><li>Imergir as carcaças em bloqueador (5% de soro caprino em 0,2% de PBST) e bloquear por 40 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova o agente bloqueador e substitua-o por 200 μL do anticorpo primário (por exemplo, anti-α-tubulina, 1:1000; anti-Futsch, 1:50) diluído com PBST a 0,2% a 4 °C durante a noite. Visualize os microtúbulos musculares por imunomarcação com anti-α-tubulina monoclonal. Anti-Futsch pode refletir indiretamente a morfologia dos microtúbulos na JNM.</li>
	<li>Após a incubação do anticorpo primário, lavar as larvas com PBST a 0,2% por 10 min.</li>
	<li>Incubar as larvas com 200 μL de anticorpo secundário (por exemplo, cabra anti-Mouse-488, 1:1000) diluído com 0,2% PBST à temperatura ambiente por 1,5 h no escuro.</li>
	<li>Em seguida, adicionar um corante nuclear como o iodeto TO-PRO(R) 3 (T3605) na concentração de 1:1000 no tubo de incubação por 30 min ao corar os microtúbulos no escuro20,22.</li>
	<li>Enxaguar o anticorpo secundário e o corante nuclear com PBST a 0,2% por 10 min. Repita 5x no escuro.</li>
</ol>4. Montagem
<ol><li>Colocar a carcaça da larva em PBST 0,2% sobre uma lâmina de vidro e ajustá-la sob o estereomicroscópio. Certifique-se de que a superfície interna da carcaça da larva esteja voltada para cima e que todas as carcaças das larvas estejam dispostas conforme desejado.</li>
	<li>Absorva o excesso de solução PBST com um lenço umedecido e adicione suavemente uma gota de meio de montagem antifade.</li>
	<li>Coloque uma lamínula na lâmina para cobrir as larvas dissecadas lenta e suavemente para evitar bolhas.</li>
	<li>Aplique o esmalte de unha ao redor da tampa. Coloque a lâmina no espaço escuro para reduzir a atenuação fluorescente.</li>
</ol>5. Aquisição de imagens
<ol><li>Para a aquisição das imagens, utilizar microscópio confocal de varredura a laser, selecionar a objetiva de imersão em óleo 60x (abertura numérica 1,42) ou similar e ajustar a potência e o comprimento de onda do laser com base no experimento.</li>
	<li>Para identificar o NMJ, captar imagens no músculo 4 no segmento A3 (como mostra a localização na Figura 1F). Selecione um laser de 488 nm para ativar a α-tubulina ou Futsch e 543 nm para ativar a trilha de imagem HRP. Ajuste os parâmetros para um tamanho de quadro de 800 pixels x 800 pixels, um zoom digital de 2,0 e um intervalo de imagem de 0,8 μm em NMJs (Figura 2).</li>
	<li>Para identificar os microtúbulos no músculo, capture imagens do músculo 2 no segmento A3-A5 (como mostrado no local na Figura 1G) por apresentar menor número de ramos traqueais. Escolha um laser de 488 nm para ativar a α-tubulina e um laser de 635 nm para ativar a trilha de imagem T3605. Ajuste os parâmetros para um tamanho de quadro de 1024 pixels x 1024 pixels, um zoom digital de 3,0 e um intervalo de imagem de 0,4 μm nas células musculares (Figura 3).</li>
</ol>

Visualização de redes de microtúbulos em junções neuromusculares e células musculares de Drosophila

<ol><li>Halpain, S., Dehmelt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAP1+family+of+microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">The MAP1 family of microtubule-associated proteins.</a> Genome biology. 7 (6), 224(2006).</li>
<li>Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+microtubule-associated+protein+2+%28MAP2%29+and+its+relevance+for+the+regulation+of+the+neuronal+cytoskeleton+function%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function.</a> Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).</li>
<li>Dehmelt, L., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAP2%2FTau+family+of+microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins.</a> Genome biology. 6 (1), 204(2005).</li>
<li>Roll-Mecak, A., McNally, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-severing+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule-severing enzymes.</a> Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).</li>
<li>Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-depolymerizing+kinesins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule-depolymerizing kinesins.</a> Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).</li>
<li>Bramblett, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+tau+phosphorylation+at+Ser396+in+Alzheimer%27s+disease+recapitulates+development+and+contributes+to+reduced+microtubule+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding.</a> Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).</li>
<li>Van Vactor, D., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+morphogenesis%2C+active+zone+organization+and+structural+plasticity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila.</a> Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).</li>
<li>Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Futsch%2F22C10+is+a+MAP1B-like+protein+required+for+dendritic+and+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development.</a> Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).</li>
<li>Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Futsch+regulates+synaptic+microtubule+organization+and+is+necessary+for+synaptic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth.</a> Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).</li>
<li>Packard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Wnt%2C+wingless%2C+provides+an+essential+signal+for+pre-+and+postsynaptic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation.</a> Cell. 111 (3), 319-330 (2002).</li>
<li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).</li>
<li>Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+behavior+in+the+growth+cones+of+living+neurons+during+axon+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation.</a> The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).</li>
<li>Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+katanin+in+severing+microtubules+in+the+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron.</a> The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).</li>
<li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fidgetin+regulates+cultured+astrocyte+migration+by+severing+tyrosinated+microtubules+at+the+leading+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge.</a> Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).</li>
<li>Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+Tau+and+taxol+on+polymerization+of+MCF7+microtubules+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro.</a> International journal of molecular sciences. 23 (2), 677(2022).</li>
<li>Velasco, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+depolymerization+contributes+to+spontaneous+neurotransmitter+release+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro.</a> Communications biology. 6 (1), 488(2023).</li>
<li>Höög, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+reveals+a+flared+morphology+on+growing+microtubule+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends.</a> Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
<li>Broadie, K. S., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+embryonic+neuromuscular+synapse+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).</li>
<li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+mutations+rescue+human+tau-induced+microtubule+defects+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Mao, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-severing+protein+Katanin+regulates+neuromuscular+junction+development+and+dendritic+elaboration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila.</a> Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).</li>
<li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Tubulin-specific+chaperone+E+functions+at+neuromuscular+synapses+and+is+required+for+microtubule+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation.</a> Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).</li>
<li>Sarthi, J., Elefant, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dTip60+HAT+activity+controls+synaptic+bouton+expansion+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction.</a> PloS one. 6 (10), 26202(2011).</li>
<li>Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+factor+essential+for+microtubule+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A protein factor essential for microtubule assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).</li>
<li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li>
<li>Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hereditary+spastic+paraplegia+gene%2C+spastin%2C+regulates+microtubule+stability+to+modulate+synaptic+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function.</a> Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui é descrito um protocolo para a dissecção e imunomarcação de larvas de Drosophila , junções neuromusculares e células musculares. Há vários pontos essenciais a serem considerados. Em primeiro lugar, evitar a lesão dos músculos observados é crucial durante o processo de dissecção. Pode valer a pena fixar o filé antes de retirar os órgãos internos para evitar o contato direto entre a pinça e os músculos. Para evitar danos musculares ou separação da epiderme larval, é importante garantir que a velocidade do agi...

Os microtúbulos (MTs), como um dos componentes estruturais do citoesqueleto, desempenham um papel importante em diversos processos biológicos, incluindo divisão celular, crescimento e motilidade celular, transporte intracelular e manutenção da forma celular. A dinâmica e a função dos microtúbulos são moduladas por interações com outras proteínas, como MAP1, MAP2, Tau, Katanin e Kinesin 1,2,3,4,5.
Nos neurônios, os microtúbulos são essenciais para o desenvolvimento e manutenção de axônios e dendritos. Anormalidades nos microtúbulos levam à disfunção e até mesmo à morte dos neurônios. Por exemplo, no cérebro de pacientes com Alzheimer, a hiperfosforilação da proteína Tau reduz a estabilidade da rede de microtúbulos, causando irregularidades neurológicas6. Assim, o exame das redes de microtúbulos contribuirá para a compreensão do neurodesenvolvimento e da patogênese das doenças neurológicas.
A junção neuromuscular (JNM) é a sinapse periférica formada entre um axônio terminal do neurônio motor e uma fibra muscular, que é um excelente e poderoso sistema modelo para o estudo da estrutura e funçõessinápticas7. Futsch é uma proteína de Drosophila homóloga à proteína de ligação a microtúbulos MAP1B encontrada em mamíferos8. É expressa apenas em neurônios e desempenha um papel no desenvolvimento dos botões sinápticos do NMJ 8,9. No tipo selvagem, feixes filamentosos que correm ao longo do centro dos processos NMJ são visualizados por imunomarcação com anti-Futsch. Ao atingir o final do NMJ, esse feixe tem a capacidade de formar uma alça constituída por microtúbulos ou de perder sua estrutura filamentosa, resultando em uma aparência difusa e puntiforme10. Alças de microtúbulos estão associadas a cones de crescimento pausados, o que sugere que a matriz de microtúbulos é estável11. Portanto, podemos determinar indiretamente o desenvolvimento de microtúbulos estáveis no NMJ pela coloração de Futsch. O grande tamanho das células musculares na larva de Drosophila permite uma visualização clara da rede de microtúbulos. Os fatores que afetam a estabilidade da rede de microtúbulos podem ser encontrados através da análise da densidade e forma dos microtúbulos. Simultaneamente, o estado da rede de microtúbulos das células musculares pode ser verificado de forma cruzada com o resultado do NMJ para obter conclusões mais abrangentes.
Muitos protocolos têm sido empregados para investigar a rede e a dinâmica dos microtúbulos. No entanto, essas pesquisas têm frequentemente se concentrado em estudos in vitro 12,13,14,15,16. Alternativamente, alguns experimentos in vivo têm empregado microscopia eletrônica para detectar o citoesqueleto17. De acordo com a ligação específica de anticorpos fluorescentemente marcados ou corantes químicos a proteínas ou DNA, os métodos aqui apresentados permitem a detecção de redes de microtúbulos em NMJ em nível de neurônios individuais in vivo, com resultados corroborados por observações em células musculares. Este protocolo é simples, estável e repetível quando combinado com as poderosas ferramentas genéticas disponíveis em Drosophila melanogaster, permitindo uma gama diversificada de exames fenotípicos e rastreios genéticos para o papel de proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso in vivo.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor Plus 405 faloidina</td><td>invitrogen</td><td>A30104</td><td>diluído 1:200</td></tr><tr><td>Enhanced Antifade Mounting Medium</td><td>Beyotime</td><td>P0128M</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW microscópio confocal</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse, Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11001</td><td>diluído 1:1,000</td></tr><tr><td>Microscópio confocal a laser LSM 710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Tesoura</td><td>66vision</td><td>54138B</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Futsch para camundongos</td><td>Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridomas&nbsp; &nbsp;</td><td>22C10</td><td>diluem o</td></tr><tr>anticorpo <td>Sigma</td><td>T5168</td> do<td>anti-alfa;-tubulina do rato do rato</td> do 1<td>:1,000 diluem o 1:1,000</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Wako</td><td>168-20955</td><td>Concentração final: 4% no amortecedor do PB</td></tr><tr><td>Pinos de aço inoxidável Minutien Pins</td><td>Entomoravia</td><td></td><td>0.1mm Diam</td></tr><tr><td>Stereomicroscope SMZ161</td><td>Fluorescência</td> estereoscópica Motic <td></td><td></td></tr><tr><td> microscópio BX41</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-conjugado para cabra anti-HRP</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>diluir 1:100</td></tr><tr><td>TO-PRO(R) 3 iodeto</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>diluir 1:1,000</td></tr><tr><td>Transferência descolorante TS-8</td><td>Kylin-Bell instrumentos de laboratório</td><td>E0018</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>BioFroxx</td><td>1139</td><td></td></tr><tr><td>Pinças&nbsp;</td><td>Dumont</td><td>500342</td><td></td></tr></tbody></table>

usando a junção neuromuscular de larvas de drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

A rede de microtúbulos é um componente essencial do sistema nervoso. Mutações em muitas proteínas reguladoras dos microtúbulos estão associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento e doenças neurológicas, tais como proteína Tau associada a microtúbulos a doenças neurodegenerativas, proteína cortadora de microtúbulos Spastin e Katanin 60 causam paraplegia espástica hereditária e anormalidades do neurodesenvolvimento, respectivamente. A detecção de redes de microtúbulos em neurônios é vantajosa para elucidar a patogênese de distúrbios neurológicos. No entanto, o pequeno tamanho dos neurônios e o arranjo denso dos feixes axonais de microtúbulos tornam a visualização das redes de microtúbulos um desafio. Neste estudo, descrevemos um método para dissecção da junção neuromuscular larval e células musculares, bem como imunomarcação de α-tubulina e proteína associada a microtúbulos Futsch para visualização de redes de microtúbulos em Drosophila melanogaster. A junção neuromuscular permite observar microtúbulos pré e pós-sinápticos, e o grande tamanho das células musculares na larva de Drosophila permite uma clara visualização da rede de microtúbulos. Aqui, ao mutar e superexpressar Katanin 60 em Drosophila melanogaster, e então examinar as redes de microtúbulos na junção neuromuscular e células musculares, revelamos com precisão o papel regulatório de Katanin 60 no neurodesenvolvimento. Portanto, combinado com as poderosas ferramentas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita muito a triagem genética e a análise da dinâmica de microtúbulos para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso.

Demonstramos um procedimento passo a passo para visualizar a rede de microtúbulos nas junções neuromusculares (NMJs) e nas células musculares. Após a dissecção de acordo com o diagrama esquemático (Figura 1A-E), a imunomarcação é realizada e, posteriormente, as imagens são observadas e coletadas em microscópio confocal a laser ou microscópio de fluorescência estereoscópica (Figura 1F,G).
A organização...

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para visualizar as redes de microtúbulos nas junções neuromusculares e células musculares. Combinado com as poderosas ferramentas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita muito a triagem genética e a análise da dinâmica de microtúbulos para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso.

Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with ...

Atualmente, a dinâmica dos microtúbulos é observada indiretamente através de proteínas ligadoras de microtúbulos, como a EB1. Como os heterodímeros da alfabética tubulina são abundantes no citoplasma, dobram-se diretamente, os heterodímeros tubulínicos vizinhos não possuem a dinâmica das redes de microtúbulos in vivo. Nosso protocolo visualiza microtúbulos em sinapses neuromusculares e células musculares.Quando combinado com as poderosas ferramentas genéticas disponíveis em Drosophila melanogaster, possibilitando uma gama diversificada de exames fenotípicos e a triagem genética para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso in vivo. Nossa pesquisa enfoca a relação entre o citoesqueleto e o neurodesenvolvimento, bem como suas implicações para doenças neurológicas. Esperamos descobrir o mecanismo do neurodesenvolvimento e a partenogênese para doenças neurológicas, destacando o efeito das proteínas reguladoras do citoesqueleto sobre os neurônios.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Drosophila larval Dissection MNJ

Este protocolo demonstra como executar imunohistoquímica em dissecados larva Drosophila.

Drosophila larval MNJ Imunohistoquímica

Aqui nós descrevemos métodos eletrofisiológicos para medir a transmissão sináptica na junção neuromuscular de larva Drosophila. Liberação evocada é iniciado artificialmente estimulando os axônios do neurônio motor ea transmissão através do MNJ pode ser medida pela resposta pós-sináptica evocado no músculo.

Métodos eletrofisiológicos de gravação Potenciais Synaptic do MNJ de larvas de Drosophila

Descrevemos as características estruturais das sinapses Glia-neuromuscular em um romance de preparação dos tecidos dentro para fora-de larvas de moscas ao vivo usando corantes fluorescentes com microscopia confocal. Nós rotulados terminais de neurônios fluorescentes viver com anticorpos primários para HRP, e também visualizar o espaço perisynaptic com Dextranos fluorescente.

Visualizando o Live Drosophila Junção neuromuscular-Glial com corantes fluorescentes

Este protocolo descreve um método confiável para anestesiados e de imagem de...

Na imagem in vivo de larvas Drosophila Intact no Sub-celular Resolução

Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

Para compreender como as formas de células complexas, como dendritos neuronais, são alcançados durante o desenvolvimento, é importante ser capaz de precisão organização de microtúbulos ensaio. Aqui nós descrevemos um método imuno etiquetagem robusta para analisar a organização dos microtúbulos dos dendritos arborização dendrítica neurônio sensorial, traquéia, músculos e...

Labeling imuno dos microtúbulos no Dendrites neurônio sensorial, traquéias, e Músculos no Drosophila Wall Corpo Larva

A junção neuromuscular da Drosophila (NMJ) é usada como modelo para estudar a morfologia e a função das sinapses. Este vídeo descreve características importantes que os pesquisadores quantificam para caracterizar o NMJ. O protocolo de exemplo demonstra um software capaz de realizar a quantificação automaticamente.

drosófila Quantificação da Junção Neuromuscular (NMJ): Um Método para Avaliar a Morfologia e Função Sináptica

Aqui ilustramos como microscopia de foto-ativado localização única molécula pode ser realizada no terminal nervoso motor de um vivo Drosophila melanogaster terceiro estádio de larva.

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

Este relatório fornece um novo procedimento de preparação de amostras para visualizar junções neuromusculares em larvas de Drosophila . Este método é mais eficaz na prevenção do enrolamento das amostras em comparação com o método tradicional e é particularmente útil para a análise ultraestrutural da junção neuromuscular de Drosophila .

Otimizando o processo de preparação de amostras para microscopia eletrônica de transmissão de junções neuromusculares em larvas de Drosophila

Aprenda a visualizar redes de microtúbulos em junções neuromusculares e células musculares de larvas de Drosophila melanogaster usando microscopia confocal. Este método avança pesquisas em neurodesenvolvimento e doenças neurológicas.

Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

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